免疫細胞化学によるジカウイルスdsRNA複製中間体の検出

一本鎖RNAウイルスであるジカウイルスに感染させた上皮細胞を含むマルチウェルプレートから開始します。

感染中、ウイルスは二本鎖RNA（dsRNA）中間体を形成するRNAを放出します。

これらのdsRNA中間体を検出するために、培地をメタノールに置換して細胞を透過処理し、細胞の完全性を維持します。

メタノールを除去し、バッファーで洗浄する。

抗体の非特異的な結合を防ぐために、ブロッキング溶液を加えます。

ウイルスdsRNA特異的な一次抗体を添加します。

一次抗体がウイルスdsRNAに結合するように、低温で緩やかに揺らしながらインキュベートします。

バッファーで洗浄し、赤色蛍光色素標識二次抗体を添加してインキュベートする。

二次抗体が一次抗体に結合します。

緩衝液で洗浄し、次いで蛍光DNA結合染料を加えて核を染色します。

蛍光顕微鏡下で観察し、感染細胞内のラベル化されたウイルスdsRNA中間体を可視化します。

免疫細胞化学染色では、12ウェルプレートの各ウェルから培地を除去し、1 mlのメタノールを各ウェルに加えます。4 °Cで30分間静置し、細胞を固定します。次に、固定した細胞を1x PBSで3回洗浄します。その後、ブロッキングバッファーを加え、室温で1時間インキュベートします。マウスモノクローナル抗二本鎖RNA抗体J2をブロッキングバッファーで1:100に希釈して細胞に加え、この溶液中で4 °Cにて一晩インキュベートします。翌日、ヤギ抗マウスIgG-594二次抗体をブロッキングバッファーで1:1,000に希釈し、細胞を1x PBSで洗浄した後、これを細胞に加え、室温で1時間インキュベートします。細胞を1x PBSで洗浄した後、Hoechst染料を用いて核を染色し、蛍光顕微鏡を用いて100倍の倍率で細胞を観察します。