オーラルバイオフィルムの包括的、生化学的構造とトランスクリプトーム評価のための分析ツールボックスは、ミュータンス連鎖球菌によって仲介

歯の表面に形成されるバイオフィルムは、非常に複雑で構造化されています。細胞外マトリックスに絡み合った微生物群集は、絶え間ない環境問題にさらされています。ここでの全体的な目標は、新しい蛍光イメージング技術とデータ処理および分析用のカスタムメイドソフトウェアを組み合わせることで、経口バイオフィルムの複雑な性質を考慮して、構造および分子研究を容易にするように設計された分析ツールボックスの2つの特定のコンポーネントを示すことです。

これは、まず、EPSと細菌を同時に可視化するための新しい共焦点イメージングアプローチを含む、バイオフィルム、トランスクリプトーム、および構造解析のための特定のアッセイを選択することによって達成されます。手順の2番目のステップは、バイオアッセイから生データを収集することです。3番目のステップは、共局在分析用に新しく開発されたduo statを含む特定のソフトウェアを使用して生データを処理することです。

最後のステップは、マイクロアレイデータマイニングおよび組織化ソフトウェアマイクロアレイ、データビジュアライザー、またはMDVの使用を含むプロセスデータの分析です。最終的には、経口病原体が複雑な食事、宿主微生物の相互作用に応答してバイオフィルムの構造をどのように変化させるかを示す結果を、当社独自の統合分析ツールボックスを使用して取得し、より包括的なバイオフィルム分析とデータ解釈を提供します。こんにちは、私の名前はミシェル・クーで、ここユニバーサル・オブ・ロチェスター・メディカル・センターのフォラル生物学の准教授です。

本日は、バイオフィルム分析のための分析ツールボックスをご紹介します。このツールボックスは、バイオフィルム細胞がどのように構造化され、細胞外マトリックスとともに配置されているか、トランスクリプトームレベルでの複雑な環境課題にどのように応答するかなど、バイオフィルム研究の分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。私の名前はジーン、彼女、Dr.Ks研究室のポスドクフェローです。

今日は、ツールボックスのイメージング部分のデモンストレーションを行います。こんにちは、Aise Kleinです。Dr.Ks研究室の助教です。

本日は、マイクロレイデータ解析用のMDVソフトウェアについてご紹介します。この手順では、唾液でコーティングされたヒドロキシ食欲円盤を歯の表面の代理として使用し、その上にバイオフィルムを成長させます。まず、デキストリン標識LOR 6 47色素でプレートを光から保護する24ウェルプレートの各ウェルにS変異体を接種した2.8ミリリットルの培養培地を各ウェルに最終濃度1マイクロモルまで加え、ピペットで数回上下させて色素を培地に混合する。

次に、滅菌鉗子ディップを使用して、滅菌唾液でコーティングされたヒドロキシアパタイトディスクを滅菌ABバッファーで2回洗浄し、余分な唾液または結合していない唾液成分を除去します。次に、色素を添加した培地にディスクを垂直に置き、各ディスクが完全に沈んでいることを確認します。プレートをアルミホイルで覆い、5%二酸化炭素インキュベーターで摂氏37度で20時間インキュベートして、バイオフィルムを形成し、共役テクスチャを細菌細胞が産生するエキソ多糖類に組み込むようにします。

最初に細菌細胞を標識するには、ウェルあたり2.8ミリリットルの滅菌ミリQ水を含む24ウェルプレートを準備します。各ウェルに1.5マイクロリットルのCyto Nine色素を最終濃度1マイクロモルまで添加し、プレートを光から保護します。バイオフィルムが形成されたら、ディスクを含むプレートをインキュベーターディップから取り外します。

各ディスクを0.89%塩化ナトリウムの溶液で洗浄します。次に、それらをCyto Nine色素を含む新しいプレートに移します。プレートをアルミホイルで覆い、室温で30分間インキュベー

細胞を染色したら、以前と同様にバイオフィルムと塩化ナトリウムを洗浄します。次に、鉗子を使用して、バイオフィルムをワイヤーから塩化ナトリウムを含むシャーレに放出します。シャーレをアルミホイルで包みます。

バイオフィルムは、レーザー走査型共焦点顕微鏡を使用した共焦点顕微鏡による可視化の準備が整いました。ランダムに選択した5〜10の位置で各バイオフィルムをスキャンし、各位置でZシリーズを生成します。3D再構成を可能にするには、共焦点画像を開き、ミラーソフトウェアを使用して処理します。

このプログラムを使用して生成された共焦点画像の3次元レンダリングであるAmiraは、実証された手順を使用して無関心な表面上に形成されたS変異体のバイオフィルムを示しています。細菌細胞とマイクロコロニーは緑色で見え、エクソ多糖類を含むバイオフィルムマトリックスに埋め込まれています。赤では、選択した領域のクローズアップビューを生成でき、特定の細菌のEPS構造関係をミクロスケールで示しています。

デュオスタットプログラムを使用して、バクテリアやエクソ多糖類などの個別のバイオフィルム成分の共局在量を定量化します。まず、MATLABバージョン5.1で新しく開発されたduo statのパスを設定し、2つのバイオフィルムコンポーネントのZシリーズ画像を含む画像フォルダーを開きます。次に、相関させて解析する2つのチャンネルを選択します。

2 つの画像スタックは、すべての寸法で同じピクセル サイズを持ち、各スタックで同じ数の画像を持つ必要があります。各チャンネルのしきい値を設定し、ソフトウェアインターフェースの指示に従って、データをデータ処理に入力します file 分析のために。この図は、duo stackがバクテリアとDBSの空間的関係を定量的に解釈する方法を示しています。

バイオフィルム内では、Duoスタックは、細菌の緑の線とEPSの赤の線に見られるように、椎間板表面から液相までの細菌とDPSの垂直分布を計算します。また、バイオフィルムの厚さ全体にわたる細菌とDPSの共局在も計算します。黄色の線で示されているように、データはバイオフィルムの深さ全体で細菌よりもEPSの割合が高いことを示しており、特に中間層から、特に3Dレンダリングを備えたDuo統計まで、EPSに関連しています。

バイオフィルムから高品質なRNAを得るためには、2007年に発表されたCurian KUの論文に記載されているバイオフィルム特有のプロトコールに従ってRNA抽出を行うことを推奨します。このジャーナルでは、CD NAマイクロアレイの調製と定量的リアルタイムPCRアッセイに分析生化学標準プロトコルが使用されています。マイクロアレイ実験によって生成された大規模なデータセットの分析を容易にするために、データマイニングおよび整理ソフトウェアであるマイクロアレイデータビジュアライザーまたはMDVを設計し、www.oralgen.anl.gov でオンラインで入手できます。

データをMDVに送信する前に、クラス比較のためにカットオフP値0.001でオンラインで利用可能なBRBアレイツールソフトウェアを使用して、ランダム分散モデルを持つ対応のあるT検定のような統計分析を実行します。この羊肉の分析例では、3つの異なる糖濃度と4つの時点で成長したバイオフィルムが行われました。対応比較は、条件A:0.5%スクロースと1%デンプン対1%スクロース、条件B、0.5%スクロースと1%デンプン、0.5%スクロース、および条件C:0.5%スクロース対1%スクロースの3つのBRBファイルから、ペア比較を行った。

このパネルは、BRBアレイツールを用いた標準クラス比較により評価された各条件および時点において差次的に発現した遺伝子として検出された遺伝子の数を表しており、その結果、BRB生データと名付けられた多数の遺伝子が得られます。MDVのデモでは、Excelを使用して30時間の時点に焦点を当てます。BRBの生データをMDVタブ限定のテキストファイルに変換します。

遺伝子座タブ番号に付随するすべての文字、たとえばSMUドット1432 C.文字Cを削除して、MDVを開きます。ファイルメニューを開き、[注釈ソースの選択]を選択します。ダイアログボックスが表示されたら、フラットファイルオプションを選択します。

参照ボタンを使用して、遺伝子オントロジー、番号、経路、機能分類データ、および遺伝子名のアノテーションを含むファイルを選択します。ファイルに移動し、MDV形式に変換された各ファイルをインポートします。各ファイルは実験条件を表します。

ベン図機能を使用して、各実験条件 A と B C.In の例で発現する遺伝子を比較します。このデモンストレーションでは、ショ糖とデンプンの組み合わせの影響に一意に関連する発現差のある遺伝子に焦点を当てます。ベン図ベースの機能は、これらの異なる条件下で発現するユニークで共有された遺伝子の数を視覚化するために使用され、さらなる分析のために選択される遺伝子を特定するのに役立ちます。

ここでは、条件AおよびBで一意である差次的に発現する遺伝子のみを選択し、ここに示すように灰色で示されているようにCで検出される遺伝子は選択しません。MDVは、解析する遺伝子の総数を大幅に減らすと同時に、実験ケースに関連しない遺伝子を除外しました。ファイルメニューから、データを保存するためのエクスポートオプションを選択します。

タブ限定ファイルとして、ファイルをExcelで開き、データ出力を整理して目的のグラフィック表示に変換できます。Excelのデータ編成により、MDV出力をグラフィカルに表示できます。このグラフは、バイオフィルム発生の異なる段階でデンプンとスクロースの組み合わせによって影響を受ける遺伝子のユニークな機能サブセットの発現差の概要を示しています。

S変異体のトランスクリプトームへの影響は、バイオフィルムの現像が30時間経過した時点で、他の時点よりも顕著になります。この出力は、遺伝子選択とさらなる検証プロセスを促進した時間的影響を考慮して、私たちの作業仮説に関連する遺伝子の特定の機能サブセットを正確に特定するのに役立ちました。この手順に続いて、バイオフィルム内の生物の特定の生理学的および代謝的応答は何かなどの追加の質問に答えるために、生化学的およびプロテオミクス的方法も実行できます。

このような包括的で統合された分析は、バイオフィルムが非常にダイナミックで複雑な環境である屋内腔内の病原性をどのように調節するかをさらに理解するのに確実に役立つでしょう。詳しくは、こちらの動画記事に添付されているPDFファイルをご確認ください。