Name: 脂質中間相における膜タンパク質の結晶化 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-03-28T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 53 s
Description: 学ぶ脂質中間相（LCP）を用いた膜タンパク質の結晶化法。LCP-FRAP前結晶化アッセイで最適条件を選別し、高品質な結晶を得てX線結晶構造解析に応用する手法を解説します。

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この作品は、NIHの助成金GM073197とRR025336によって部品で賄われていた。

メソ結晶化実験での典型的な概要は図1,2に示されています。プレ結晶LCP - FRAPアッセイはオプションですが、彼 ​​らは大幅に特に困難な膜タンパク質3の場合には、初期結晶化条件の検索プロセスを加速することができます。 1。 LCPにおけるタンパク質の再構成<ol><li>洗剤溶液への関心の膜タンパク質を精製し、約10にタンパク質/界面活性剤複合体を集中- 20 mg / mLの、洗剤の1,4を介して、集中しないように注意しながら。 </li><li>転送〜LCPホスト脂質（通常はモノオレイン）または40で1.5 mLのプラスチックチューブとインキュベートに脂質混合物25mgの° Cで数分間脂質が溶けるまで。 </li><li> 100μLガスタイトシリンジに注射器のカプラーを取り付けます。 </li><li>調節可能なボリュームのピペットを用いて溶融脂質とシリンジをロードする。シリンジ内の脂質の量を記録。 </li><li> / Vタンパク質ソリューション対脂質比2 / 3のタンパク質溶液と、別の100μLシリンジをロードする対</li><li>注射器のカプラーを介して一緒に両方のシリンジを接続してください。 </li><li>脂質の中間相が均一になるまで注射器は、前後に、カプラーの内側の針を介して脂質とタンパク質を移動するために交互にプランジャ押し込みます。 LCPは、機械的混合によって自発的に形成し、そしてタンパク質は、LCPの脂質二重層に再構成になります。 LCPの形成は、小角X線回折1を使用して 、可能であれば、クロス偏光板とを備えた顕微鏡で見たときに、その透明性とゲル状の整合性がとbirefringencyの不在によって検証、またはすることができます。 </li></ol> 2。 LCP - FRAPプリ結晶化アッセイ LCP - FRAPアッセイは、スクリーニングの条件3の様々な時にLCPの再構成膜タンパク質の拡散特性を測定するように設計されています。 LCPの膜タンパク質の長距離拡散が成功した結晶化に不可欠ですが、LCPの微細構造は、大規模なタンパク質やオリゴマータンパク質の凝集体の拡散を抑制します。 メソ結晶化実験での失敗の一般的な理由は、拡散の損失につながる高速タンパク質凝集です。それは、タンパク質の凝集挙動は、特定のタンパク質の構造、ホストの脂質とスクリーニングのソリューション3の組成に依存することが示されている。 <ol><li> 〜100 / 1のタンパク質/色素比で蛍光色素（Cy3または類似の）とタンパク質にラベルを付ける、未反応色素を除去し、約1 mg / mLとするタンパク質を集中。遊離アミンまたは遊離チオールのいずれかにラベルを付けます。遊離アミンをラベリングする際、主に遊離のN -末端にラベルを付ける7と7.5の間のpHを使用してください。アミノ酸ラベリングも脂質蛋白質2,3と同じ場所に精製されたラベルを付けることができることに注意してください。 </li><li>再構成するセクション1で説明したようにLCPで標識したタンパク質を）。 </li><li>セクション3に記載されているようではなく、結晶化スクリーン2のLCP - FRAPスクリーニングのソリューションを使用して）アッセイプレートを設定します。 </li><li> 20℃でプレートをインキュベートします平衡状態を達成するには、少なくとも12時間、暗所でC。 </li><li>よく10倍対物レンズを用いて初のオンLCP - FRAPステーションと焦点上プレートのある場所。 </li><li>初期プリ漂白状態をキャプチャするために5蛍光画像を取得する。 </li><li>レーザーをトリガします。漂白スポットの真ん中に標識タンパク質の70％ - パルスのレーザパワーと番号は、漂白剤〜30に調整する必要があります。 </li><li>すぐにレーザーをトリガーした後、可能な限り高速なレートで約200画像の高速なポスト漂白シーケンスの記録を開始します。 </li><li>タンパク質の拡散速度に応じて、1〜20のように画像間の遅延を選択する、〜50枚の遅いポスト漂白シーケンスの録音で従ってください。 </li><li>すべてのフレームに漂白剤スポットの内部強度を統合し、レーザー漂白エリアの外の参照点の平均強度で漂白スポットの内部強度を割ることにより、集録中に漂白し、光強度の揺らぎのためにそれを修正する。 </li><li> 1に等しい事前に漂白強度は0に等しい初期漂白強度を確認するために修正された強度を正規化する。 </li><li>以下の式5を使用して 、正規化強度対時間、F（t）の曲線を合わせる： F（T）= M X EXP（- 2T / T）×（I 0（2T / T）+ I 1（2T / T））、（Eq.1） Mは拡散分子のモバイル割合である、Tは特徴的な拡散の時間、tはそれぞれの記録されたフレームのリアルタイムです、I 0とI 1 0 番と1 番目のオーダー変形ベッセル関数である。 </li><li>として、拡散係数、Dを計算します。 D = R 2 / 4T、（Eq.2） ここで、Rは、漂白スポットの半径である。 </li><li> tを移動する次もと繰り返します2.5）O - 2.13）。 </li><li>別のスクリーニングの条件で得携帯フラクションと拡散係数を比較する。デザインの新しい結晶化は、タンパク質の拡散とタンパク質の拡散が観察されなかったため除く条件を容易にするコンポーネントに基づいて選別します。タンパク質がスクリーニングの条件のいずれかに拡散しなかった場合、スクリーニングのスペースを広げたり、新しいタンパク質が構築しようと検討してください。 </li></ol> 3。 LCP結晶化トライアルのセットアップ<ol><li>再構成するセクション1で説明したようにLCPのタンパク質を）。 </li><li>タンパク質を含んだ反復シリンジディスペンサーに取り付けられた10μLガスタイトシリンジにLCPを転送します。 </li><li> 10μLシリンジに短いリムーバブルニードル（ゲージ26、10 mmの長さ）を取り付けます。 </li><li> 2x2の正方形を形成する4つの隣接する井戸の表面にLCPの200 NLのボーラス投与を分注する。 </li><li>対応する結晶の画面溶液1μLを持つLCPボーラス投与のそれぞれを重ねます。 </li><li>キャップの4つは18形のガラスのカバースリップをウェルの中にロードされます。井戸をシールするためにカバースリップ上に静かに押し込みます。 </li><li>プレート全体がいっぱいになるまで、4ウェルの次のセットで）手順3.4）-3.6を繰り返します。 </li><li>定期的に結晶の形成と成長のためのチェック、一定温度でインキュベートする。 </li></ol> 4。 LCPから収穫結晶<ol><li>直線、回転偏光子と検光子を装備した可変ズームとステレオ顕微鏡、下のタンパク質結晶プレートを置きます。 </li><li>全体がよくビューのフィールド内に配置されるように、低消費電力のズームを使って興味のあるもに焦点を当てる。 </li><li>セラミックキャピラリー切削石の鋭い角を使用しても境界線の内側の正方形を作成するための4ストロークでカバーガラスを得点する。 </li><li>カバーガラスの厚さによって傷を伝播する強力な鋭い点ピンセットで獲得した周囲に押してください。 </li><li>得点の正方形の対角線上にあるパンチ二つの小さな穴。 </li><li>後続の手順中に脱水症状を減らすために穴のいずれかを使用して沈殿剤溶液を数μLを注入する。 </li><li>角度の鋭い針のプローブを使用すると、カットアウトの正方形を解放する1つまたは2つの側面に沿ってガラスを破る。 </li><li>慎重にキュービック相のボーラスを監視ガラスの正方形を持ち上げます。ボーラスがカバースリップに付着されている場合は、井戸の底にガラスの上の正方形と場所を反転させる。 </li><li>必要に応じてウェル内の露出キュービック相のボーラスの上に、、凍結保護剤を添加した沈殿剤溶液中の余分な数μLを、追加。 </li><li>顕微鏡の倍率を増加させると、結晶に焦点を当てる。 </li><li>収穫のループを参照するのに十分な光を保ちながら、偏光板と複屈折性結晶と背景のコントラストを高めるために、アナライザの間の角度を調整します。 </li><li>結晶サイズに一致する直径MiTeGen顕微標本を選択し、顕微標本にそれをすくうことによりLCPから直接結晶を収穫。 </li><li> Flashは、液体窒素で収穫した結晶と顕微標本を凍結し、X線データ収集6のシンクロトロン光源のビームラインに発送して下さい。 </li></ol> 5。代表的な結果： 人工ヒトβ2アドレナリンGタンパク質共役型受容体（β2 AR - T4Lは）バキュロウイルスSf9昆虫細胞に感染し、部分的インバースアゴニストカラゾロール7に束縛dodecylmaltoside（DDM）/コレステヘミサ（CHS）洗剤溶液で精製で発現させた。タンパク質をCy3 NHSエステルで標識し、LCP - FRAPプリ結晶アッセイ（図2）で使用されていました。 LCP - FRAPアッセイの結果から選ばれたいくつかの条件に基づいて、粗いグリッドの画面は、初期の結晶のようなヒット（図3）を製作。沈殿剤条件のさらなる最適化は、回折品質の結晶（図4）を得た。 <img src="/files/ftp_upload/2501/2501fig1.jpg" alt="図1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図1"> 図1典型的なLCPの結晶化実験のフローチャート。グレーのボックス内のステップは、現在のプロトコールに記載されていません。 <img src="/files/ftp_upload/2501/2501fig2.jpg" alt="図2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図2"> モノオレイン基づくLCPのβ2 AR-T4L/carazololと図2。LCP - FRAPアッセイ。 A）LCP - FRAPアッセイの結果は、96ウェルプレートの各サンプルを順番に漂白され、蛍光の回復が30分間のインキュベーション後に測定される、自動ハイスループットモードで実行。各試料におけるモバイル分数を表す得られる蛍光の回復は、すべて96サンプルのためにプロットされます。スクリーニングのソリューションは、2つの異なる濃度で48の異なる塩と組み合わせて、0.1 MトリスpHを8、30％（v / v）のPEG 400が含まれています。 B）複数の担当者のための蛍光回復プロファイルresentative条件。実線の曲線は、式による近似を表す。 1。モバイルフラクションと拡散係数は、式を用いて決定されます。 1と2。ナトリウム塩化物を含む試料中の10％未満の高速リカバリは、蛍光標識脂質タンパク質と共精製さによるものです。 <img src="/files/ftp_upload/2501/2501fig3.jpg" alt="図3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図3"> 図3β2 AR-T4L/carazololの初期結晶のヒットは、硫酸Naは含まれている、LCP - FRAPによって識別された最も有望な条件の周りに粗いグリッドのスクリーニングによって得られた（パネル）およびNaギ（パネルB）。タンパク質をCy3 NHSエステルで標識し、蛍光画像は、605 nmで543 nmで励起し、発光を用いて撮影されています。 <img src="/files/ftp_upload/2501/2501fig4.jpg" alt="図4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図4"> 図4β2 AR-T4L/carazololの最適化された結晶。ナトリウム硫酸塩の存在（パネルAおよびB）で成長した結晶とKギ（パネルCおよびD）の画像は、明視野モード（パネルAおよびC）で撮影し、クロス偏光子を（パネルBおよびD）を使用している。

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<li>Cherezov, V., Peddi, A., Muthusubramaniam, L., Zheng, Y. F., Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+robotic+system+for+crystallizing+membrane+and+soluble+proteins+in+lipidic+mesophases%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallogr.+D%22%5BJournal%5D)">A robotic system for crystallizing membrane and soluble proteins in lipidic mesophases.</a> Acta Crystallogr. D. 60, 1795-1807 (2004).</li>
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<li>Cherezov, V., Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nano-volume+plates+with+excellent+optical+properties+for+fast%2C+inexpensive+crystallization+screening+of+membrane+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Appl.+Cryst%22%5BJournal%5D)">Nano-volume plates with excellent optical properties for fast, inexpensive crystallization screening of membrane proteins.</a> J. Appl. Cryst. 36, 1372-1377 (2003).</li>
<li>Cherezov, V., Fersi, H., Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystallization+screens%3A+compatibility+with+the+lipidic+cubic+phase+for+in+meso+crystallization+of+membrane+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Crystallization screens: compatibility with the lipidic cubic phase for in meso crystallization of membrane proteins.</a> Biophys J. 81, 225-242 (2001).</li>
</ol>

利害の衝突は宣言されません。

プロトコルは、 メソ結晶化実験での実行に関連する主要な手順のための基本的な視覚的なガイダンスを提供します。深いこれらのプロトコルに関連する詳細、可能な落とし穴、欠点または代替ルートを強調するよりは、他の場所で1,2用意されています。オプションのLCP - FRAPアッセイは、最も有望なタンパク質の構造を選択するLCPのホストの脂質および脂質添加物だけでなく、可能な沈殿剤と緩衝液の条件3の範囲を制限するために以前の段階で役立ちます。初期結晶化ヒットが検出されると、それはより品質の高い結晶を得るために最適化する必要があります。 メソ結晶化条件での最適化は、LCP 1の組成物に関連付けられている余分なパラメータを追加することで可溶性タンパク質のための条件を最適化すると本質的に似ています。脂質中間相で成長した膜タンパク質の結晶は、通常、界面活性剤溶液中で得られた結晶よりも小型ですが、より現代的な放射光源6でマイクロフォーカスを使用してから強く恩恵を受け、そのため、利用できるビームライン命じた。 、結晶化またはアッセイプレートを設定するLCP - FRAPアッセイを行うと、結晶の検出を含むメソ結晶化、、 に関連する手順の多くは、できるように、1,2,8,9半または完全に自動化されている条件の広い範囲のスクリーニングタンパク質と脂質の消費する少量ながら。一方、LCPと結晶の収穫におけるタンパク質reconstitutionsは、マニュアルや面倒な操作が残ると、このように、改善の必要性を持っている。

<table><tbody><tr><td>100 &amp;mu;L ガス気密シリンジ</td><td>Hamilton Co</td><td>7656-01</td><td>シリンジ2本が必要</td></tr><tr><td>10 &amp;mu;L ガス気密シリンジ</td><td>Hamilton Co</td><td>7653-01</td><td></td></tr><tr><td>シリンジカプラー</td><td>Hamilton Co</td><td>7770-02 30902</td><td>カプラーは、文献10に記載されている通り、入手可能な部品を用いて作製できる</td></tr><tr><td>リピート分注シリンジ</td><td>Hamilton Co</td><td>83700</td><td>リピート分注シリンジは、分注量を約3分の1に減少させるよう改造可能&lt;sup&gt;11&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>短 (0.375&amp;#8221;) 平端取り外し可能針 (ポイントスタイル3, ゲージ26)</td><td>Hamilton Co</td><td>7804-03</td><td></td></tr><tr><td>96ウェルガラスサンドイッチプレート</td><td>Marienfeld</td><td>08 900 03</td><td>手動操作の場合、標準的な顕微鏡用ガラススライドと穴あき両面テープを使用して、ガラスサンドイッチプレートを組み立てる方が便利である&lt;sup&gt;1,2,12&lt;/sup&gt;。</td></tr><tr><td>ガラスカバーガラス</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>63787-01</td><td></td></tr><tr><td>モノオレイン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7765</td><td></td></tr><tr><td>結晶化スクリーニングキット</td><td>Hampton Research, Molecular Dimensions, Emerald Biosystems, Jena Bioscience</td><td></td><td>市販されているほとんどのスクリーニングキットを初期スクリーニングに使用できる。LCPを安定して破壊する条件については、適合性を高めるために2倍に希釈して使用する&lt;sup&gt;13&lt;/sup&gt;。</td></tr><tr><td>キャピラリーカッティングストーン</td><td>Hampton Research</td><td>HR4-334</td><td></td></tr><tr><td>精密ピンセット</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>510</td><td></td></tr><tr><td>角度付き鋭尖プローブ</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>13650</td><td></td></tr><tr><td>MicroMounts</td><td>MiTeGen</td><td>M1-Lxx-xx</td><td>結晶サイズに合わせてMicroMountの径を選択すること</td></tr></tbody></table>

脂質中間相における膜タンパク質の結晶化

Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases

膜タンパク質は、形質導入、輸送、エネルギー変換を信号に関係する生体細胞内の重要​​な機能を実行し、そして、そのように、故障や病気の多くに関与している。しかし、膜タンパク質の構造と機能の理解が強く、主に、それらの水溶性パートナーのその背後にそれらの可溶化と回折品質結晶の生成に関連する問題のために遅れている。脂質中間相の結晶化は、（また、 メソ or LCP結晶でも呼ばれる）が正常に微生物ロドプシン、光合成タンパク質、外膜のβバレルとGタンパク質共役受容体の高分解能構造を得るために適用was有望な技術です。メソで結晶化は、ネイティブのような膜環境を活用し、一般的に低い溶媒含量と洗剤のソリューションから、従来の結晶に比べて、よりよい順序で結晶を生成します。方法は難しくありませんが、粘性の中間相の材料を処理する際の脂質の相挙動と実践を理解する必要があります。ここでは、事前に結晶化アッセイとから収穫結晶を行い、LCPを作成し、アッセイまたは結晶化プレートにLCPのナノリットルの一部を分配することによって続いて注射器のミキサーを使用してLCPの脂質二重層の膜タンパク質を、再構成のシンプルかつ効率的な方法を示していますLCPの行列。これらのプロトコルは、 メソ結晶化試験で近づくための基本的なガイドを提供しますが、任意の結晶化実験と同様に、広範なスクリーニングと最適化が必要であり、成功した結果は必ずしも保証されません。

プロトコルは、LCP結晶化試験と収穫結晶の設定、LCP - FRAPプリ結晶アッセイで初期条件を見つけることが、脂質キュービック相（LCP）におけるタンパク質の再構成から開始して膜タンパク質の回折品質結晶を得るために不可欠な手順を説明します。 。

膜タンパク質は、信号伝達、輸送、エネルギー変換に関連する生細胞内の重要な機能を担っており、そのため、...

本手順の全体的な目的は、X線結晶構造解析による構造決定のために、膜タンパク質の高品質な結晶を得ることであります。これは、リピッドキュービック相（脂質立方相）の膜にタンパク質を再構成し、沈殿剤溶液とともにインキュベートすることで達成されます。これにより、広大な結晶化空間と結晶化実験からの限定的なフィードバックにより、結晶の核形成と成長が誘導されます。リピッドキュービック相の光退色後蛍光回復、すなわちLCP FRAP Prec結晶化アッセイは、最も有望な結晶化条件を選別するために開発されました。このアッセイにより、スクリーニング量を削減し、初期の結晶化ヒットを得られる確率を高めることができます。初期ヒットが得られた後は、結晶成長を改善させるための最適化試験が行われます。最終的に、最適化された結晶を回収し、放射光施設でのデータ収集に向けて液体窒素中で凍結保存します。結果は、LCP中でのβ2アドレナリン受容体の初期結晶を得るためのLCP FRAアッセイの有効性を示しており、さらなる最適化によって回折品質の結晶が得られました。この手法は、リピッドキュービック相によって提供される天然に近い膜環境を利用しており、通常、結晶化および界面活性剤溶液と比較して、溶媒含有量が低く、秩序性の高い結晶が得られます。一般的に、この方法に慣れていない人は、脂質メソ相の高い粘性と粘弾性特性により、材料の取り扱いが困難であるため、苦労することがあります。しかしながら、適切なツールを使用し、技術を習得すれば、この手順は他のタンパク質結晶化技術と同等に難易度は低く、自動化やハイスループット化にも対応可能です。それでは、始めていきましょう。目的の膜タンパク質を界面活性剤溶液中で精製し、タンパク質-界面活性剤複合体を約10から20 mg/mLまで濃縮します。約 25 mg の A LCP ホスト脂質または脂質混合物をプラスチックチューブに移し、脂質が溶けるまで 40 °C で数分間インキュベートします。次に、100 µL ガスタイトシリンジにシリンジカプラーを取り付けます。可変容量ピペットを用いて、溶融した脂質をシリンジに充填します。シリンジ内の脂質の容量を記録し、別の100 µLシリンジに、脂質に対するタンパク質溶液の容量比が2〜3となる十分な量のタンパク質溶液を充填します。シリンジカプラーを用いて両方のシリンジを接続します。脂質メソ相が均一になるまで、シリンジプランジャーを交互に押し、カプラーの内針を通じて脂質とタンパク質を往復させて混合します。LCPは機械的な混合によって自発的に形成され、タンパク質はLCPの脂質二重層に再構成されます。LCPの形成は、透明でゲル状の整合性があること、およびクロスニコル（直交偏光）を備えた顕微鏡で観察した際に複屈折が見られないこと、または可能であれば小角X線回折を用いることで確認できます。LCP FRAPアッセイを開始するには、記述されたプロトコルに従い、タンパク質対色素の比率を約100対1として、タンパク質を蛍光色素で標識します。未反応の色素を除去し、タンパク質を約1 mg/mLまで濃縮します。次に、ラベル未付加のタンパク質と同様の手順で、ラベル化されたタンパク質をLCPで再構成します。アッセイプレートを準備します。LCPラップスクリーニング溶液を使用します。まず、タンパク質を含有させたLCPを、リピティブシリンジディスペンサーに取り付けた10 µLガスタイトシリンジに移し、次に10 µLシリンジに短い取り外し可能な針を取り付けます。隣接する4つのウェルの表面に200 nLずつLCPを分注して2×2の正方形を形成し、各LCPボラスに、対応するLCP FRAスクリーニング溶液を1 µLずつ重なるように分注します。スクリーニング溶液を分注した後、充填した4つのウェルを18 mm角のガラスカバースリップで蓋します。カバースリップに軽く圧力をかけて、ウェルを密閉します。プレート全体が満たされるまで、次の4つのウェルのセットに対してこの操作を繰り返します。充填後、プレートをアルミホイルで覆います。プレートを20 °Cで12時間以上インキュベートします。平衡状態にするため、プレートの1枚をLCP Frapステーションに設置し、10倍対物レンズを使用して最初のウェルに焦点を合わせます。FRAPのデータ収集は、Image Proスクリプトを用いて自動的に行われます。ユーザーがまずすべての収集パラメータを入力し、その後スタートボタンを押します。一般的な収集シーケンスでは、まず漂白前の画像を5枚記録し、次に漂白レーザーを作動させると同時に、可能な限り最速の速度で約200枚の高速回復シーケンスをストリーミング記録します。続いて、タンパク質の拡散速度に応じて、画像間の間隔を1秒から20秒に設定し、50枚の低速回復シーケンスを撮影します。データ収集の終了後、すべてのフレームにおいて、漂白スポット内およびレーザー漂白領域外に配置した参照スポット内の強度を統合し、補正を行います。データ収集中の光の変動および退色によって生じる偏差の積分強度曲線において、補正後の強度を正規化し、退色前の強度を1、初期の退色強度を0とします。記述されたプロトコルに従って、正規化された強度対時間の曲線をフィッティングし、可動分率（mobile fraction）および拡散係数を算出します。この手順を次に対象とするサンプルでも繰り返し、異なるスクリーニング条件で得られた可動分率と拡散係数を比較します。タンパク質の拡散を促進した成分に基づき、またタンパク質の拡散が観察されなかった条件を除外して、新たな結晶化スクリーンを設計し、LCP結晶化試験を実施します。前述と同様に、LCP中でタンパク質を再構成し、LCP-FRAPと同様の手順で結晶化プレートを準備しますが、ここでは結晶化スクリーニング溶液を使用します。あるいは、結晶化プレートの準備が完了した後、ロボットを用いて結晶化試験を行うことも可能です。その後、一定温度でインキュベートし、結晶の形成と成長を定期的に確認します。タンパク質結晶が成長したら、結晶の入ったプレートを、リニア回転偏光子と検光子を備え、ズーム倍率を調整可能な実体顕微鏡下に設置します。低倍率のズームを用いて、目的のウェル全体が視野に入るように調整します。セラミック製キャピラリーカッティングストーンの鋭い角を使用し、ウェルの境界線の内側に正方形を描くように4回に分けてカバーガラスに筋をつけます。筋をつけた外周に、先端の鋭いピンセットで強く圧力をかけ、カバーガラスの厚み方向まで傷を浸透させます。ガラスカバーのスリッドを入れた正方形の対角にある2つの角に、小さな穴を2つ開けます。その後の工程での脱水を抑えるため、穴の1つから沈殿剤溶液を数µL注入します。角度をつけた鋭い針状プローブを用いて、ガラスの1辺または2辺を壊し、切り出した正方形を切り離します。立方相のボルスに注意しながら、ガラスカバーを慎重に持ち上げます。必要に応じて、クライオプロテクターを添加した沈殿剤溶液を数 µL 追加し、ウェル内で露出した立方相ボルスの上面に載せます。顕微鏡の倍率を上げ、結晶に焦点を合わせます。ハーベスティングループが見える十分な光量を維持しつつ、偏光板と検光板の角度を調整して、結晶と背景のコントラストを高めます。次に、過剰な脂質を除去し、結晶のサイズに合わせた直径のMightygenマイクロマウントを用いて、LCPから結晶を直接すくい上げて回収します。回収した結晶が入ったマイクロマウントを液体窒素で急冷し、X線データ収集のためシンクロトロン放射光施設へ輸送します。エンジニアリングされたβ2アドレナリン受容体をS-S Ia 3-NHSエステルで標識し、自動ハイスループットモードでのLCP-FRAP前結晶化アッセイに使用しました。このモードでは、96ウェルプレートの各サンプルを順次漂白し、30分間のインキュベーション後に蛍光回復を測定します。各サンプルの可動分画を表す得られた蛍光回復値を、全96サンプルについてプロットします。スクリーニング溶液は、0.1 M Tris pH 8、30% (v/v) PEG 400を含み、これに48種類の異なる塩を2つの異なる濃度で組み合わせています。いくつかの代表的な条件における蛍光回復プロファイルを示します。実線は正規化された強度対時間のフィッティング曲線を表しています。塩化ナトリウムを含むサンプルにおける10%未満の高速回復は、蛍光ラベル化された脂質に起因するものです。タンパク質と共に共精製し、硫酸ナトリウムおよびギ酸ナトリウムを含むLCP Frapによって特定された最も有望な条件の周辺で粗いグリッドスクリーニングを行った結果、ololと複合体を形成したβ2アドレナリン受容体の初期結晶が得られました。沈殿剤条件をさらに最適化することで、回折品質の結晶が得られました。ここでは、硫酸ナトリウムおよびギ酸カリウムの存在下で育成した結晶の画像を明視野モードで撮影しています。同じ結晶は、直交ニコル（クロスニコル）を用いて観察することもできます。習得すれば、脂質立方相へのタンパク質の再構成は10〜15分以内に完了でき、96ウェル結晶化プレートの手動セットアップは1時間以内に完了します。高スループットモードでのL three B wrapアッセイは、96ウェルプレート1枚あたり約2時間を要し、H結晶は1ウェルあたり約10〜20分かかります。このビデオで示す手順は、タンパク質結晶化試験に取り組むための基本的なガイドとなります。しかしながら、あらゆる結晶化実験と同様に、広範囲なスクリーニングと最適化が必要であり、必ずしも成功が保証されるわけではありません。

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