ウイルスプラークアッセイ用液体オーバーレイシステムの評価

上皮細胞の単層を含むマルチウェルプレートを用意し、各ウェルにウイルス懸濁液を加えます。

ウイルスを均一に分散させるため、時々揺らしながらインキュベートします。これにより、ウイルスが細胞に吸着し、内部に侵入します。

1つのウェルに溶融アガロースを加え、半凝固状態のオーバーレイとして凝固させます。

別のウェルに、微結晶セルロースベースの粘性液体オーバーレイを加え、インキュベートします。その粘性により、半固形オーバーレイと同様にウイルスの拡散が制限されます。

細胞内でウイルスはゲノムを放出し、新しいウイルスRNAおよびタンパク質を産生します。

新たなウイルスが構築され、細胞外へ放出されて細胞溶解を引き起こします。

放出されたウイルスが近接する細胞に感染し、プラークを形成します。

液体オーバーレイを吸引し、溶菌していない細胞を保存するために固定液を加えます。

固定液を廃棄し、アガロースオーバーレイを除去します。

生存細胞を染色し、プラークを未染色のままにする染色剤を加えます。その後、余分な染色剤を洗い流します。

液体オーバーレイは、半凝固性オーバーレイと同等のプラーク数を形成することから、プラークアッセイにおける代替手段としての有用性が支持されます。

播種翌日に、アッセイを開始する前に倒立顕微鏡を用いて細胞のコンフルエンシーと生存率を確認します。細胞が標準的な細胞形態を示し、コンフルエンシーがおよそ 90% であることを確認してください。

感染試料を細胞増殖培地を用いて10倍段階希釈し、対象とするウイルスの予想力価に応じて希釈回数を調整する。また、細胞の生存率を個別に確認し、プラークの同定を容易にするため、非感染コントロールサンプルを準備する。非感染コントロールおよび段階希釈試料を、単層を乱さないように注意しながらプレートのウェルにピペットで分注する。

単層細胞とウイルスの接触を最大化するため、液量を可能な限り低く抑えつつ、細胞全体を覆うのに十分な量の接種液を使用します。プレートを組織培養インキュベーターに入れ、45分から1時間の間、細胞を感染させます。20分ごとにプレートを静かに揺らし、均一に液が行き渡るようにし、細胞単層の乾燥を防ぎます。

感染操作の間に、液体オーバーレイ用の作業溶液を調製します。温めたプラーク培地と室温の1.2から2.4% Stock Avicelを1:1の比率で混合し、0.6から1.2%のAvicelオーバーレイ培地の作業溶液を作成します。アガロースまたはCMCオーバーレイの場合は、温めたプラーク培地と、加熱した0.6%アガロースまたは2% CMCのいずれかのストック溶液を1:1の比率で混合します。その後、温度を均一にするため、56°Cのウォーターバスに30分間置きます。細胞死やウイルスタイターの低下を防ぐため、溶液が温かく、かつ触れた時に熱すぎないことを確認してくださ