エアー液界面におけるマウスの呼吸器上皮細胞と実験たばこの煙への暴露の分離

この手順の目的は、タバコ煙曝露による毒性影響を研究するために、気道上皮細胞を単離することです。まずマウスの気管を摘出し、次いでプロナーゼ溶液で気管を消化することでこれを達成します。手順の第2段階では、上皮細胞を回収し、培養液を増殖させます。

第3のステップは、気液界面（air liquid interface）で培養物を分化させることです。本手順の最終ステップは、気液界面において上皮細胞を頂端側からタバコ煙に曝露させることです。最終的に、免疫蛍光顕微鏡観察により、完全に分化した上皮細胞の単層が形成された結果を得ることができます。

この手法は、慢性閉塞性肺疾患の分野における重要な課題、例えばタバコ煙への曝露がCLIA形態に及ぼす影響や、タバコ煙によって誘発される細胞傷害の生化学的マーカーなどの解明に寄与します。本手順の準備は、解剖の前日にハムF-12培地の調製から開始してください。抗生物質含有ハムF-12培地、および抗生物質含有20% FBS-MTEC基礎培地を準備します。

書面の手順書に従い、5% FBS含有MTEC培地、DNA's one solution、レチノイン酸ストック溶液、およびMTEC増殖培地を調製します。解剖当日に、解剖に使用するすべての手術器具を滅菌してください。解剖エリアが清潔であること、およびすべての解剖器具がすぐに使用できる状態で揃っていることを確認してください。

組織培養フード内を滅菌します。その後、組織培養フード内で作業を行います。0.15% pronase溶液を調製します。

50 mLのコニカルチューブに、抗生物質を含む10 mLのhams. F 12培地と15 mgのプロナーゼを加えます。使用時まで氷上に置いておきます。

標準的な手術手順を用いて、マウスから気管を摘出します。気管が入ったチューブを消毒し、組織培養フード内に配置します。気管組織を、抗生物質を含むhams F 12培地が入った100 mmのペトリ皿に移します。滅菌済みの手術用ピンセットを使用して、気管から結合組織を除去します。

次に、洗浄した気管を、抗生物質を含むhams. F 12培地を入れた2枚目の100 millimeter Petri dishに転移させます。解剖用ハサミを用いて気管を垂直軸に沿って切断し、管腔を露出させます。

気管を10 mLのPronase溶液が入った50 mL遠心チューブに移し、冷蔵庫に入れて4 °Cで一晩インキュベートします。最後に、コラーゲンI処理済みのトランスウェルプレートを準備します。翌日、0.02 N酢酸1 mLあたり50 mgのコラーゲンIを加え、この溶液を12ウェルプレートの各ウェルに1 mLずつピペッティングします。

ウェルプレートを洗浄します。プレートをパラフィルムで包み、組織培養用クリーンベンチ内で一晩室温に置きます。翌日。

マウス気管が入ったチューブを、ゆっくりと10〜12回転倒混和させます。その後、チューブの内容物を4°Cでさらに30〜60分間インキュベートします。組織培養フード内で、抗生物質および20% FBSを含むHams F12培地10 mLを、消化した気管組織が入ったコニカルチューブにピペットで加え、12回転倒混和させます。

次に、抗生物質と20% FBSを含む hams F 12 培地を 10 milliliters ずつ、3本の 15 milliliter コニカルチューブに分注します。滅菌済みのパステールピペットを使用して、プロナーゼ溶液から気管組織を、添加済み hams F 12 培地が入った1本目のチューブに移します。

Pronase溶液を氷上に置き、気管組織の入ったチューブにキャップをして、ゆっくりと12回反転させて混ぜ合わせます。次に、パスタピペットを用いて、気管組織を2本目の15 mLコニカルチューブに移し、このチューブを12回反転させます。最後の15 mLコニカルチューブを用いて、同様の移送および反転の手順を繰り返します。

最後に、パスタピペットを使用して気管組織を除去し、廃棄します。次に、氷からプロナーゼ溶液を取り出し、添加済みのHams F 12培地15 mLを3量分、プロナーゼ溶液と合わせます。サンプルを冷却遠心機を用い、4 °Cで1,400 rpmで10分間遠心分離します。遠心分離後、上清を廃棄し、気管1つにつき約100～200 µLのDNAase I溶液をペレットに分注して再懸濁します。

軽くタッピングして懸濁させる。細胞を氷上で5分間インキュベートする。チューブを4 °Cで1,400 rpmで5分間遠心分離し、上清を捨てる。

次に、10%FBSを含むMTEC培地を8mLピペットでペレットに加え、プレートを再懸濁します。パリアプレート上の細胞懸濁液を、37°C、95%空気および5%二酸化炭素の条件下で5〜6時間インキュベートします。これは、線維芽細胞を除去するためのネガティブセレクションステップです。

インキュベーション後、パリアプレートから細胞懸濁液を回収し、50 mLコニカルチューブにピペットで移します。次に、10% FBSを含むMTEC培地 4 mLでプレートを2回洗浄します。2回分の洗浄液を、細胞懸濁液が入った50 mLコニカルチューブに加えます。

細胞懸濁液を1 mL、エッペンドルフチューブに分注します。この分注分は、サイトスピン分析および細胞数計数用に保存しておきます。残りの15 mLの細胞懸濁液が入った50 mLコニカルチューブを、4 °Cで1,400 rpm、10分間遠心分離します。

遠心分離の間、あらかじめ準備したトランスウェルプレートからコラーゲン溶液を取り除き、廃棄します。プレートをフード内で5分間乾燥させ、最後にPBSで2回洗浄します。すべてのPBSを吸引し、遠心分離後、トランスウェルの下部コンパートメントに1.5 millilitersの増殖培地をピペットで加えます。

上清を廃棄し、1ウェルあたり500 µLの懸濁液中に7.5 × 10⁴〜1 × 10⁵個の細胞を播種できるよう、適切な量の増殖培地で細胞ペレットを再懸濁します。細胞懸濁液500 µLをTranswellポリカーボネートメンブレンインサートの頂端面にピペッティングします。浸漬させたMTEC培養物を、95%空気および5%二酸化炭素を含む37 °Cの加湿インキュベーター内で7〜10日間培養し、1日おきに培地を交換します。

インターバロメーターを用いて経上皮電気抵抗を測定します。上皮抵抗が1000 ohms/cm²に達し、培養細胞がコンフルエントになったことを確認してください。その後、アピカル側の培地を除去し、LI（液-気界面）培養に移行させます。

また、基礎培地を2%の新血清およびレチノイン酸を含むMTEC基本培地に交換します。培地交換を1日おきに行いながら、37 °C、5% CO₂条件下で10〜14日間培養し、分化させます。まず、製造元の指示に従って喫煙装置をセットアップします。

未使用のポールフレックスフィルターの重量を記録します。次に、喫煙室のサンプリングポートから定流量ポンプへと続くサンプリングチューブ上のインラインステンレス製ホルダーに、フィルターを設置します。CSセル曝露システムを用い、流出チューブを使用してサンプリングユニットをガスメーターに接続します。

Transworld培養物の頂端側を、3R 4Fリサーチリファレンスフィルターシガレットからの主流煙に曝露させます。細胞を1本から2本のシガレットの煙に曝露させます。対照群の培養物は、ガスサンプリングによる重量増加後、同等の曝露時間 동안室気（ルームエアー）に曝露させます。

プールフレックスフィルターを用い、フィルターに堆積した材料の総量をミリグラム単位で正規化します。サンプリングした空気の総量に対して、通常1〜2本のタバコの煙から1立方メートルあたり100〜200 mgのTPMが得られます。タバコへの曝露後、細胞および基礎培地を回収し、さらなる解析に供します。

これは、核および上皮細胞マーカー、およびCマーカーで染色された、マウス呼吸器上皮細胞の健全な単層の例です。上皮細胞の分離、増殖、および分化が成功すると、石畳状の形態を持つ完全な単層が形成されます。これらの培養物は、実質的に線維芽細胞を含んでいません。

これらの電子顕微鏡写真は、健康なMTEC培養の代表的な例であり、さまざまな細胞型の微細構造およびCELIA形態を示しています。この生細胞イメージングビデオでは、MTEC培養の健康なC形態を示しています。このビデオを視聴することで、マウス気管上皮細胞の単離方法、気液界面での分化誘導、および主流タバコ煙への曝露方法について十分に理解できるはずです。