バインディング機構を決定するために、可変濃度等温滴定熱量計のデータセットの収集

この手順の全体的な目的は、高分子とそのリガンドの結合を記述する適切な物理モデルを特定し、それに関連する熱力学的パラメータを決定することです。これは、まず広範な透析を通じて高分子のストック溶液を調製することで達成されます。次に、目的のリガンドを最終透析バッファーに溶解させ、第2のステップですべての成分の濃度を決定します。

高分子およびリガンドのサンプルを、一連の異なる濃度に慎重に希釈します。次に、一連の等温滴定カロリメトリー（ITC）実験を、リガンドとタンパク質双方の複数の濃度で実施し、手順の最終ステップとして一連のITC等温線を作成します。これら一連の実験結果に対して、異なる物理モデルを用いてグローバル解析を行い、全体として最も整合性の高いモデルを正解として特定します。

本日は、タンパク質分子がリガンドにどのように結合するかといった生物物理学的な疑問への回答に役立ち、エントロピー、エンタルピー、結合定数などの結合パラメータを正確に測定できる手法をご紹介します。このプロトコルを開始する前に、目的のタンパク質を精製してください。今回のデモンストレーションで使用する高分子は、immuno GLYCOSIDE N six prime、subtle transferase one I または C six prime one I です。まず、4 L の透析バッファーを調製し、4 °C まで冷却します。次に、少量の高分子溶液を透析します。

このケースでは、400 µMのAAC C 6' 1I 5 mLを、4 °Cで1.3 Lの透析バッファーに浸します。これは低温室または冷蔵庫内で行ってください。8時間ごとに新鮮なバッファーに交換し、計3回透析します。最終的な透析溶液を保存してください。

最終透析液 750 milliliters を 0.45 micron セルロースフィルターでろ過し、4 °C で保存します。このバッファーを以降ランニングバッファーと呼び、洗浄液および希釈液として使用します。サンプルについては、0.2 micron シリンジフィルターをランニングバッファーで十分に洗浄します。

タンパク質サンプルを適用し、ろ過します。タンパク質溶液を保存する前に、コニカルチューブにサンプルを静かに回収し、標準的なタンパク質アッセイでタンパク質濃度を測定します。本手法では、280 nanometersにおける吸光度によってタンパク質濃度を測定し、酵素濃度を算出します。

EXIプロテオミクスサーバーで算出された消光係数を用いて、タンパク質を長期安定性が最大となる方法で保存します。AAC C six prime one eyeは、凍結融解後に活性が維持されないため、4 °Cで保存する必要があります。次に、リガンドとランニングバッファーを溶解させます。本デモンストレーションでは、4 mgのアセチルコエンザイムAを200 µLのランニングバッファーに溶解し、25 mMのストック溶液を調製しました。

このリガンドは、ITCサンプルの調製準備が整うまで-78°Cで保存可能です。まず、AAC 6'1 Iの書面プロトコルに従い、C値が64となるように酵素濃度を算出します。これは192 µMの濃度に相当します。フィルターろ過済みのランニングバッファーでストック溶液を希釈し、この濃度の高分子溶液を2 mL調製します。アセチルCoA溶液を氷水バスで解凍します。アセチルCoA溶液が解凍されたら、静かに混合します。高分子濃度に結合部位数を掛け、さらに10を掛けて、リガンド溶液の濃度を算出します。

25 mMのアセチルコエンザイムAストック溶液80 µLをランニングバッファー420 µLに加え、混合してアセチルコエンザイムA溶液を調製します。希釈したアセチルコエンザイムA溶液をピペット充填チューブに移し、残りの25 mMストック溶液は保存のため-78 °Cに戻します。AC6'1I溶液およびアセチルコエンザイムA溶液を、目的の実験動作温度より1 °C低い19 °Cにて、真空状態で5分間脱気します。

注入用シリンジを設置するには、シリンジホルダーにシリンジを挿入し、あらかじめ取り付けられているシリンジクランプがホルダーと同じ高さになるまで進めます。2つ目のシリンジクランプを注入用シリンジに被せ、シリンジホルダーの底にしっかりと押し付けます。付属の0.05 inchボールポイント六角レンチで、クランプをゆっくりと締めます。

次に、シリンジホルダーをピペットホルダーに装着します。ピペットインジェクターを注入用シリンジにゆっくりとスライドさせ、プランジャーの先端がシリンジの穴に直接入っていることを確認します。完全に挿入されたら、シリンジホルダーのロッキングカラーをピペットインジェクターにねじ込んで固定します。

A a C six prime one eyeタンパク質試料溶液をロードする前に、装置に付属のセル洗浄システムを使用して、試料セルを50 milliliters以上のランニングバッファーで洗浄します。長い針を装着した2.5 milliliterガラスシリンジで吸引し、試料セルから残留バッファーを除去します。2本目の清潔で乾燥した長い針を使用して、脱気真空装置から溶液を除去します。

2.5 mL シリンジを使用します。A a C six prime one eye タンパク質サンプルを、最低 1.8 mL 慎重にシリンジに吸い取ります。気泡が入らないように注意してください。

シリンジにタンパク質試料を充填したら、ニードルを試料セルに挿入し、セルの底にそっと触れさせます。ニードルを約1 mm上げ、試料セルの上端から余剰な液体が見えるまで、試料をセル内にゆっくりと注入します。セル内の気泡を取り除くために、オーバーフローに溶液が保持されていることを確認しながらニードルを約1 cm上げ、約0.25 mLの溶液を素早く吸引し、再度注入します。

次に、オーバーフローの側面に沿って、針をゆっくりと上方へスライドさせます。サンプルウェル内で針が段差に当たります。この段差がランニングソリューションの目的の高さを示すため、段差より上の液体をすべて吸い出します。

注入用シリンジに充填するため、プラスチックチューブ付きの充填用シリンジを充填ポートに取り付け、プランジャーの先端を充填ポートの最上部まで下げます。次に、DGAリガンド溶液が入ったピペット充填チューブをピペットホルダーの底に配置します。シリンジの先端が充填チューブの底に触れていないことを確認し、充填用シリンジのチューブに少量の溶液が入るまで、ゆっくりと溶液をシリンジ内に吸引します。

次に、プランジャーチップを下げて充填ポートを閉じます。これは、「充填ポートを閉じる」ボタンをクリックすることで行います。その後、ロード中に混入した可能性のある気泡を除去します。

パージ・リフィルボタンをクリックして、パージとリフィルを行います。この操作を合計3回繰り返してください。パージ・リフィル工程が完了したら、フィリングチューブをピペットホルダーから取り外し、シリンジの先端をラボ用ティッシュペーパーで優しく拭き取ります。

次に、ピペットアセンブリのシリンジをサンプルの中へ下げます。針が曲がりやすいため、注意してゆっくりと操作してください。ロッキングカラーの底部を押し下げ、シリンジが完全に挿入されていることを確認します。

シリンジを固定したら、希望の動作温度を設定し、予想される最大注入熱流よりもわずかに高いリファレンスパワーを選択します。この例では、動作温度に20 °C、リファレンスパワーに20 µcal/sを使用しています。その後、希望の注入量と遅延時間をプログラムします。

ここでは28回の注入を行い、1回目は容量2 µLで62ステップの遅延時間を設け、それ以降の注入は容量10 µLで332ステップの遅延時間を設けて実施します。ここで示す実験は、必要な追加曲線を生成するために、単一濃度でデータセットを作成するための基礎となるものです。高分子およびリガンドの濃度を下げながら、この工程を繰り返してください。

濃度の誤差を最小限に抑えるため、すべての高分子およびリガンド試料を同一のストック溶液から調製してください。ここに示しているのは、192 µMの微小分子A A C six prime oneに対し、3.86 mMのリガンドであるアセチルコエンザイムAを滴定して得られた等温滴定カロリメトリーの未処理トレースです。

2サイト逐次結合フィッティングを用いて結合パラメータを決定するために、目の積分値が使用されました。このグラフは、異なる濃度のACE Coenzyme AとAAC C six Prime One Eyeを用いてITCで作成された等温線をもとにしています。白丸で示された実験データは、2つの独立したサイトモデルと2サイト逐次モデルの両方にフィッティングされました。

2部位逐次モデルの方が、より良好な一致が見られます。使用したタンパク質濃度は、付随するテキストに定義されています。この手順を行う際は、濃度の変化が結果に劇的な影響を及ぼす可能性があるため、希釈を非常に正確に行うことが重要です。