Name: 軸索の開発を制御する神経細胞の機械的な操作 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-04-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 2 s
Description: 学ぶ神経細胞の軸索を精密に引き伸ばしながら微小力を測定する手法。ガラス製マイクロニードルを用いて軸索の伸長動態とバイオ物理学的特性を解析し、神経発達のメカニズム解明に貢献します。

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我々は感謝してこの方法論の開発で博士ロバートE. Buxbaumの重要な貢献を認識する。

<ol><li>Zheng, J., Buxbaum, R. E., Heidemann, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurements+of+growth+cone+adhesion+to+culture+surfaces+by+micromanipulation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Measurements of growth cone adhesion to culture surfaces by micromanipulation.</a> J Cell Biol. 127, 2049-2060 (1994).</li>
<li>Chada, S., Lamoureux, P., Buxbaum, R. E., Heidemann, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytomechanics+of+neurite+outgrowth+from+chick+brain+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Cytomechanics of neurite outgrowth from chick brain neurons.</a> J Cell Sci. 110, 1179-1186 (1997).</li>
<li>Heidemann, S. R., Lamoureux, P., Buxbaum, R. E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHeidemann%2C+SR+%22The+Neuron+in+Tissue+Culture%22">The Neuron in Tissue Culture</a>. Haynes, L. W. , J. Wiley and Sons. 105-119 (1999).</li>
<li>Lamoureux, P., Altun-Gultekin, Z. F., Lin, C., Wagner, J. A., Heidemann, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rac+is+required+for+growth+cone+function+but+not+neurite+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Rac is required for growth cone function but not neurite assembly.</a> J Cell Sci. 110, 635-641 (1997).</li>
<li>Lamoureux, P., Ruthel, G., Buxbaum, R. E., Heidemann, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+tension+can+specify+axonal+fate+in+hippocampal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Mechanical tension can specify axonal fate in hippocampal neurons.</a> J Cell Biol. 159, 499-508 (2002).</li>
<li>Lamoureux, P., Heidemann, S. R., Martzke, N. R., Miller, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+and+elongation+within+and+along+the+axon%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Growth and elongation within and along the axon.</a> Dev Neurobiol. 70, 135-149 (2010).</li>
<li>Dennerll, T. J., Lamoureux, P., Buxbaum, R. E., Heidemann, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cytomechanics+of+axonal+elongation+and+retraction%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The cytomechanics of axonal elongation and retraction.</a> J Cell Biol. 109, 3073-3083 (1989).</li>
<li>Heidemann, S. R., Kaech, S., Buxbaum, R. E., Matus, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+observations+of+the+mechanical+behaviors+of+the+cytoskeleton+in+living+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Direct observations of the mechanical behaviors of the cytoskeleton in living fibroblasts.</a> J Cell Biol. 145, 109-122 (1999).</li>
<li>Yoneda, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Force+Exerted+by+a+Single+Cilium+of+Mytilus-Edulis+.1%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Biology%22%5BJournal%5D)">Force Exerted by a Single Cilium of Mytilus-Edulis .1.</a> Journal of Experimental Biology. 37, (1960).</li>
<li>Bray, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+Tension+Produced+by+Nerve-Cells+in+Tissue-Culture%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Mechanical Tension Produced by Nerve-Cells in Tissue-Culture.</a> Journal of Cell Science. 37, 391-410 (1979).</li>
<li>Pfister, B. J., Iwata, A., Meaney, D. F., Smith, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extreme+stretch+growth+of+integrated+axons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Extreme stretch growth of integrated axons.</a> J Neurosci. 24, 7978-7983 (2004).</li>
<li>Fass, J. N., Odde, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tensile+force-dependent+neurite+elicitation+via+anti-beta1+integrin+antibody-coated+magnetic+beads%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Tensile force-dependent neurite elicitation via anti-beta1 integrin antibody-coated magnetic beads.</a> Biophys J. 85, 623-636 (2003).</li>
<li>Yang, S., Saif, M. T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfabricated+Force+Sensors+and+Their+Applications+in+the+Study+of+Cell+Mechanical+Response%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Mech%22%5BJournal%5D)">Microfabricated Force Sensors and Their Applications in the Study of Cell Mechanical Response.</a> Exp Mech. 49, 135-151 (2009).</li>
<li>Bernal, R., Melo, F., Pullarkat, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drag+Force+as+a+Tool+to+Test+the+Active+Mechanical+Response+of+PC12+Neurites%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Drag Force as a Tool to Test the Active Mechanical Response of PC12 Neurites.</a> Biophysical Journal. 98, 515-523 (2010).</li>
<li>Lamoureux, P., Buxbaum, R. E., Heidemann, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+evidence+that+growth+cones+pull%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Direct evidence that growth cones pull.</a> Nature. 340, 159-162 (1989).</li>
<li>Heidemann, S. R., Lamoureux, P., Buxbaum, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+cone+behavior+and+production+of+traction+force%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Growth cone behavior and production of traction force.</a> J Cell Biol. 111, 1949-1957 (1990).</li>
<li>O'Toole, M., Lamoureux, P., Miller, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+physical+model+of+axonal+elongation%3A+force%2C+viscosity%2C+and+adhesions+govern+the+mode+of+outgrowth%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">A physical model of axonal elongation: force, viscosity, and adhesions govern the mode of outgrowth.</a> Biophys J. 94, 2610-2620 (2008).</li>
<li>Bray, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axonal+growth+in+response+to+experimentally+applied+mechanical+tension%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Axonal growth in response to experimentally applied mechanical tension.</a> Dev Biol. 102, 379-389 (1984).</li>
<li>Heidemann, S. R., Lamoureux, P., Ngo, K., Reynolds, M., Buxbaum, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Open-dish+incubator+for+live+cell+imaging+with+an+inverted+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Open-dish incubator for live cell imaging with an inverted microscope.</a> Biotechniques. 35, 708-708 (2003).</li>
</ol>

利害の衝突は宣言されません。

携帯電話の力を適用し、測定する技術は長い歴史9持っている。我々の方法は、もともと私たちと電動油圧装置10を用いて一定速度で&quot;けん引&quot;神経細胞に似たガラスの針を使用デニスブレイ、の作業が動機とされた。ステッピングモータ11、磁気ビーズ12、微細加工ビーム13と流体の流れ14：含まれる細胞に力を適用することの多くの代替手段があります。携帯プローブは最終的に知られている剛性の曲げビームに対して校正されている点で、後者は我々のアプローチに類似しており、細胞の測定は、光学顕微鏡観察によって異なります。他のアプローチと比較して、私たちの方法3の主な利点は、同時に生命科学部門の代表的な機器（顕微鏡とマニピュレーター）を使用してμdyne範囲で力を加えると、測定する機能です。 これらのメソッドを使用して、神経細胞成長円錐によって加えられる力は、それらは事前に15を測定されているとして。緊張に対応して軸索伸...

<table><tbody><tr><td>R-6 毛細管</td><td>Drummond Scientific</td><td>9-000-3111</td><td>R-6 ガラス 外径 0.9mm, 内径 0.6 mm, 8&quot;</td></tr><tr><td>BB-CH プラー</td><td>Mecanex S.A., Geneva, Switzerland</td><td>BB-CH puller</td><td>Mode 4 Altを使用、設定値 CP=100, PP=10, SP1=1000, SP2=1000</td></tr><tr><td>0.001&quot; クロメル線</td><td>Omega Engineering, Inc.</td><td>SPCH-001-50</td><td>シースなし、熱電対線、50ft スプール（現名称 Chromega）</td></tr><tr><td>0.003&quot; コンスタン線</td><td>Omega Engineering, Inc.</td><td>SPCI-003-50</td><td>シースなし、熱電対線、50 ft スプール</td></tr><tr><td>精密ピンセット</td><td>Fine Science Tools</td><td>91150-20</td><td>Dumont Inox #5</td></tr><tr><td>汎用顕微鏡ブームスタンド</td><td>Nikon Instruments</td><td>76135 or 90430</td><td>ほとんどのブランドや種類のブームスタンドが本用途に使用可能</td></tr><tr><td>機械式マイクロマニピュレーター</td><td>Narishige International</td><td>M-152</td><td>3軸ダイレクトドライブ粗動マイクロマニピュレーター</td></tr><tr><td>油圧式マイクロマニピュレーター</td><td>Narishige International</td><td>MO-203</td><td>現在はMMO-203として提供、3軸可動タイプ</td></tr><tr><td>ニードルホルダー</td><td>Leica Microsystems</td><td>11520145</td><td>3個セット</td></tr><tr><td>シングルインストルメントホルダー</td><td>Leica Microsystems</td><td>11520142</td><td></td></tr><tr><td>ダブルインストルメントホルダー</td><td>Leica Microsystems</td><td>11520143</td><td></td></tr><tr><td>機械式マイクロマニピュレーター</td><td>Leica Microsystems</td><td>39430001</td><td>ポストマウント、プローブホルダー1個、RH Model 430001</td></tr><tr><td>ジョイスティック式機械的マイクロマニピュレーター</td><td>Leica Microsystems</td><td>11520137</td><td></td></tr><tr><td>Leica DM IRB</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td>倒立顕微鏡</td></tr><tr><td>Vibraplane 除振台</td><td>Kinetic Systems</td><td>1200 シリーズ</td><td>使用モデルは 1201-02-12</td></tr><tr><td>Ringcubator</td><td>自作（参考文献19を参照）</td><td></td><td>参考文献19、以下に記載の更新済みコントローラーが必要</td></tr><tr><td>プログラマブル温度コントローラー</td><td>Instrumart.com</td><td>Fuji Electric PXR3</td><td>廃止された PXV3 温度コントローラーの後継機</td></tr><tr><td>Nikon Diaphot TMD</td><td>Nikon Instruments</td><td></td><td>倒立顕微鏡（1980年頃）</td></tr><tr><td>Nikon SMZ-10 双眼解剖顕微鏡</td><td>Nikon Instruments</td><td></td><td>他の解剖顕微鏡でも代用可能</td></tr></tbody></table>

軸索の開発を制御する神経細胞の機械的な操作

Mechanical Manipulation of Neurons to Control Axonal Development

セルの操作と神経軸索の延長は、10から1000μdyne範囲の1,2の力を測定し、適用可能な校正済みガラスのマイクロファイバーを使用して行うことができます。力の測定は、直接、経験的な方法3によって校正されているガラス針の曲げHookeanの観察を通して得られる。 、製造校正、治療、および細胞に針を使用するための機器の要件と手順が詳しく説明されています。力は、これらの技術は方法論の柔軟性を示すが適用されていると、将来の検討4-6の例として与えられるために以前に使用し、異なる細胞型の制度。技術的な利点は、操作によって生成される力の継続的な&quot;可視化&quot;し、直接携帯電話のさまざまなイベントに介入できることです。と同様に剥離し、培養細胞8の任意のタイプの機械的な測定は、これらは直接的な刺激や軸索の成長と収縮7の規定が含まれています。

アプリケーションと2000から1000 microdyneの範囲内のニューロンに作用する力の直接測定は、校正済みのガラス針を用いて高精度で実現されています。この方法論は、軸索の開始、軸索張力、軸索伸長の速度、および力ベクトルを含む、軸索の開発のいくつかの側面を、制御および測定に使用することができます。

校正済みのガラスマイクロファイバーを用いることで、細胞操作や神経軸索の伸展が可能であり、これにより...における力の測定および印加を行うことができます。

この実験の目的は、力を正確に測定しながら軸索を伸展させることです。これは、直接校正された基準ワイヤー針を作成し、基準ワイヤー針の校正を経て、目的の力範囲における校正用、中間用、および作動用の針を準備することで達成されます。次に、作動用針を用いて成長円錐を牽引し、軸索を伸長させます。得られた軸索の伸展を記録し、校正済みニードルの屈曲に基づいて力を測定します。この手法により、軸索伸展の生物物理学に関する重要な疑問に答えることができます。まず、調整可能なマイクロニードルプラーとガラスキャピラリーチューブを用いて、先端がテーパー状になった長さ約4 mmのニードルを作製します。ニードルを蓋付きの160 mmのペトリ皿に保管します。次に、先端を折ったガラスニードルの内部に0.001 inchのクロマル線を挿入し、校正用ニードルを作成します。ワイヤーを先端から26 mmの長さまで引き出し、瞬間接着剤で固定します。ワイヤーの遠位1mmを曲げてフック状にします。次に、0.003インチの一定径のワイヤー1mからマイクロウェイトを作製します。ワイヤーを測定する際は、定規にテープで固定してください。できるだけ真っ直ぐにするため、1 mのワイヤーを計量し、正確に1 cmずつの長さに切断します。切断したワイヤーの数本を花瓶の形に曲げます。ワイヤーニードルのキャリブレーションには、測定用垂直スケールを備えた解剖顕微鏡とマイクロマニピュレーターが必要です。顕微鏡を側面に90度傾けて設置します。ユニバーサルブームスタンドを使用し、ワイヤーニードルの下方へのたわみを観察できるようにします。マイクロマニピュレーターのツールホルダーにワイヤーニードルを取り付け、顕微鏡の光軸に対して垂直になるように配置します。ワイヤーニードルのフックを目盛線に合わせます。フックに1 cmのマイクロウェイトを吊るし、たわみを記録します。参照ワイヤの曲げ定数は、マイクロウェイトの質量を観察されたたわみ量で除した値に等しくなります。校正後、カミソリを用いてウェイポイントにあるフックを切り取り、中間ガラス針を校正するための準備をしてください。接眼レンズ付きの倒立顕微鏡が必要です。顕微鏡ステージの一方には、ワイヤーニードルを固定するためのメカニカルマイクロマニピュレーターがあります。もう一方には、中間ガラスニードルを移動させるための油圧式マイクロマニピュレーターがあります。マイクロマニピュレーターを用いて校正を行い、10倍の視野において、水を入れた160 mm × 30 mmのペトリ皿の中心で、両方のニードルを45度の角度で接近させます。次に、一連の偏向操作を行い、それぞれの偏向について測定します。リリース後のガラス針の初期たわみ量と、最終的な荷重ゼロ位置を記録します。これにより10組のデータポイントが得られます。線形回帰に

mechanical-manipulation-of-neurons-to-control-axonal-development

Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

ユニークな組織工学の手法は、軸索の伸長の成長をrecapitulatingで培養中の多数の神経線維を伸長するために開発された、神経は大きくするには身体の成長と一緒に細長いそれによって神経系の成長の形。...

軸索のストレッチの成長：神経成長のメカノトランスダ

培養大人の背根神経節ニューロンの軸索再生の遺伝学的研究

神経細胞の形態形成および移行が適切な脳の発達の基礎となる重要なイベントです。ここでは、遺伝的に培養した小脳顆粒ニューロンおよび形態や神経細胞の遊走特性の評価のための開発小脳を操作する方法を説明します。...

小脳顆粒ニューロンの遺伝子操作<em&gt;体外</em&gt;と<em&gt;インビボ</em&gt;ニューロンの形態と移行を研究するために、

レーザーnanodissectionに結合された2つの光子イメージングは​​、細胞内の分解能で中枢神経系の変性と再生のプロセスを研究するための有用なツールである。このプロトコルは、ラベル画像、およびin vivoでの小脳皮質内の単一の登山繊維を分析する方法を示しています。...

小脳軸索のレーザーNanosurgery<em&gt;インビボ</em

光学顕微鏡技術と生化学的アッセイを組み合わせることで、ネトリン依存性軸索分岐におけるSNARE媒介性エキソサイトーシスの関与を解明します。この技術の組み合わせにより、軸索の分岐と細胞形状の変化を制御する分子メカニズムの同定が可能になります。...

軸索分岐と神経形態形成中に形質膜配信の役割を定義するために組み合わせる方法論を活用

このプロトコルは、ラットから分離された後根神経節(DRG)ニューロンの単離と、軸索の整列を強化するための静的なプレストレッチ細胞培養システム上でのDRGニューロンの培養、そしてその後のシュワン細胞(SC)の共培養による髄鞘形成を促進することを説明しています。...

後根神経節ニューロンのアライメントや髄鞘形成を強化するためのアプローチ

この原稿では、微細組織工学ニューラルネットワークの作成について詳しく述べる。三次元のミクロンサイズの構造物は、管状ヒドロゲルに包まれた凝集ニューロン集団にまたがる長い整列した軸索路からなる。これらの生存足場は、神経回路を再構成または調節するための機能的中継として、または灰白色物質の神経解剖学を模倣するバイオフィリックテストベッドとして役立ち得る。...

神経系の再構築、変調、モデリングのための解剖学的にインスパイアされた3次元マイクロ組織工学ニューラルネットワーク

この手順は、神経突起の伸長を誘導するマイクロピペットに固定されたポリ-D-リシン被覆ビーズを使用して、マイクロ流体チャンバーに組織化された神経突起を迅速に開始、伸長および連結する方法を記載する。...

ニューロン回路の再学習：速い神経突起伸長と機能的ニューロン結合の新しい方法

神経突起伸長アッセイは、再生ニューロンプロセスに関する定量的な値を提供します。この半自動ソフトウェアの利点は、マスクを作成することで細胞体と神経突起を別々にセグメント化し、神経突起の長さ、分岐点の数、細胞体クラスター面積、細胞クラスター数などのさまざまなパラメータを測定できることです。...

神経突起伸長測定のための新しい半自動ソフトウェアの標準化 

このプロトコルは、軸索損傷後のニューロン代謝ダイナミクスをモデル化するマイクロ流体システムを記述し、内因性代謝リモデリングのイメージング、マルチオミクス分析、およびメカニズム研究を可能にします。...

軸索損傷モデル用マイクロ流体チップの構築とマルチオミクス解析の実現

学ぶ神経細胞の軸索を精密に引き伸ばしながら微小力を測定する手法。ガラス製マイクロニードルを用いて軸索の伸長動態とバイオ物理学的特性を解析し、神経発達のメカニズム解明に貢献します。

軸索の開発を制御する神経細胞の機械的な操作

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