バインディング機構を決定するために、可変濃度等温滴定熱量計のデータセットの収集

この手順の全体的な目標は、高分子の配位子への結合を記述する正しい物理モデルを特定し、関連する熱力学的パラメータを決定することです。これは、まず広範な透析を通じて高分子のストック溶液を調製することによって達成されます。次に、目的のリガンドを最終的な透析バッファーに溶解し、すべての成分の濃度を第2ステップで決定します。

高分子サンプルとリガンドサンプルは、一連の異なる濃度に慎重に希釈されます。次に、一連の等温滴定型熱量測定(ITC実験)をリガンドとタンパク質の両方の濃度で数濃度で実施し、手順の最終ステップで一連のITC等温線を生成します。一連の実験のグローバル解析は、異なる物理モデルを使用して実行され、全体的に最も一致するモデルが正しいと識別されます。

今日は、タンパク質分子がリガンドにどのように結合するか、エントロピー、エントロピー、会合定数などの結合パラメータの正確な測定を提供できる生物物理学的な質問に答えるのに役立つ方法を紹介します。このデモンストレーションで使用した高分子は、免疫グリコシドN6プライム、微妙なトランスフェラーゼ1IまたはCシックスプライム1 I.To 開始し、4リットルの透析バッファーを調製し、摂氏4度に冷却する対象タンパク質を精製します。次に、少量の高分子溶液を透析します。

この場合、400マイクロモルAAC C 6プライムの5ミリリットル、摂氏4度の透析緩衝液の1.3リットルに片目。これは、冷蔵室または冷蔵庫で、8時間ごとに新しいバッファーと交換し、合計3回透析することができます。最終的な透析液を保存します。

最終透析液750ミリリットルを0.45ミクロンのセルロースフィルターでろ過し、摂氏4度で保存します。このバッファーは、現在ランニングバッファーと呼ばれており、すすぎや希釈剤として使用されます。サンプルについては、0.2ミクロンのシリンジフィルターをランニングバッファーで十分にすすいでください。

タンパク質サンプルを塗布し、ろ過します。タンパク質溶液を保存する前に、サンプルを円錐形のチューブに静かに収集し、標準的なタンパク質アッセイでタンパク質濃度を測定します。この場合、タンパク質濃度は280ナノメートルのABSORBENCEによって測定され、酵素濃度が計算されます。

EXIプロテオミクスサーバーから生成された吸光係数を使用して、長期安定性が最大になるようにタンパク質を保存します。AAC C 6プライム片眼は、凍結融解後に活性を保持しないため、摂氏4度で保存する必要があります。次に、リガンドを溶解し、バッファーを実行します。このデモンストレーションでは、4ミリグラムのアセチルコエンザイムAを200マイクロリットルのランニングバッファーに溶解して、25ミリモルのストック溶液を調製しました。

このリガンドは、ITCサンプルを準備するために、最初に、AAC 6プライム1I.Thisのための書かれたプロトコルに記載されているように64のC値を得るために酵素の濃度を計算する準備ができるまで、マイナス78°Cで保存することができます192マイクロモルの濃度に対応します。この濃度で高分子の2ミリリットル溶液を調製し、ろ過されたランニングバッファーFIAでストック溶液を希釈し、氷水浴で溶液をアセタール補酵素を解凍します。アセタール補酵素溶液を解凍したら、混合物を解凍し、高分子濃度に結合部位の数を10を掛けて、リガンド溶液の濃度を穏やかに計算します。

アセチル補酵素を溶液として調製するには、25ミリモルのACE補酵素80マイクロリットル、ストック溶液を420マイクロリットルのランニングバッファーに加え、混合します。希釈したアセチル補酵素ACE溶液をピペット充填チューブに移し、残りの25ミリモルストック溶液を摂氏マイナス78度に戻して保存します。A C 6プライム1つの目と微妙な補酵素、A溶液を真空下で19°Cで5分間、これは所望の実験走行温度より摂氏1°C低い溶液で脱気します。

注射シリンジをセットアップするには、プレムに取り付けられたシリンジクランプがホルダーと同じ高さになるまで、シリンジホルダーを通してシリンジを挿入します。2 番目のシリンジ クランプを注射シリンジの上に送り、シリンジ ホルダーの底にしっかりと押し付けられるまで押します。クランプを付属の0.05インチボールポイント六角ドライブで静かに締めます。

次に、シリンジホルダーをピペットホルダーに入れます。ピペットインジェクターを注射シリンジにそっとスライドさせ、プランジャーの先端がシリンジの穴に直接供給されていることを確認します。完全に挿入されたら、シリンジホルダーのロッキングカラーをピペットインジェクターにねじ込みます。

A a C six prime one eye protein sample solutionをロードする前に、装置に付属の細胞洗浄システムを使用して、少なくとも50 mLのランニングバッファーでサンプル細胞を洗浄してください。サンプルセルから残留バッファーを、長針2.5ミリリットルガラスシリンジで吸引して除去します。2本目の清潔で乾燥した長い針を使用して、脱気真空から溶液を取り出します。

2.5ミリリットルの注射器。A a C 6プライムワンアイタンパク質サンプルの最小1.8ミリリットルをシリンジに慎重に引き込みます。気泡が出ないように注意してください。

シリンジにタンパク質サンプルを装填したら、サンプルセルに針を挿入し、セルの底にそっと触れます。針を約1mm上げ、サンプルセルの上部に余分な液体が見えるまで、サンプルを細胞に静かに注入します。閉じ込められた気泡を細胞から洗い流すには、溶液がオーバーフローに残っていることを確認しながら針を約1センチメートル上げ、約0.25ミリリットルの溶液をすばやく引き出して注入します。

次に、オーバーフローの側面に沿って針をゆっくりと上にスライドさせます。サンプルウェルでは、針が棚に当たります。この棚の上にあるすべての液体を引き出します。これは、棚が実行中の溶液の望ましい高さを示しているためです。

注射器を装填するには、プラスチックチューブ膨満化シリンジを充填ポートに取り付け、プランジャーの先端を充填ポートの上部まで下げます。次に、DGAリガンド溶液のピペット充填チューブをピペットホルダーの底に置きます。シリンジの先端が充填チューブの底に触れていないことを確認し、少量がローディングシリンジのチューブに入るまで溶液をゆっくりとシリンジに引き込みます。.

次に、プランジャーの先端を下げて充填ポートを閉じます。これは、充填ポートを閉じるボタンをクリックすることで行われます。次に、ロード中に閉じ込められた可能性のある気泡を取り除きます。

パージと補充を行うには、パージ補充ボタンをクリックします。パージと補充を合計3回行います。パージ補充プロセスが完了したら、ピペットホルダーから充填チューブを取り外し、シリンジの先端をラボティッシュペーパーで優しく拭きます。

次に、ピペットアセンブリのシリンジをサンプルに下げます。針は曲がりやすいので、注意してゆっくりと進めてください。ロッキングカラーのベースを押し下げて、シリンジが完全に挿入されていることを確認します。

シリンジが固定されたら、希望の運転温度を設定し、予想される最大注入熱流量よりわずかに大きい基準電力を選択します。この例では、摂氏20度と20マイクロカロリー/秒がそれぞれ走行温度と基準電力として使用されています。次に、必要な注入量と遅延をプログラムします。

ここでは、28回の注入が使用され、最初の注入は2マイクロリットルの容量と62番目の遅延があり、その後の注入は10マイクロリットルの容量で332番目の遅延があります。ここで示す実験は、必要な追加の曲線を生成するために 1 つの濃度でデータセットを生成するための基礎を提供します。このプロセスを、高分子とリガンドの濃度を減らしながら繰り返します。

すべての高分子サンプルとリガンドサンプルが同じストック溶液に由来し、濃度の誤差を最小限に抑えるようにしてください。ここに示されているのは、3.86ミリモルのリガンドアセチル補酵素Aを微分子の192マイクロモルに滴定して生成された生の等温滴定型熱量測定トレースです。A A C 6プライム1。

眼の統合値を使用して、2 つの部位のシーケンシャル フィットで結合パラメーターを決定しました。このグラフは、さまざまな濃度のACEコエンザイムAおよびAAC C 6プライムワンアイのITCによって生成される等温線を示しています。白丸で表される実験データは、2セットのサイト独立モデルと2サイトシーケンシャルモデルの両方に適合しました。

2 つのサイトのシーケンシャル モデルでより一致が見られます。使用されるタンパク質濃度は、添付のテキストで定義されています。この手順を実行するときは、濃度の変化が結果に大きな影響を与える可能性があるため、希釈を非常に正確に行うことが重要です。