Name: バインディング機構を決定するために、可変濃度等温滴定熱量計のデータセットの収集 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-04-07T11:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 4 s
Description: 学ぶ等温滴定熱量計（ITC）を用いて、マクロ分子とリガンドの結合モデルと熱力学的パラメータを決定する方法。複数濃度のデータセット収集により、正確な結合機構の解明が可能となる。

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この作品は、カナダのヘルスリサーチの研究所（CIHR）、国立科学と工学研究評議会（NSERC）、およびCIHR訓練助成金（LFへ）によってサポートされていました。私たちは、AACのための教授ジェラルドD.ライト（マクマスター大学、カナダ）（6）- IIの発現は、プラスミド感謝。

1。ストック溶液を準備する<ol><li>興味のある高分子を精製する。 （このケースでは、アミノ配糖体N - 6' -アセチルトランスフェラーゼ- II（AAC6' - II）は、他の場所で報告されたとして単離される。13） </li><li>透析バッファー4リットルを準備します。 （このケースでは、25mMの4使用 - （2 - ヒドロキシエチル）-1 - piperazineethanesulfonic酸（HEPES、MW 238.3グラム/モル）、2 mMのエチレンジアミン四酢酸（EDTA、MW 292.2）を含む、pH7.5で。） </li><li>タンパク質を透析に使用AAC（6'）- IIのサンプル（400μMで5mL）を透析緩衝液（3 × 1.3 L）中で透析する必要があります。最終的な透析液は、機械を洗浄するとサンプルを希釈するために保持されます。 </li><li> 0.45μmのセルロースフィルターを通して最終的な透析液をフィルタリングし、4℃で保存"実行中のバッファ"と呼ぶことにする</li><li>実行中のバッファで十分にリンスされている0.2μmのシリンジフィルターを通してフィルタータンパク質溶液。標準アッセイ（Bradford、Lowry法、等）またはUV吸光度を用いてタンパク質の最終濃度を測定する。長期的な安定性を最大化するタンパク質を保管してください。 （AAC（6の場合には"）- II、4でこの手段の記憶℃、AAC（6'）- IIは、凍結融解後の活性を保持していません）。 </li><li>バッファを実行するには4.0 mgを溶解することによってアセチル補酵素Aの25mMのストック溶液（AcCoA、リガンド、MW 809.57）の200μLを準備します。 -78℃で凍結℃で使用可能な状態になるまで。 </li><li>すべての蛋白質とリガンドのサンプルは、濃度のランダムなサンプル間の変動を最小限に抑えるために、同じストック溶液から発信される必要があります。全体の変数に- cデータセット間のタンパク質濃度に対して1つの補正係数は、解析に調整されます。10 </li></ol> 2。準備ITCサンプル<ol><li> 2 mLの最終容積で64のcの値に酵素溶液を希釈する。 （AAC（6'）- IIの場合には、これは192μMに相当する。） </li><li>すぐに氷水のリガンド（AcCoA）ストック溶液を解凍。 </li><li> 10倍以上のAcCoA溶液0.5 mLを準備するバッファを実行して、420μLでAcCoAストック溶液80μLを希釈することにより、この場合は4 mMの、蛋白質にして結合部位の数を濃縮する。ピペット充填チューブに移す。すぐに-78℃にAcCoAのストック溶液を返す</li><li>ドガ温度1で5分間真空下でタンパク質とソリューション℃の希望実行されている温度（19℃）以下。 </li></ol> 3。注射器14の設定<ol><li>あらかじめ実装されているシリンジクランプをホルダーと同じ高さになるまでシリンジホルダーを介して注射器を挿入します。 </li><li>それがしっかりとシリンジホルダーの底部が押し付けられるまで注射器を介して別のシリンジクランプを養う。静かに提供さ0.050"ボールポイント六角ドライブ付きクランプを締めます。 </li><li>ピペットホルダーにシリンジホルダーを置きます。 </li><li>ゆっくりと注射筒にピペットインジェクターをスライドさせます。プランジ​​ャーの先端が注射器の穴に直接供給されていることを確認します。一度完全に挿入、ピペットインジェクタにシリンジホルダーのロッキングカラーをねじ込みます。 </li></ol> 4。試料セル14をロード<ol><li>バッファを実行しているのを50mLの最小で試料セルを洗浄して、そして長期ニードル2.5 mlのガラス製注射器を使用して、残りの液体を取り除く。 </li><li>徐々に清潔で乾燥した長期ニードル2.5 mlのシリンジへのタンパク質の試料溶液1.8 mlの最小値を引く。任意の気泡を導入しないように注意してください。 </li><li>慎重に試料セルに針を挿入し、ゆっくりと、セルの底部に触れない。少しヒントを上げる（〜1 mm）と過剰の液体が試料セルの最上部より上に見えるようになるまで穏やかに細胞内にAAC（6'）- II溶液を注入する。 </li><li>オーバーフローの液体遺跡を確保しつつ、ゆっくりと約1cmの針を上げる。すぐに撤回し、試料セル内の任意の閉じ込められた気泡を除去するために少量の溶液（〜0.25 ml）を注入する。 </li><li>すべてのソリューションのオーバーフローを削除します。これは、静かにサンプルセル中にオーバーフローの側面に沿って針をスライドさせることにより達成される。注射器の先端が棚にヒットする、これは実行中のソリューションのための欲求の高さです。この行の上に座っているすべての液体を削除します。 </li></ol> 5。注射器のロードと実行14を開始する<ol><li>充填ポートにプラスチック製のチューブローディングシリンジを取り付けます。 </li><li>充填ポートの上部にプランジャーの先端を下げます。 </li><li>ピペットホルダーの底部にピペット充填チューブにAcCoAソリューションを置きます。シリンジの先端は、充填チューブの底に触れないでください。 </li><li>少量のローディングシリンジのチューブに入るまで、ゆっくりとシリンジに解決策を描く。 </li><li>プランジ​​ャーの先端を下げることによって、充填ポートを閉じ、[閉じる充填ポートのボタンをクリックしてください。ローディング中に閉じ込められる可能性のあるすべての気泡を除去するパージ - &gt;リフィルのボタン、3回をクリックしてパージし、詰め替え、。 </li><li>ピペットホルダーから充填チューブを外し、ゆっくりとシリンジの先端を拭きます。 </li><li>ピペットのアセンブリおよび試料セルに優しく低注射器を取る。ゆっくりとシリンジを簡単に曲げることができるように実行しますので、細心の注意が必要です。注射器が完全に襟のロックの基盤を押し下げて、挿入されていることを確認します。 </li><li>希望する実行中の温度を（この場合20℃で）設定し、予想される最大射出熱流量（この場合の20μcal/secで）よりも若干大きくなりますので、基準電源を選択する。 </li><li>希望の注入量と遅延をプログラムする。 （この場合は、28注射が使用された。最初の注射は60秒遅れで2μLの容積を持っていた。後続のすべての注射は、330秒の遅延と10μLのボリュームを持っていた。） </li></ol> 6。以降の実行<ol><li> 2,4,8,16、および32倍にAAC（6'）- IIとAcCoAの濃度を低減しつつ、すべての後続の実行では、手順2〜5を繰り返します。 </li></ol> 7。データ解析<ol><li>世界的に前述の10に記載の結合パラメータの単一のセットに等温線のすべてに適合するフィッティングの手順を使用します。 </li></ol> 8。代表的な結果代表的なデータを図1に示されています。等温線の形状は、濃度によって変化する必要があります。シャープな遷移は高いが期待されているC -値（すなわち、より高い蛋白質とリガンドの濃度）（図2）。 AAC（6'）- IIの場合、2サイトシーケンシャルモデルでは、調整可能な化学量論と同一の、独立したサイトの2つのセットを記述するよりも優れたフィット感を与えます。 <img src="/files/ftp_upload/2529/2529fig1.jpg" alt="図1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図1"> 図1。AACにAcCoA（3.86 mM）の（6'）- II（192μM）の滴定によって生成される等温線。 A）生ITCトレース。 B）2サイトシーケンシャルフィット（との結合パラメータを（正方形）を決定するために使用される統合された値が - ）。 <img src="/files/ftp_upload/2529/2529fig2.jpg" alt="図2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図2"> AcCoAについては図2。ITCの等温線は、様々な濃度でAAC（6'）- IIに滴定する。実験データ（白丸）を2セット - の部位に依存しないモデル（破線マゼンタ）と2 - サイトシーケンシャルモデル（ソリッドブルー）に適合させた。 2サイトsequentionalモデルは明らかに良い全体的な合意が得られます。採用濃度は）6μM、0.25 mMの、B）12μM、0.25 mMの、C）24μM、0.5mMの、D）48μM、1.0mMの、E）96μM、1.9 mMの、およびF）196μM、 AAC（6'）- IIとそれぞれAcCoAのための3.86 mMの、。

<ol><li>Cliff, M. J., Ladbury, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+survey+of+the+year+2002+literature+on+applications+of+isothermal+titration+calorimetry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Recognition%22%5BJournal%5D)">A survey of the year 2002 literature on applications of isothermal titration calorimetry.</a> Journal of Molecular Recognition. 16, 383-391 (2003).</li>
<li>Cliff, M. J., Gutierrez, A., Ladbury, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+survey+of+the+year+2003+literature+on+applications+of+isothermal+titration+calorimetry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Recognition%22%5BJournal%5D)">A survey of the year 2003 literature on applications of isothermal titration calorimetry.</a> Journal of Molecular Recognition. 17, 513-523 (2004).</li>
<li>Ababou, A., Ladbury, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Survey+of+the+year+2004%3A+literature+on+applications+of+isothermal+titration+calorimetry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Recognition%22%5BJournal%5D)">Survey of the year 2004: literature on applications of isothermal titration calorimetry.</a> Journal of Molecular Recognition. 19, 79-89 (2006).</li>
<li>Ababou, A., Ladbury, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Survey+of+the+year+2005%3A+literature+on+applications+of+isothermal+titration+calorimetry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Recognition%22%5BJournal%5D)">Survey of the year 2005: literature on applications of isothermal titration calorimetry.</a> Journal of Molecular Recognition. 20, 4-14 (2007).</li>
<li>Okhrimenko, O. ksana, J, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+survey+of+the+year+2006+literature+on+applications+of+isothermal+titration+calorimetry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Recognition%22%5BJournal%5D)">A survey of the year 2006 literature on applications of isothermal titration calorimetry.</a> Journal of Molecular Recognition. 21, 1-19 (2008).</li>
<li>Bjelic, S., Jelesarov, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+survey+of+the+year+2007+literature+on+applications+of+isothermal+titration+calorimetry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Recognition%22%5BJournal%5D)">A survey of the year 2007 literature on applications of isothermal titration calorimetry.</a> Journal of Molecular Recognition. 21, 289-312 (2008).</li>
<li>Leavitt, S., Freire, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+measurement+of+protein+binding+energetics+by+isothermal+titration+calorimetry%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Direct measurement of protein binding energetics by isothermal titration calorimetry.</a> Current Opinion in Structural Biology. 11, 560-566 (2001).</li>
<li>Wiseman, T., Williston, S., Brandts, J. F., Lin, L. -N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+measurement+of+binding+constants+and+heats+of+binding+using+a+new+titration+calorimeter%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Rapid measurement of binding constants and heats of binding using a new titration calorimeter.</a> Analytical Biochemistry. 179, 131-137 (1989).</li>
<li>Capaldi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+X-Ray+Structure+of+Zebrafish+%28Danio+rerio%29+Ileal+Bile+Acid-Binding+Protein+Reveals+the+Presence+of+Binding+Sites+on+the+Surface+of+the+Protein+Molecule%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">The X-Ray Structure of Zebrafish (Danio rerio) Ileal Bile Acid-Binding Protein Reveals the Presence of Binding Sites on the Surface of the Protein Molecule.</a> Journal of Molecular Biology. 385, 99-116 (2009).</li>
<li>Freiburger, L. A., Auclair, K., Mittermaier, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elucidating+Protein+Binding+Mechanisms+by+Variable-c+ITC%5BTitle%5D)+AND+%22ChemBioChem%22%5BJournal%5D)">Elucidating Protein Binding Mechanisms by Variable-c ITC.</a> ChemBioChem. 10, 2871-2873 (2009).</li>
<li>Wybenga-Groot, L. E., Draker, K. -a, Wright, G. D., Berghuis, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+an+aminoglycoside+6%27-N-acetyltransferase%3A+defining+the+GCN5-related+N-acetyltransferase+superfamily+fold%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of an aminoglycoside 6'-N-acetyltransferase: defining the GCN5-related N-acetyltransferase superfamily fold.</a> Structure. 7, 497-507 (1999).</li>
<li>Draker, K., Northrop, D. B., Wright, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetic+Mechanism+of+the+GCN5-Related+Chromosomal+Aminoglycoside+Acetyltransferase+AAC%286%27%29-Ii+from+Enterococcus+faecium%3A+Evidence+of+Dimer+Subunit+Cooperativity%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Kinetic Mechanism of the GCN5-Related Chromosomal Aminoglycoside Acetyltransferase AAC(6')-Ii from Enterococcus faecium: Evidence of Dimer Subunit Cooperativity.</a> Biochemistry. 42, 6565-6574 (2003).</li>
<li>Wright, G. D., Ladak, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overexpression+and+characterization+of+the+chromosomal+aminoglycoside+6%27-N-acetyltransferase+from+Enterococcus+faecium%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob.+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Overexpression and characterization of the chromosomal aminoglycoside 6'-N-acetyltransferase from Enterococcus faecium.</a> Antimicrob. Agents Chemother. 41, 956-960 (1997).</li>
<li>MicroCal. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22ITC+Data+Analysis+in+Origin%22">ITC Data Analysis in Origin</a>. , 7 edn, MicroCal. (2004).</li>
</ol>

利害の衝突は宣言されません。

変数に- cフィッティングのこの分析部分は、以前は詳細10で説明されています。ここでは、このアプローチに適した変数に- cデータセットを収集するの実用的側面を報告する。それはすべての蛋白質とリガンドのサンプルが同じストック溶液から引き出されていることが不可欠です。したがって、十分なストック溶液は実験のシリーズ全体を完了するために最初に用意されていることが重要です。これは、AAC（6&#39;）- IIとAcCoAの比率を確実にすべての実験の中で一定であり、サンプル間の単位で濃度のランダムな変動を低減。 このケースでは、多くのケアはリガンドの取り扱いに注意する必要があります。それは、ストック溶液は、時間の非常に短い期間のための液体のままであることが不可欠であるので、AcCoAは、溶液中で化学的に不安定です。適切な量​​のストック溶液から分注しされると、株価はすぐに再凍結でなければなりません。これが行われていない場合は、AcCoAは時間の経過とともに低下する可能性がありますし、濃度は、後の実行では正しくありません。一回注し、AcCoAのサンプルは直ちに使用する必要...

<table><tbody><tr><td>アセチルc&amp;#8211;酵素A（AcCoA）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2056</td><td></td></tr><tr><td>4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジンエタンスルホン酸 (HEPES)</td><td>Fisher Scientific</td><td>7365-45-9</td><td></td></tr><tr><td>エチレンジアミン四酢酸 (EDTA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>431788</td><td></td></tr><tr><td>Spectra/Por 2 透析チューブ</td><td>Spectrum Labs</td><td>132678</td><td></td></tr><tr><td>滅菌シリンジフィルター (0.2 &amp;mu;m)</td><td>VWR international</td><td>281445-477</td><td></td></tr><tr><td>硝酸セルロースメンブレンフィルター (0.45 &amp;mu;m)</td><td>Whatman, GE Healthcare</td><td>7184-004</td><td></td></tr><tr><td>VP-ITC</td><td>MicroCal</td><td>VP-ITC</td><td>測定に使用したマイクロカロリメーター</td></tr><tr><td>ThermoVac</td><td>MicroCal</td><td>USBサーモバキューム</td><td>温度制御脱気ステーション</td></tr></tbody></table>

バインディング機構を決定するために、可変濃度等温滴定熱量計のデータセットの収集

Collecting Variable-concentration Isothermal Titration Calorimetry Datasets in Order to Determine Binding Mechanisms

等温滴定熱量測定（ITC）は、一般的に、ホスト高分子のリガンドの結合に関連する熱力学的パラメータを決定するために使用されます。 ITCは、ホスト/リガンド相互作用を研究するための一般的な分光学的方法に比べていくつかの利点があります。たとえば、2つのコンポーネントが相互作用するときに放出または吸収された熱が直接測定され、任意の外生的な記者を必要としません。したがって、結合エンタルピーと会合定数（KA）は直接ITCデータから得られる、とエントロピーの寄与を計算するために使用することができます。また、等温線の形状は、c -値と関係する機械的なモデルに依存しています。 C -値は、[P] Tはタンパク質濃度であり、そしてnは、ホスト内のリガンド結合部位の数であり、C = N [P] TKA、として定義されています。多くの場合、特定のリガンドのための複数の結合部位は非等価であり、ITCは、個々の結合部位の熱力学バインディングパラメータの特性評価が可能になります。しかし、これは正しいバインディングモデルを使用する必要があります。異なるモデルで同じ実験データをフィットできる場合は、この選択は、問題となる可能性があります。我々は以前この問題は、c -値のいくつかで実験を行うことにより回避できることが示されている。 C -値は異なるで得られた複数の等温線は、別のモデルを同時にフィットされています。正しいモデルは、次の変数全体の- cデータセット全体の適合度に基づいて識別されます。このプロセスは、アミノグリコシド耐性の原因となる酵素アミノグリコシドN - 6&#39; -アセチルトランスフェラーゼ- II（AAC（6&#39;）- II）にここに適用されます。私たちの方法論は、あらゆるシステムに適用可能であるが、この戦略の必要性が良くアロステリック効果や協同性を示す高分子 - リガンドシステムで実証、および別の結合モデルは、同じデータに本質的に同一のフィットを提供する場合です。私たちの知識に、市販のそのようなシステムはありません。 AAC（6&#39;）- II、二つのサブユニット間の協同性を示す、二つの活性部位を含むホモ二量体である。しかしC -値の単一で得られたITCのデータは、少なくとも2つの異なるモデルが二組 - の部位に依存しないモデルと二サイトシーケンシャル（協同組合）のモデルにも同様にフィットすることができます。上記で説明したように、C -値を変化させることを通じて、それは、AACの正しい結合モデル（6&#39;）- IIは、2つのサイトシーケンシャル結合モデルであることが設立されました。ここで、我々は、ITCの実験を行う際に、変数- cの分析に適したデータセットを得るためにに必要な手順を説明します。

ITCは、そのホストへのリガンドの結合を研究するための強力なツールです。複雑なシステムではしかし、いくつかのモデルも同様にデータをフィットすることがあります。ここで説明する方法は、複雑なシステムのための適切な結合モデルを解明し、対応する熱力学的パラメータを抽出する手段を提供します。

等温滴定カロリメトリー（ITC）は、ホストへのリガンド結合に伴う熱力学的パラメータを決定するために一般的に使用されています。

この手順の全体的な目的は、高分子がそのリガンドに結合する現象を記述する適切な物理モデルを特定し、関連する熱力学パラメータを決定することです。まず、広範な透析を行うことで高分子のストック溶液を調製します。次に、目的のリガンドを最終透析バッファーに溶解させ、2番目のステップですべての構成成分の濃度を決定します。高分子およびリガンドの試料を、一連の異なる濃度に注意深く希釈します。次に、一連の等温滴定カロリメトリー（ITC）実験を、リガンドとタンパク質の両方をいくつかの異なる濃度で実施し、本手順の最終ステップとして一連のITC等温線を作成します。これら一連の実験結果に対し、異なる物理モデルを用いてグローバル解析を行い、全体として最も適合度の高いモデルを正解として特定します。本日は、タンパク質分子がどのようにリガンドと結合するかといった生物物理学的な疑問に応え、エントロピー、エンタルピー、結合定数などの結合パラメータの正確な測定を可能にする手法をご紹介します。このプロトコルを開始する前に、目的のタンパク質を精製してください。今回のデモンストレーションで使用する高分子は、immuno GLYCOSIDE N six prime、a subtle transferase one IまたはC six prime one Iです。まず、4 Lの透析バッファーを調製し、4 °Cまで冷却します。次に、少量の高分子溶液を透析させます。本例では、4 °Cにて、1.3 Lの透析緩衝液に対し5 mLの400 µM AAC C six prime, one eyeを添加します。この操作はコールドルームまたは冷蔵庫内で行ってください。8時間ごとに新鮮な緩衝液に交換し、計3回透析を行います。最終的な透析溶液を保存してください。最終透析液750 millilitersを0.45 micronのセルロースフィルターでろ過し、4 °Cで保存します。このバッファーは、以降ランニングバッファーと呼び、洗浄液および希釈液として使用します。サンプルの調製については、0.2 micronのシリンジフィルターをランニングバッファーで十分に洗浄してください。タンパク質試料を適用し、ろ過します。タンパク質溶液を保存する前に、コニカルチューブに試料を静かに回収し、標準的なタンパク質定量法でタンパク質濃度を決定します。本例では、280 nanometersでのABSORBENCE（吸光度）によってタンパク質濃度を測定し、酵素濃度を算出します。EXIプロテオミクスサーバーで算出した消衰係数を用いて、長期安定性を最大限に高める方法でタンパク質を保存します。AAC C six prime one eyeは、凍結融解後に活性が保持されないため、4 °Cで保存する必要があります。次に、リガンドとランニングバッファーを溶解させます。本デモンストレーションでは、4 mgのアセチルコエンザイムAを200 µLのランニングバッファーに溶解し、25 mMのストック溶液を作成しました。このリガンドは、ITCサンプルの調製に使用するまで-78°Cで保存できます。まず、AAC 6' 1 Iの書面プロトコルに記載されている通り、C値が64になるように酵素濃度を算出します。これは192 µMの濃度に相当します。ろ過済みのランニングバッファーでストック溶液を希釈し、この濃度の高分子溶液を2 mL調製します。アセチルCoA溶液を氷水浴で解凍します。アセチルCoA溶液が解凍されたら、穏やかに混合します。高分子の濃度に結合部位数を掛け、さらに10を掛けて、リガンド溶液の濃度を算出します。25 mMのアセチルCoAストック溶液80 µLを420 µLのランニングバッファーに加え、混合してアセチルCoA溶液を調製します。希釈したアセチルCoA溶液をピペット充填チューブに移し、残りの25 mMストック溶液は保管のため-78 °Cに戻します。AC6'1IおよびアセチルCoA溶液を、目的の実験動作温度より1 °C低い19 °Cで、真空下で5分間脱気します。注入用シリンジをセットするには、シリンジホルダーにシリンジを挿入し、あらかじめ取り付けられているシリンジクランプがホルダーと同じ高さになるまで進めます。2つ目のシリンジクランプを注入用シリンジに被せ、シリンジホルダーの底部にしっかりと押し付けます。付属の0.05 inchボールポイント六角ドライバーを使用して、クランプを静かに締め付けます。次に、シリンジホルダーをピペットホルダーに取り付けます。ピペットインジェクターを注入用シリンジにゆっくりとスライドさせ、プランジャーの先端がシリンジの穴に直接入っていることを確認してください。完全に挿入されたら、シリンジホルダーのロックカラーをピペットインジェクターにねじ込んで固定します。A a C six prime one eyeタンパク質サンプル溶液をロードする前に、装置に付属のセル洗浄システムを使用して、サンプルセルを50 milliliters以上のランニングバッファーで洗浄してください。2.5 milliliterの長い針付きガラスシリンジを用いて吸引し、サンプルセルから残留バッファーを除去します。別の清潔で乾燥した長い針を使用して、脱気真空装置から溶液を除去してください。2.5 mLシリンジを使用します。A a C six prime one eyeタンパク質サンプルを最低1.8 mL、慎重にシリンジに吸い取ります。気泡が入らないように注意してください。シリンジにタンパク質試料を充填したら、サンプルセルに針を挿入し、セルの底に軽く触れさせます。針を約1 mm上げ、サンプルセルの上端に過剰な液体が見えるまで、試料をゆっくりとセル内に注入します。セル内に閉じ込められた気泡を排除するため、溶液がオーバーフロー部分に残っていることを確認しながら針を約1 cm上げ、約0.25 mLの溶液を素早く吸引して再び注入します。次に、オーバーフローの側面に沿って、ニードルをゆっくりと上方にスライドさせます。サンプルウェル内でニードルが段差に当たります。この段差がランニング溶液の目的の高さを示すため、この段差より上の液体をすべて吸い出してください。注入用シリンジに充填するため、プラスチックチューブ付きの充填用シリンジを充填ポートに取り付け、プランジャーの先端を充填ポートの上端まで下げます。次に、DGA配位子溶液が入ったピペット充填チューブをピペットホルダーの底に配置します。シリンジの先端が充填チューブの底に触れていないことを確認し、充填用シリンジのチューブに少量の溶液が入るまで、ゆっくりと溶液をシリンジ内に吸引します。次に、プランジャータップを下げて充填ポートを閉じます。これは「充填ポートを閉じる」ボタンをクリックすることで行われます。その後、ロード中に混入した可能性のある気泡を除去します。パージ・リフィルボタンをクリックして、パージとリフィルを行います。これを合計3回繰り返します。パージ・リフィル工程が完了したら、フィリングチューブをピペットホルダーから取り外し、シリンジのチップをラボ用ティッシュペーパーで静かに拭き取ります。次に、ピペットアセンブリのシリンジをサンプルの中に下げます。針は曲がりやすいため、注意してゆっくりと進めてください。ロッキングカラーのベースを押し下げて、シリンジが完全に挿入されていることを確認します。シリンジを固定した後、希望の動作温度を設定し、予想される最大注入熱流よりもわずかに高いリファレンスパワーを選択します。この例では、動作温度に20 °C、リファレンスパワーに20 µcal/sを使用しています。次に、希望の注入量と遅延時間をプログラミングします。ここでは28回の注入を行い、1回目は2 µLの容量で62秒の遅延時間を設定し、それ以降の注入は10 µLの容量で332秒の遅延時間を設定します。ここで示す実験は、必要な追加曲線を生成するために、単一濃度でデータセットを作成するための基礎となります。高分子およびリガンドの濃度を下げながら、このプロセスを繰り返してください。濃度による誤差を最小限に抑えるため、すべての高分子およびリガンド試料は同一のストックソリューションから調製してください。ここでは、192 µMのmicro molecule A A C six prime oneに対して3.86 mMのリガンドacetyl coenzyme Aを滴定して得られた、等温滴定カロリメトリー（ITC）の未処理データ（トレース）を示します。2サイト逐次適合法を用いて結合パラメータを決定するため、眼の積分値を使用しました。このグラフは、さまざまな濃度のACE Coenzyme AおよびAAC C six Prime One Eyeを用いてITCにより生成された等温線を示しています。白抜きの円で表される実験データは、2セットの独立サイトモデルと2サイト逐次モデルの両方に適合させました。2部位逐次モデルの方がより良好な一致が見られます。使用したタンパク質濃度は、付随する本文で定義されています。この手順を実施する際は、濃度の変化が結果に劇的な影響を及ぼす可能性があるため、希釈を非常に正確に行うことが重要です。

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Research

JoVE Journal

Biology

生物学

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バインディング機構を決定するために、可変濃度等温滴定熱量計のデータセットの収集

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