キアゲンミニプレップキットを用いて細菌のコロニーからプラスミドDNAを精製

私はカリフォルニア大学アーバイン校、生理学・生物物理学部、Mike Halenの研究室に所属しています。本日は、細菌からDNAを精製するためにCollagen mini fabricateを使用する方法を説明します。これは部位特異的突然変異導入実験の一ステップとして行います。

プラスミドを入手した後、インサートをシーケンシングし、選択したクローンに目的の変異が含まれているかを確認します。ミニプレップを行う前に、昨日行った操作について簡単に説明します。細菌を培養するために、まず個々のチューブに5 mLのLB培地を分注し、接種します。

ご覧のように、チューブに細菌を入れる前の培地は透明です。次に、ピペットを使用してエアプレートから単一コロニーを接種します。その際、コンタミネーションを防ぐため、毎回チップを交換します。その後、チューブをシェーカーに入れ、300 RPMで少なくとも8時間、通常は一晩培養します。

コラーゲンミニ調製キットには、3つの重要なバッファーがあります。P1、P2、およびN3です。通常、P1はRNAが含まれているため4 °Cで保存します。P2は室温で保存し、N3については、実験の8時間前に準備します。

ご覧のように、内部で細菌が増殖しているため、培地が濁っています。この培地を5 µL、別のプレートに播種します。これにより、クローンを確認した後、直接細菌に戻ることができるため、再度形質転換を行う必要がありません。培地を遠心分離すると、チューブの底にきれいな細菌ペレットが確認できます。環境汚染を防ぐため、上清は漂白剤の中に廃棄しますが、ペレットはそのまま残ります。

次に、バッファーP1を細菌のペレットに加えます。P1は細菌を再懸濁するための再懸濁バッファーです。ピペットで溶液を吸い上げと排出を繰り返して、細菌とバッファーを混合します。

この段階では、溶液中に細菌の塊が見えないようにしてください。次に、再懸濁した細菌を新しいエッペンドルフチューブに移します。どの溶液がどのクローン由来であるか判別できるよう、チューブには必ずラベルを貼っています。

次に、各チューブにバッファーP2を添加します。バッファーP2は細菌を溶解させるための溶解バッファーです。バッファーP2を添加した後、溶液はまだ濁っていることがわかります。ここで、溶液が十分に混ざるように、すべてのチューブを数回反転させます。

溶液が透明になったことがわかります。ここで、各チューブに中和緩衝液である緩衝液N3を加えます。緩衝液N3を加えるとすぐにタンパク質の沈殿が見られますが、溶液を十分に混ぜ合わせるために、このまま数回転倒混和します。

溶液を十分に混合します。バッファーと3番を添加した後は、このように見えるはずです。次に、遠心分離機を使用して、10分間遠心分離を行い、タンパク質沈殿物を回収します。Cal VAC 6 sを組み立てました。

すべての部品を順番に組み立て、真空システムに接続します。次に、キャリブレーション準備補助具（cal prep aid）となるストラップをマニホールドに取り付けます。本日は1つのみ行うため、他のスロットは塞ぎます。

十分な真空状態が得られました。ご覧のように、チューブに合わせてストラップにラベルを貼っており、真空ポンプを起動すると良好な真空状態になります。チューブを遠心分離した後、底部にタンパク質のペレットが確認でき、DNAは上清に溶解しているはずです。

次に、DNAを含む上清をカウプレップストリップに転移させます。ここで、クロスコンタミネーションを防ぐために、常にチップを交換する必要があることに触れておきます。ここで真空ポンプをオンにします。次に真空ポンプをオフにし、フィルター内にDNAが含まれているストリップを洗浄するためにバッファーPBを加えます。

次に、洗浄のために溶液PBをストリップに添加します。このとき、フィルター内にはまだDNAが含まれています。ストリップに触れないのであれば、チップを交換する必要はありません。続いて、バッファーPBと同様の手順で、バッファーPをストリップに添加します。

真空ポンプをオンにした後、この操作を2回行います。ご覧の通り、現在 P溶液がストリップを通過しています。フィルターが十分に乾燥するように、さらに5分間真空状態を維持します。5分間の吸引後、ボックスからストリップを取り出し、キムワイプで包みます。テーブルに軽く叩きつけ、残留している Pバッファーを除去します。

Pバッファーの液滴がほとんどないことがわかります。DNAはまだフィルター内に留まっているはずです。こちらが回収用マイクロチューブです。ストリップに合わせてラベルを貼りました。

次に、カーバックを開き、回収用マイクロチューブを用いて再組み立てを行い、ストラップがマイクロチューブと一致していることを確認します。現在のマニホールドはこのようになっているはずです。こちらが、ストリップからマイクロチューブへDNAを溶出させる準備が整ったバキュームマニホールドの外観です。

ストリップを上に、その直下に同じラベルを貼ったチューブを配置します。次に、真空引きせずにストリップに滅菌水を加え、1分間放置します。今回のように時間をかけて真空引きを行うと、ご覧の通り、水がストリップを通過して回収用マイクロチューブに入ります。

水の中にDNAが含まれています。また、すべての水が回収されることを確実にするため、真空状態をしばらく維持します。こちらが、この工程後のDNA溶液が入った回収用マイクロチューブです。

こんにちは。ここでは、カルシウムミニプレップキットを用いて細菌からDNAを精製する方法について説明しました。次に、正しいクローンであることを確認するためにインサートのシーケンシングを行います。この手法を用いるべきである点に触れておきます。得られるDNAの量は、通常マイクログラムレベルになります。

それでは、皆様の実験が成功することを願っております。ご視聴ありがとうございました。