C2C12筋芽細胞を用いた生体エネルギープロファイル実験

本実験の総合的な目的は、XF 96 extracellular flux analyzerを用いて酸化代謝の複数のパラメータを測定し、生細胞および単離ミトコンドリアにおけるミトコンドリアの機能状態を検証することである。これらのパラメータには、基礎呼吸、ATPターンオーバー、プロトンリーク、および最大呼吸能（予備呼吸能）が含まれる。これは、C2C12筋芽細胞にミトコンドリア呼吸の特異的モジュレーターを順次添加し、呼吸の指標である酸素消費速度（OCR）、および解糖系を通じてATPを生成するグルコースから乳酸への変換を測定することによって達成される。

細胞におけるもう一つの主要なエネルギー経路は、ECAR（細胞外酸性化速度）として測定されます。ミトコンドリアのプロファイリング結果を得ることで、細胞の寿命を決定する上でミトコンドリア機能が果たす中心的な役割についての知見を得ることができます。こんにちは、私はデビッド・ニコルズです。

私はキャリアを通じてミトコンドリアの研究に携わってきましたが、私の研究において最も重要な装置は酸素電極でした。単離ミトコンドリアを用いて、さまざまな条件下での酸素摂取率を測定できれば、極めて重要な膨大な情報を得ることができます。しかし、細胞、特にマルチウェルプレートやカバーガラスで培養された細胞を対象とする場合、従来の手法は機能しません。

これは重大な課題でしたが、数年前にマルチウェルプレートアッセイが開発されたことで、マルチウェルプレート形式で細胞の呼吸を並行して解析することが可能となり、克服されました。本日ご紹介するのは、培養細胞における基本的なミトコンドリアバイオエナジェティクス機能をモニタリングするために考案した、非常にシンプルでありながら情報量の多い実験です。まず、XF 96細胞培養プレートに、1ウェルあたり10,000個の細胞を100 µLの増殖培地で播種し、37 °C、10% CO2のインキュベーター内に安置します。

細胞の播種から24時間後に、XF 96を用いてアッセイを行うことができます。アッセイウィザードで、以下のグループレイアウトを持つテンプレートを作成します。1列目から12列目まで、すべてに10,000個のC2C12細胞を分注します。

青色で示されたグループ1をコントロール細胞として使用します。赤色で示されたグループ2には、oligo Mycin、FCCP、およびrooneの薬剤を投与します。次に、プロトコルの記述部分に従い、X-F-D-M-E-Mアッセイ培地を用いて化合物を調製します。

Oligo Mycin、FCCP、およびrotten knownは、XF cell MIT stress test kitにあらかじめ分注されています。XF prep stationを用いて、増殖培地をDMEM running mediumに置換します。

最後に、細胞を二酸化炭素を含まない37 °Cのインキュベーターで60分間インキュベートし、センサーカートリッジに注入する化合物を添加する前に、細胞をアッセイ培地で予備平衡化させます。この際、化合物も37 °Cに温めておきます。その後、以下のようにインジェクターポートにロードします。カラム1から4については、ポートA、B、Cにそれぞれ16 µL、18 µL、20 µLのXFアッセイ培地またはDMEMをロードします。

5列目から12列目まで、ポートAにalliga mycinを16 µL、ポートBにFCCPを18 µL、ポートCにrot knownを20 µLロードします。次に、プロトコルコマンドを定義し、ループ回数を3回に設定します。混合時間を3分、測定時間を3分に設定します。最後に、「スタート」をクリックします。

画面上の指示に従い、キャリブレーション完了後にカートリッジをロードするタイミングを確認してください。ユーザープロンプトに従って、実験用のセルプレートを追加します。その後、「continue」をクリックしてアッセイを開始してください。

実験が終了したらプレートを取り出します。このアッセイは、ミトコンドリア機能をプロファイリングするための古典的な実験に基づいたものであり、細胞代謝、ミトコンドリア機能、および全般的なバイオエナジェティクス活性に対するさまざまな化合物の影響を理解することを目的とした、より複雑な実験を構築するための枠組みとして機能します。ここでは、各化合物を順次処理した際の酸素消費速度における期待通りの反応を観察しました。

Ligamycinによってミトコンドリア複合体VでのATP合成が阻害された結果、ATP量は減少しました。Ligamycin処理後、細胞は酸化リン酸化によるATP合成ができなくなったため、ATP需要を満たすために糖新生へと切り替わりました。その結果、既報の通り、糖新生の指標であるECAR（細胞外酸性化速度）の上昇が観察されました。FCCPは脱共役剤として作用し、プロトン再流入の制限を取り除きます。

呼吸が加速し、現在は電子伝達によって制限されています。最後に、ロテンノンがミトコンドリア複合体Iを阻害し、これにより電子伝達系における電子の流れが停止するため、酸素消費量が劇的に減少します。ここでは、細胞の基礎呼吸、ATP産生に充てられる酸素消費率、およびプロトンリークによるプロトン勾配の維持に充てられる量の情報が得られます。

さらに、非共役呼吸条件下での最大呼吸速度を求めることができます。これは、予備呼吸能と呼ばれることもあります。そして最後に、ミトコンドリア以外のプロセスによる酸素消費量を決定できます。以上が、Seahorseを用いた測定手順です。

XF 96は、細胞内ミトコンドリアのBIEエネルギー論に関する膨大な情報を提供する一連の実験です。非常に重要な基本実験である「実験番号1」では、基礎呼吸、ATPターンオーバー、ミトコンドリアプロトンリーク、および予備呼吸能に関する情報を得ることができます。これらのパラメータにより、細胞内ミトコンドリアのバイオエナジェティクス状態に関する基礎的な情報を把握することが可能です。