Name: マウス唾液腺幹細胞の単離 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-02-08T18:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 52 s
Description: 学ぶマウス唾液腺幹細胞の単離法。コラゲナーゼとヒアルロニダーゼによる酵素処理と機械的消化を組み合わせ、サリスフェアを培養する。再生医療や口腔乾燥症治療への応用が期待される。

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1。リージェントの準備<ol><li>バッファー：1％（w / v）のハンクス平衡塩溶液にウシ血清アルブミン</li><li>再構成酵素。ヒアルロニダーゼ酵素：40mgの/ mLを、緩衝液に溶解した。コラゲナーゼII：23mg / mLの、緩衝液に溶解した。それぞれの分離のための新鮮な作りたての酵素液を使用してください。 4℃で溶解、店舗℃で消化するため、使用するまで。 </li><li>蒸留水に50 mMの塩化カルシウム。 0.2μMの孔径のフィルターを通して滅菌フィルタリング。 </li><li>マウス唾液腺（MSG）の培地：DMEM：ペニシリンとF12（100 IU / mL）を、ストレプトマイシン（100μg/ mL）を、グルタミン（2mM）を、上皮増殖因子-2（20 ng / mL）を、線維芽細胞増殖因子-2（20 ng / mL）を、N2サプリメント（1％）、インスリン（10μg/ mLの）とデキサメタゾン（1μM）。 </li></ol> 2。機械的および酵素組織消化<ol><li>解剖唾液腺の重量を量る。 </li><li>小さなペトリ皿の中で無菌湾曲した解剖鋏を使用して均質なパルプに腺を切る。 </li><li> 80mg顎下腺組織ごとのバッファ液1mLを使用して、14 mLチューブにみじん切りの組織を収集する。バッファの一部を用いて組織のきれいなペトリ皿をすすぐ。 </li><li> 25μLコラゲナーゼIIの酵素溶液、25μLのヒアルロニダーゼ酵素溶液と80 mgの組織ごとに250μLの塩化カルシウム溶液に続いて、80 mgの組織ごとにバッファの別の1 mLを追加します。組織の大量の作業をする場合、ステップ2.4​​から2.9までは、利便性のためにT25組織培養フラスコで行うことができます。 </li><li> 20分間37℃に設定した振とうしながら水浴中でインキュベートする。チューブを外し、再び組織を徹底的に酵素を混合し、ピペットでひいて粉にする。 </li><li>別の20分間水浴中で交換してください。 </li><li> 8分間、400 × gで遠心分離して組織を採取します。上清を捨てる。 </li><li>各80 mgの組織を2 mLのバッファーで再懸濁し、そして上記のように酵素と塩化カルシウムの添加を繰り返す。水浴を振りで20分間インキュベートする。チューブを外し、徹底的に酵素を混合し、ピペットでひいて粉にする。 </li><li>水浴を振っての最後の20分間インキュベートします。上記のように遠心分離により細胞を収集し、上清を捨てる。 </li></ol> 3。洗浄のステップ<ol><li> 2mLのバッファーと酵素の自由な組織を洗浄するのにピペットで組織の各80mgを懸濁します。 </li><li>収集するように以前に遠心する。上清を捨てる。 </li><li> 80mgの組織あたり1mLの緩衝液を用いて洗浄を繰り返します。収集する心し、上清を捨てる。 </li></ol> 4。フィルタリング<ol><li> 80mgの組織ごとに1 mLのバッファーで組織液を再懸濁します。 </li><li> 50mlのファルコンチューブの上に配置さ100μm、空孔サイズのフィルターにソリューションを追加します。フィルタがブロックされる可能性があるので、列ごとミンチ組織のソリューションの3つ以上のMLSを適用しないでください。を通じて浸透することができます。ピペットでフィルターの下側にぶら下がってフィルタリングされた材料を除去し、ろ液に加える。 </li><li> 50mLのチューブからろ液を取り、5 mLチューブ上に50μmの孔径のフィルターに適用する26ゲージの針で注射器を使用してください。必要に応じて、ふたを緩めて、支援、通過フィルタすることができます。 </li><li>遠心チューブは、以前に収集する。上清を捨てる。 </li></ol> 5。メッキとミディアム<ol><li> 1つのボリュームにすべてのペレットを組み合わせる。自動細胞計数器またはhaemocytometerを使用して数える。 </li><li>ウェル12ウェルプレートの当り0.4 × 10 6個の細胞、またはT25組織培養フラスコあたり2.67 × 10 6細胞の密度で細胞をプレート。各ウェルに1mLのMSG媒体または各T25フラスコに6mLのを追加。 </li><li> 37 ° C.球は2日目からはっきりと見えるはずです。 </li></ol> 6。代表的な結果： 文化の中で2〜3日後、細胞（salispheres）の小さな凝集体は、培養では明らかであろう。 Salispheresは、培養中の10日間にわたって大きさに成長していきます。 salispheresの代表的な位相差顕微鏡像を図1に示されています。幹細胞関連マーカータンパク質を発現する増殖する細胞は、最適に日3月5日後の分離の間に、これらの球から単離し、機能性、唾液産生腺房細胞への分化が可能であることができる。 <img src="/files/ftp_upload/2484/2484fig1.jpg" alt="図1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図1"> 図1 in vitroで Salisphere形成。現在のプロトコルを使用して機械的および酵素的消化に続いて、増加するサイズの球体は浮遊培養では見つけることができます。パネルは、0日目（A）、4から球の代表的な位相差顕微鏡像（B）、7（C）と10（D）です。スケールバー= 50μmの。

<ol><li>Vissink, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oral+Sequelae+of+Head+and+Neck+Radiotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Crit+Rev+Oral+Biol+Med%22%5BJournal%5D)">Oral Sequelae of Head and Neck Radiotherapy.</a> Crit Rev Oral Biol Med. 14, 199-212 (2003).</li>
<li>Nape&ntilde, as, J, J., Brennan, M. T., Fox, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnosis+and+treatment+of+xerostomia+%28dry+mouth%29%5BTitle%5D)+AND+%22Odontology%22%5BJournal%5D)">Diagnosis and treatment of xerostomia (dry mouth).</a> Odontology. 97, 76-83 (2009).</li>
<li>Denny, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parenchymal+cell+proliferation+and+mechanisms+for+maintenance+of+granular+duct+and+acinar+cell+populations+in+adult+male+mouse+submandibular+gland%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Parenchymal cell proliferation and mechanisms for maintenance of granular duct and acinar cell populations in adult male mouse submandibular gland.</a> 235, 475-485 (2005).</li>
<li>Man, Y. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Persistence+of+a+perinatal+cellular+phenotype+in+submandibular+glands+of+adult+rat%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Histochem.+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Persistence of a perinatal cellular phenotype in submandibular glands of adult rat.</a> J. Histochem. Cytochem. 43, 1203-1215 (1995).</li>
<li>Cotroneo, E., Proctor, G. B., Carpenter, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regeneration+of+acinar+cells+following+ligation+of+rat+submandibular+gland+retraces+the+embryonic-perinatal+pathway+of+cytodifferentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Differentiation%22%5BJournal%5D)">Regeneration of acinar cells following ligation of rat submandibular gland retraces the embryonic-perinatal pathway of cytodifferentiation.</a> Differentiation. 79, 120-130 (2010).</li>
<li>Eirew, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+quantifying+normal+human+mammary+epithelial+stem+cells+with+in+vivo+regenerative+ability%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">A method for quantifying normal human mammary epithelial stem cells with in vivo regenerative ability.</a> Nat Med. 14, 1384-1389 (2008).</li>
<li>Gorjup, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glandular+tissue+from+human+pancreas+and+salivary+gland+yields+similar+stem+cell+populations%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Glandular tissue from human pancreas and salivary gland yields similar stem cell populations.</a> European Journal of Cell Biology. 88, 409-421 (2009).</li>
<li>Alonso, L., Fuchs, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cells+of+the+skin+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Stem cells of the skin epithelium.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100, Suppl 1. 11830-11835 (2003).</li>
<li>Lombaert, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rescue+of+salivary+gland+function+after+stem+cell+transplantation+in+irradiated+glands%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+One%22%5BJournal%5D)">Rescue of salivary gland function after stem cell transplantation in irradiated glands.</a> Plos One. 3, e2063-e2063 (2008).</li>
<li>Coppes, R. P., Goot, A. vander, Lombaert, I. M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+Cell+Therapy+to+Reduce+Radiation-Induced+Normal+Tissue+Damage%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Radiation+Oncology%22%5BJournal%5D)">Stem Cell Therapy to Reduce Radiation-Induced Normal Tissue Damage.</a> Seminars in Radiation Oncology. 19, 112-121 (2009).</li>
</ol>

利害の衝突は宣言されません。

ここで説明した組織培養法は、幹細胞を含むマウスの唾液腺からsalispheresを単離するための再現可能なプロトコルを表します。この方法で単離した細胞を用いた研究は、9唾液腺幹細胞の再生能力を強調している。 salispheresから派生したのc - Kit +細胞の百の移植は、照射したマウス唾液腺の機能回復を誘導した。これらのデータは、エキサイティングであり、口腔乾燥のための幹細胞ベースの治療法の調査の出発点を提供しています。多くの道は、幹細胞の完全なマーカータンパク質の発現プロファイル、照射された耳下腺唾液腺およびその逆の機能を救出するために顎下腺の能力、とのin vivoで幹細胞のニッチにおける推定の特性評価を含む、しかし調査されずに残っている細胞。最終的に、ヒトの組織サンプルや単離細胞を用いて、ヒトの患者における口腔乾燥症の治療のためのその後の可能性に、このプロトコルの変換は、記載された方法の中で最もエキサイティングなアプリケーションです。

<table><tbody><tr><td>ヒアルロニダーゼ</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3506</td><td>&amp;#8211; 20 &amp;#x00B0;Cで保存</td></tr><tr><td>コラゲナーゼ II</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>17101-015</td><td>4 &amp;#x00B0;Cで保存</td></tr><tr><td>上皮成長因子-2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E9644</td><td>リン酸緩衝生理食塩水 (PBS)を用いて 10 &amp;#x03BC;g / mL のストック溶液を作成する。&amp;#8211; 20 &amp;#x00B0;Cで、1回分ずつ分注して保存する。</td></tr><tr><td>線維芽細胞成長因子-2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F0291</td><td>PBSを用いて 25 &amp;#x03BC;g / mL のストック溶液を作成する。&amp;#8211; 20 &amp;#x00B0;Cで、1回分ずつ分注して保存する。</td></tr><tr><td>N2サプリメント</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>17502-048</td><td>製造元の指示に従う。</td></tr><tr><td>インスリン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I6634</td><td>水道水を用いて 2 mg / mL のストック溶液を作成する。溶解前に、氷酢酸を用いて水の pH を 2-3 に調整する。</td></tr><tr><td>デキサメタゾン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4902</td><td></td></tr><tr><td>100 &amp;mu;M 孔径 滅菌済みセルストレーナー</td><td>BD Biosciences</td><td>352360</td><td></td></tr><tr><td>セルストレーナーキャップ付きポリスチレン製ラウンドボトムチューブ (50 &amp;mu;M 孔径)</td><td>BD Biosciences</td><td>352235</td><td></td></tr></tbody></table>

マウス唾液腺幹細胞の単離

Isolation of Mouse Salivary Gland Stem Cells

ヒトとマウスの両方由来の成熟した唾液腺は口腔内に唾液の生産と排泄を促進するそれぞれの5つの細胞型、の最小値を含んで。漿液性と粘液腺房細胞は、それぞれ蛋白質と腺の粘液産生工場であり、唾液の生産の原点を表しています。一度合成さ、唾液の様々な酵素や他のタンパク質性の成分が口の中の空洞に一つの主要なダクトを介して唾液の最終的な追放されるまで、上皮型の形態をもつ管細胞の一連の分泌される。唾液の組成物はまた、このプロセス中に乳管細胞によって変更されます。 このようなシェーグレン症候群などの疾患の症状で、そのような頭頸部癌に対する放射線治療のようないくつかの臨床状況において、腺によって唾液の生産が飛躍的に1,2を削減されます。結果として口腔乾燥、口内乾燥の主観的な感覚は、飲み込むと話すように患者のだけでなく、能力に影響を与えるだけでなく、虫歯の開発を奨励し、被害者のための社会的に衰弱させることができます。 上記の臨床症状で唾液の生産の回復は、したがって、満たされていない臨床上の必要性を表し、そしてそのようないくつかの研究では、唾液腺3-5の再生能力を実証しているとして。幹細胞のようなマウスおよびヒトの体6から8までの様々な組織からの細胞集団の単離にさらに、我々はマウス唾液腺から単離された幹細胞を照射唾液で唾液の産生を救出するために使用できることを説明した方法を用いて示されている腺9,10。この発見は、多能性自己再生機能を持つ細胞を含む微小環境としての唾液腺の探査のためにも、ヒトのxerostomic状態の治療に幹細胞ベースの治療法の開発のための道を開く、と。

マウス唾液腺由来の幹細胞の単離のため最適化されたプロトコルが記述されています。方法は、酵素と機械的な消化を採用しており、幹細胞の特性を持つ細胞を含むsalispheresの分離を可能にします。

ヒトおよびマウス由来の成熟した唾液腺は、少なくとも5種類の細胞で構成されており、それぞれの細胞が……の産生および分泌を促進している。

本手順の全体的な目的は、マウスの下顎唾液腺から推定幹細胞を単離する方法を実証することです。まず、成マウスから下顎唾液腺を採取します。次に、曲剪刀を用いて組織を均質にすり潰し、パルプ状に処理します。手順の第3段階は、コラゲナーゼおよび高活性リアーゼ酵素を用いて組織をさらに消化することです。組織を消化しすぎないよう注意してください。完全に細胞懸濁液にしてしまうとスフィアがあまり得られないため、2〜3個の細胞からなるクラスター状の状態が最適です。手順の最終ステップは、ホモジネートを100 micronおよび50 micronのフィルターでろ過することです。最終的に、SIV腺全体の機械的および酵素的消化を組み合わせて使用することで、siv腺幹細胞の培養および単離を示す結果を得ることができます。この技術の意義は、放射線治療によって引き起こされる可能性がある、ドライマウスとしても知られる口腔乾燥症の治療へと広がります。唾液腺幹細胞は、頭頸部癌を患う患者の口腔乾燥症（Xerostomia）の改善に利用できる可能性があります。本手順を開始する前に、バッファー、マウス、唾液腺培養物、培地、および酵素溶液を準備してください。付属の書面によるプロトコルに従い、すべての解剖および組織培養の手順は、滅菌済みの組織培養フード内で行う必要があります。マウスの唾液腺を単離および切除した後、天秤で唾液腺組織の重量を測定し、記録します。スパチュラを用いて唾液腺を小型のペトリ皿に移し、曲剪を用いて唾液腺を均一なパルプ状に細断します。P 1000 ピペットチップの先端を切断し、開口部を広げます。これを用いて、組織80 mgあたり1 mLのバッファーをペトリ皿に分注し、ホモジネートを15 mL遠心チューブに移します。さらに組織80 mgあたり1 mLのバッファーをペトリ皿に加えます。残った小さな組織片を回収するため、この溶液を遠心チューブに加えます。次に、塩化カルシウム溶液 250 µL、ヒアルロニダーゼ溶液 25 µL、およびコラゲナーゼ 25 µLを速やかに加えます。組織 80 mgあたり2種類の酵素溶液を用います。組織と酵素の混合物が入ったチューブを37 °Cの振盪水槽に入れ、20分間インキュベートします。インキュベーション後、チューブを取り出します。前述と同様に、先端を切り取ったP 1000チップを使用して、組織と酵素溶液を約10回十分に混合します。その後、チューブを37 °Cのウォーターバスに戻し、さらに20分間静置します。2回目のインキュベーション後、サンプルを400 ×gで8分間遠心分離し、上清を廃棄して、開始組織80 mgあたり2 mLのバッファーでペレットを慎重に再懸濁します。次に、塩化カルシウム溶液250 µL、ヒアルロニダーゼ溶液25 µL、およびコラゲナーゼ溶液25 µLをさらに添加します。これら2種類の酵素溶液を組織80 mgあたりに使用します。その後、チューブを37°Cの振盪水槽に戻し、20分間静置します。組織を水槽から取り出し、前述のインキュベーションと同様の手順を繰り返します。サンプルを400×gで8分間遠心分離します。もう一度繰り返し、その後上清を廃棄します。前回の遠心分離後、組織はろ過に向けた洗浄準備が整った状態になります。2 mLのバッファーをチューブにピペットで加え、トリチュレーション（撹拌）します。再懸濁後、ペレットを懸濁させます。サンプルを400 ×gで8分間遠心分離します。その後、上清をピペットで除去します。組織80 mgあたり1 mLのバッファーをチューブに加え、再度トリチュレーションを行います。これによりペレットを再懸濁させます。その後、遠心分離を繰り返します。400 ×gで8分間遠心分離します。遠心分離の間、100 µmの孔径のフィルターを50 mL遠心チューブの上に配置し、ろ過ステップの準備をします。遠心分離後、上清を廃棄し、組織80 mgあたり最終的に1 mLのバッファーをチューブにピペッティングします。ペレットが完全に再懸濁されるよう、エンドカッター付きのP 1000チップを使用してピペッティングを繰り返します。次に、ホモジネートを孔径100 micronのフィルターに移し、50 milliliter遠心チューブ内へ濾過させます。フィルターが目詰まりする可能性があるため、一度に3 milliliters以上のホモジネートを加えないことが重要です。この量を超えた場合は、P 1000ピペットを使用してフィルター下面に溜まった組織を除去し、濾液の入った50 milliliter遠心チューブにその組織を移してください。26ゲージの針を装着した1 mLシリンジを用いて、50 mL遠心チューブからホモジネートを吸引し、5 mLチューブに取り付けた孔径50 µmのフィルターキャップに塗布します。ホモジネートをフィルターに浸透させます。ろ過速度が遅い場合は、フィルターキャップが締めすぎられている可能性があるため、緩めてください。ホモジネートがすべてフィルターを通過してチューブに入った際、シールによってろ過が妨げられることがあります。サンプルを 400 ×g で 8 分間遠心分離します。遠心分離後、ペレット化した細胞をプレートに播種できる状態になります。唾液腺細胞の準備は、組織 80 mg あたり 1 mL の MSG 培地で再懸濁することから始めます。標準的なプロトコルに従って細胞数をカウントします。ここでは、自動細胞計数装置を用いて細胞数を決定します。0.4 × 10⁶個の細胞に必要な細胞懸濁液の容量を算出し、そこから播種可能なウェル数を決定します。12ウェル培養プレートの各ウェルに、MSG培地を1 mLずつ加えます。細胞懸濁液を十分に混合させ、0.4 × 10⁶個の細胞に相当する必要量の細胞懸濁液を各ウェルに分注します。プレートを37 °C、5% carbon dioxideのインキュベーターに移します。2日間の培養後、培養液中にSLO spheresが存在し、かつ細胞にaceが欠損しているかを確認します。これは、上述の手法で処理し、培養0日から10日まで位相差顕微鏡で観察したマウス唾液腺組織の例です。細胞の小さな凝集塊がSLO spheresであり、この期間を通じてサイズが増大します。ここでは、幹細胞マーカーに対する代表的な3〜5日目のSLOsスフィア培養の免疫染色の結果を示します。Protein Cキットを用いてフローサイトメトリーで解析したところ、c-kitの発現により、SLOsスフィア培養における推定幹細胞の存在が確認されました。また、3〜5日目のSLOsスフィアは分化させることができ、天然の唾液腺と同様の形態を持つ腺房および管状構造を形成します。このビデオを視聴することで、マウスの唾液腺および唾液腺由来幹細胞の単離方法について十分な理解を得ることができます。

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