Name: キアゲンミニプレップキットを用いて細菌のコロニーからプラスミドDNAを精製 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-07-29T00:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 24 s
Description: 学ぶ 細菌コロニーからのプラスミドDNA精製法。キアゲンミニプレップキットを用いてサイト特異的変異導入実験の一環としてDNAを精製し、シーケンスで変異を確認する手法を解説します。

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キアゲンミニプレップキットを用いて細菌のコロニーからプラスミドdnaを精製

Purifying Plasmid DNA from Bacterial Colonies Using the Qiagen Miniprep Kit

大腸菌からのプラスミドDNAの精製は、分子クローニングのためのコア技術です。細菌培養の100分の5以下mlの小規模の精製（ミニプレップ）は、さらに酵素反応（ポリメラーゼ連鎖反応および制限酵素消化）に続くクローンの検証またはDNAの分離のための手っ取り早い方法です。ここで、我々は分子生物学的手法の一般的な初心者にはこの非常に効率的な手法を導入することを目指し、QIAGENのQIAprep 8ミニプレップキットを介してミニプレップの一般的な手順をビデオ記録した。全体の手順は、高い塩の存在下でシリカにDNAの吸着に続いて大腸菌細胞のアルカリ溶解に基づいています。 1）QIAprep膜、3）洗浄し、プラスミドDNAの溶出にDNAの吸着細菌溶解物、2）の準備とクリア：それは3つのステップで構成されています。すべてのステップは、フェノール、クロロホルム、塩化セシウム、臭化エチジウムを使用せずに行われ、アルコール沈殿せずにされています。それは通常、この手順全体を完了するために2時間未満かかります。

キアゲンミニプレップキットを用いて細菌のコロニーからプラスミドDNAを精製

大腸菌（E. coli）からのプラスミドDNA精製は、分子クローニングにおける基幹技術である。5 ml未満の細菌培養液から行う小規模精製（ミニプレップ）は……

私はカリフォルニア大学アーバイン校、生理学・生物物理学部、Mike Halenの研究室に所属しています。本日は、細菌からDNAを精製するためにCollagen mini fabricateを使用する方法を説明します。これは部位特異的突然変異導入実験の一ステップとして行います。プラスミドを入手した後、インサートをシーケンシングし、選択したクローンに目的の変異が含まれているかを確認します。ミニプレップを行う前に、昨日行った操作について簡単に説明します。細菌を培養するために、まず個々のチューブに5 mLのLB培地を分注し、接種します。ご覧のように、チューブに細菌を入れる前の培地は透明です。次に、ピペットを使用してエアプレートから単一コロニーを接種します。その際、コンタミネーションを防ぐため、毎回チップを交換します。その後、チューブをシェーカーに入れ、300 RPMで少なくとも8時間、通常は一晩培養します。コラーゲンミニ調製キットには、3つの重要なバッファーがあります。P1、P2、およびN3です。通常、P1はRNAが含まれているため4 °Cで保存します。P2は室温で保存し、N3については、実験の8時間前に準備します。ご覧のように、内部で細菌が増殖しているため、培地が濁っています。この培地を5 µL、別のプレートに播種します。これにより、クローンを確認した後、直接細菌に戻ることができるため、再度形質転換を行う必要がありません。培地を遠心分離すると、チューブの底にきれいな細菌ペレットが確認できます。環境汚染を防ぐため、上清は漂白剤の中に廃棄しますが、ペレットはそのまま残ります。次に、バッファーP1を細菌のペレットに加えます。P1は細菌を再懸濁するための再懸濁バッファーです。ピペットで溶液を吸い上げと排出を繰り返して、細菌とバッファーを混合します。この段階では、溶液中に細菌の塊が見えないようにしてください。次に、再懸濁した細菌を新しいエッペンドルフチューブに移します。どの溶液がどのクローン由来であるか判別できるよう、チューブには必ずラベルを貼っています。次に、各チューブにバッファーP2を添加します。バッファーP2は細菌を溶解させるための溶解バッファーです。バッファーP2を添加した後、溶液はまだ濁っていることがわかります。ここで、溶液が十分に混ざるように、すべてのチューブを数回反転させます。溶液が透明になったことがわかります。ここで、各チューブに中和緩衝液である緩衝液N3を加えます。緩衝液N3を加えるとすぐにタンパク質の沈殿が見られますが、溶液を十分に混ぜ合わせるために、このまま数回転倒混和します。溶液を十分に混合します。バッファーと3番を添加した後は、このように見えるはずです。次に、遠心分離機を使用して、10分間遠心分離を行い、タンパク質沈殿物を回収します。Cal VAC

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このプロトコルは、より効率的な並列明確化し、プラスミドDNA精製のための費用対効果の高い代替手段です...

原核生物培養液からプラスミドDNAの合理化精製

我々は、一次T細胞を用いたクロマチン免疫沈降のための堅牢な方法が記載されている。メソッドは、標準的なアプローチの上に成り立ったが、細胞の数量限定のために効率を改善条件や試薬の特定のセットを使用しています。重要なことは、データ分析段階の詳細な説明が提示される。...

バイオマスの制限額を使用して効率的なクロマチン免疫沈降

環境家禽生産サンプルで使用するための新しい半自動ハイブリッドDNA抽出法が開発され、全細菌群集の量的および質的推定値に関して、一般的な機械的および酵素的抽出方法よりも改善が実証されました。...

家禽生産のサンプルからの細菌群集の定性的および定量的評価のためのハイブリッドDNA抽出法

リニア共有結合閉(LCC)DNAミニベクター(DNA ministring)は、高いトランスフェクション効率を提供する非ウイルス性遺伝子導入ベクターであり、あらゆるDNAデリバリーアプリケーションに関連しています。生産システムは、in...

二本鎖DNA Ministringsの生産

この論文は、染色体外環状DNA（eccDNA）を精製するためのCircle-Seqと呼ばれる高感度な方法を紹介しています。この方法には、カラム精製、残存する直鎖状染色体DNAの除去、ローリングサークル増幅、ハイスループットシーケンシングが含まれます。Circle-Seqは、真核生物のeccDNAのゲノムスケールのスクリーニングや、ゲノムの不安定性やコピー数多型の研究に応用できます。...

真核細胞から体外の環状DNAのゲノムワイドな精製

ここでは、同義語DNA配列への制限酵素部位の挿入および機能的プラスミド回収に基づくプロトコルであるプラスミド回収および制限酵素部位挿入（CAPRRESI）によるキメラアセンブリを提示する。このプロトコールは、タンパク質コード遺伝子を融合するための迅速かつ低コストの方法である。...

CAPRRESI：プラスミド回収および制限酵素部位挿入によるキメラアセンブリ

このプロトコルは、音響液滴排出技術を用いて384ウェルプレートにおける哺乳動物細胞のハイスループットプラスミドトランスフェクションについて説明する。時間がかかり、エラーが起こりやすいDNA分配と多重化だけでなく、トランスフェクション試薬の分配は、ソフトウェア駆動型であり、ナノディスペンサーデバイスによって実行されます。細胞は、次いで、これらの予め充填された井戸に播種されます。...

音響ナノディスペンス技術を用いたハイスループットDNAプラスミド多重化とトランスフェクション

ここでは、 Limosilactobacillus reuteri DSM20016を使用するためのプロトコル、増殖、プラスミド形質転換、コロニーPCR、蛍光レポータータンパク質測定、および限定的なプラスミドミニプレップ、および一般的な問題とトラブルシューティングについて詳しく説明します。これらのプロトコルにより、DSM20016中のレポータータンパク質の測定、またはレポーターが関与しない場合はコロニーPCR による 確認が可能になります。...

リ モシラクトバチルス・ロイテリ におけるエレクトロポレーションと形質転換確認の方法 DSM20016

組換えアデノ随伴ウイルス(rAAV)は、臨床および前臨床の遺伝子導入に広く使用されています。rAAVの用途としてはあまり評価されていませんが、精製を必要とせずに培養細胞を強力に形質導入できることです。rAAVに不慣れな研究者向けに、導入遺伝子カセットクローニング、粗ベクター産生、細胞培養形質導入のプロトコルを提供しています。...

未精製組換えアデノ随伴ウイルスベクターを用いた培養細胞における導入遺伝子発現

本研究では、染色体配列が既に知られている場合や興味がない場合のプラスミドのナノ孔シーケンシングのワークフローを記述しています。初期のプラスミドDNA濃縮ステップは、最適なプラスミド配列深度を確保し、フローセルあたりのシーケンス可能なサンプル数を最大化します。...

ナノ孔シーケンシングを用いたロングリードプラズミドシーケンシングおよびアセンブリ ワークフロー

学ぶ 細菌コロニーからのプラスミドDNA精製法。キアゲンミニプレップキットを用いてサイト特異的変異導入実験の一環としてDNAを精製し、シーケンスで変異を確認する手法を解説します。

キアゲンミニプレップキットを用いて細菌のコロニーからプラスミドDNAを精製

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