マウス唾液腺幹細胞の単離

マウス唾液腺由来の幹細胞の単離のため最適化されたプロトコルが記述されています。方法は、酵素と機械的な消化を採用しており、幹細胞の特性を持つ細胞を含むsalispheresの分離を可能にします。

この手順の全体的な目標は、ニューロンSIV腺からの推定幹細胞の単離を実証することです。これは、最初に成体マウスから顎下唾液腺を採取することによって達成されます。手順の2番目のステップは、湾曲したハサミを使用して組織を均質なパルプに処理することです。

手順の3番目のステップは、コラゲナーゼと高等リアーゼ酵素を使用して組織をさらに消化することです。組織を過剰に消化しないように注意する必要があります。完全な細胞懸濁液はあまり多くの球をもたらさないため、2〜3個の細胞のクラスターが最適です。

手順の最終ステップは、100ミクロンと50ミクロンのフィルターによるホモジネートのろ過です。最終的には、SIV腺全体の機械的消化と酵素的消化を組み合わせて使用することにより、siv腺幹細胞の培養と単離を示す結果を得ることができます。この技術の意味は、ドライマウスとも呼ばれ、放射線療法治療から生じる可能性のある口内乾燥症の治療にまで及びます。

唾液腺幹細胞は、この手順を開始する前に、頭頸部がんに苦しむ患者の口内乾燥症を救助するために使用できます。緩衝液、マウス、唾液腺培養液、培地溶液、酵素溶液を調製します。添付の書面によるプロトコルに従って、すべての解剖および組織培養ステップは、滅菌組織培養フードで実行する必要があります。

マウスの唾液腺を分離して解剖した後、唾液腺組織を天秤にかけ、重量を記録します。へらを使って唾液腺を小さなシャーレに移し、湾曲した解剖ハサミを使用して、唾液腺を均質なパルプに切り刻みます。P 1000ピペットチップの端をカットして、開口部を広くします。

これを使用して、組織80ミリグラムあたり1ミリリットルのバッファーをペトリ皿にピペットで移し、ホモジネートを15ミリリットルの遠心分離管パイプに移します。別のもの、ティッシュ80ミリグラムあたりミリリットルの緩衝液をペトリ皿に軽くたたいます。残りの小さな組織片を収集するには、この溶液を遠心分離チューブに加えます。

次に、250マイクロリットルの塩化カルシウム溶液、25マイクロリットルのヒアルロニダーゼ溶液、および25マイクロリットルのコラゲナーゼを素早く加えます。組織80ミリグラムあたり2つの酵素溶液。組織と酵素混合物の入ったチューブを摂氏37度に入れ、水浴を振盪し、20分間インキュベー

インキュベーション後、チューブを取り外してください。前回と同様に端を取り外した状態でP 1000チップを使用し、組織と酵素溶液を約10回完全に混合します。チューブを摂氏37度のウォーターバスにさらに20分間戻します。

2回目のインキュベーション期間の後、遠心分離後8分間、サンプルを重力400倍で遠心分離し、仰臥位を廃棄し、開始組織80ミリグラムあたり2ミリリットルの緩衝液にペレットを慎重に再懸濁します。次に、さらに250マイクロリットルの塩化カルシウム溶液、25マイクロリットルのヒアルロニダーゼ溶液、および25マイクロリットルのコラゲナーゼを加えます。組織80ミリグラムあたり2つの酵素溶液。

そして、チューブを摂氏37度の振とう水浴に20分間戻します。ウォーターバスから組織を取り出し、インキュベーション後に前のインキュベーションと同様に繰り返します。サンプルを重力の400倍で8分間遠心分離します。

もう一度、その後、仰臥位を捨てます。これで、前回の遠心分離後のろ過に備えて組織を洗浄する準備が整いました。2ミリリットルのバッファーをチューブにピペットで入れ、裂けたものを回転させます。

蘇生懸濁液に続いてペレットパルトを吊り下げます。サンプルを重力の400倍で8分間遠心分離します。次に、仰臥位ピペットを廃棄します。

組織80ミリグラムあたり1ミリリットルの緩衝液をチューブに入れ、再び三十四球にする。ペレットを再懸濁します。遠心分離を繰り返します。

重力の400倍で8分間ステップします。遠心分離中は、遠心分離後に50ミリリットルの遠心分離チューブに100ミクロンの細孔サイズのフィルターを配置し、仰臥位を廃棄し、組織80ミリグラムあたり最終的に1ミリリットルの緩衝液をチューブにピペットで移すことにより、ろ過ステップの準備をします。ピペットを上下に動かす前に、エンドカッターにP 1000チップを使用して、ペレットが完全に再懸濁されていることを確認します。

次に、ホモジネートを100ミクロンの細孔サイズのフィルターに移し、フィルターを通して50ミリリットルの遠心分離管に浸透させます。フィルターが詰まる可能性があるため、3ミリリットルを超えるホモジネートを適用しないことが重要です。この容量を超える場合は、P 1000ピペットを使用してフィルターの下側に溜まった組織をすべて取り除き、この組織を濾液を含む50ミリリットルの遠心分離チューブに移します。

26ゲージの針を取り付けた1ミリリットルのシリンジを使用して、50ミリリットルの遠心分離チューブからホモジネートを吸引し、5ミリリットルのチューブに取り付けた50ミクロンの細孔サイズのフィルターキャップに塗布します。ホモジネートがフィルターを通して浸透するのを待ちます。フィルタリングが遅い場合は、フィルターキャップがきつすぎるため緩めます。

シールは、すべてのホモジネートがフィルターを通過してチューブに入ったときにフィルタリングを防ぐことができます。サンプルを重力の400倍で8分間遠心分離します。遠心分離後、ペレット化された細胞をプレートに播種する準備が整います。

唾液腺細胞は、組織80ミリグラムあたり1ミリリットルのMSG培地にそれらを懸濁することから始まります。標準的なプロトコルに従って細胞を数えます。ここでは、自動セルカウンターを使用してセル番号を決定します。

6つの細胞の0.4×10に必要な細胞懸濁液の量を計算し、これから播種できるウェルの数を計算します。1ウェルあたり1ミリリットルのMSG培地を12ウェル培養プレートに加えます。細胞懸濁液が十分に混合されていることを確認し、必要な量の細胞懸濁液を各ウェルの6つの細胞に0.4×10で加えます。

プレートを5%の二酸化炭素を含む摂氏37度のインキュベーターに移します。2日間のインキュベーション後、培養物にSLOs球が存在するかどうか、および細胞内にエースが存在しないかを調べます。これは、マウスの唾液腺組織を記載どおりに処理し、培養中の0〜10日間の位相差顕微鏡法で視覚化した例であり、細胞の小さな凝集体はSLO球体であり、この期間を通じてサイズが大きくなります。

ここに示されているのは、幹細胞マーカーの代表的な3〜5日間のSLOs球体培養の免疫染色です。プロテインCキット。フローサイトメトリーによって解析されたように、sea kitの発現は、SLOs運賃培養物中の推定幹細胞の存在を確認し、3〜5日齢のSLOs球体も分化して、天然の唾液腺のものと同様の形態を持つsinおよびductのような構造を形成することができる。

このビデオを見た後、マウスの唾液腺から唾液腺、幹細胞を分離する方法をよく理解しているはずです。