の解剖と染色ショウジョウバエ幼虫卵巣

この手順の全体的な目標は、共焦点顕微鏡によって後期第3インスターショウジョウバエの幼虫から分離された卵巣を視覚化することです。これは、最初に同期した個体群から雌の幼虫を選択することによって達成されます。手順の2番目のステップは、無傷の脂肪体を解剖し、腸とキューティクルから分離して、氷の上に置くことです。

手順の3番目のステップは、染色を固定し、卵巣が埋め込まれた脂肪体を洗うことです。手順の最後のステップは、マウント中に卵巣を脂肪体から分離することです。最終的には、免疫蛍光顕微鏡による細胞特異的な染色を示す結果を得ることができます。

一般的に、この方法に不慣れな人は、細かい解剖と取り付けに多くの練習が必要なため、苦労します。解剖の5日前に、新鮮な25ミリメートルのフライフードのバイアルに酵母を加えます。7〜16匹の交配したメスのショウジョウバエをバイアルに入れます。

雌が2〜4時間、またはバイアルあたり約30個の卵になるまで産卵できるようにします。バイアルを含む卵を摂氏25度、湿度70%以上でインキュベートします。5日後、幼虫は後期の3番目のインスターに達しました。

9ウェルガラスの解剖皿にリンガーの媒体を入れます。次に、リンガーが入ったペトリ皿にナイロンメッシュを取り付けた特製の型を準備します。中程度。細い鉗子を使って皿を氷の上に置きます。

バイアルの壁から10〜15匹の幼虫を選び、解剖皿に入れます。解剖皿を顕微鏡下に置いて、女性の選択と解剖を行います。雌の幼虫は、そのヤギによって雄と区別できます。

男性の精巣は、脂肪体の後部3分の1に埋め込まれた大きくて透明な楕円形として簡単に識別できます。脂肪体の同じ部分に位置する女性の卵巣は、はるかに小さく、透明な丸い球として識別できます。卵巣が見えない場合、雌の幼虫は精巣がないことによって識別されます。

雌の幼虫をきれいな井戸に移す 解剖を開始するには、鉗子を使用して幼虫を脳のすぐ後ろに保持します。2対目の鉗子で頭を取り外します。幼虫の残りの後部を背側に置き、気管を下に向けて置きます。

1対の鉗子で幼虫を後部の球形で保持します。次に、鉗子をゆっくりと内側に押し込み、他の鉗子のペアを使用して、幼虫の脂肪体の約半分がしっかりと現れるまでキューティクルを後方にスライドさせます。キューティクルの後端を一方のペアの鉗子で保持し、もう一方のペアでキューティクルの残りの部分をゆるく保持し、キューティクルと付着した腸が隙間を滑り抜けるように後端を優しくゆっくりと引き離します。

このプロセスの最後に、腸とキューティクルを脂肪体の前部から切り離します。解剖した幼虫を含む井戸からのリンガーミディアムで牧草地ピペットを完全に濡らします。牧草地のピペットを使用して、脂肪体をセルストレーナー内の氷冷リンガー培地に移します。

次のステップは、調製物をリンゲル培地で5%ホルムアルデヒドに固定して染色し、オービタルシェーカーで穏やかに攪拌しながら脂肪体を20分間インキュベートすることです。特に指定がない限り、すべてのステップは室温で実行されます。脂肪体を1%PBTで3回、1回目は5分間、2回目は10分間、3回目は45分間洗浄します。

0.3%PBTBで1時間、穏やかに攪拌しながらブロックします。動揺に続いて。脂肪体を0.2ミリリットルのチューブに移します。

余分な液体を取り除き、0.3%PBTBで希釈した目的の最初の抗体を加え、ローラー上で穏やかに攪拌しながら摂氏4度で一晩インキュベートします。翌日、脂肪体を型に戻します。次に、脂肪体を0.3%PBTBでそれぞれ30分間3回、穏やかに攪拌しながら洗浄します。

次に、0.3%PBTBに5%正常ロバ血清を補充して1時間ブロックします。穏やかに攪拌しながら、脂肪体を0.2ミリリットルのチューブに移し、ブロッキング溶液で希釈した適切な二次蛍光抗体を添加します。チューブをラックに入れ、ラックをローラーに置き、穏やかに攪拌しながら2時間インキュベートします。

抗体が蛍光性の場合は、この時点から先は暗所でインキュベートしてください。2時間後、脂肪体を型に戻し、0.3%PBTで30分間ずつ3回洗浄し、穏やかに攪拌して卵巣を解剖してマウントします。脂肪体を清潔なアイノールチューブに慎重に移します。

牧草地のピペットですべての液体を取り除き、すぐにベクターシールド封入剤で覆います。ピペットチップの端をカットし、最小限の量の封入剤で脂肪体を慎重に吸引します。脂肪体を顕微鏡スライドに移します。

次のステップは、直径0.1ミリメートルのピンを保持する2つのニッケルメッキピンホルダーを使用して、実体顕微鏡下で脂肪体を広げ、脂肪体の後部3分の1を見て卵巣の位置を特定することです。太った体は、卵巣を取り囲むところに花の形をしています。脂肪体の残りの部分から花を解剖し、はしごを捨てます。

生殖腺の周りの2本のピンを慎重に交差させ、卵巣から遠ざけることにより、生殖腺を囲む脂肪体を取り除きます。分離された生殖腺を脂肪体の残留物から離れたスライドに置き、脂肪体の残留物を廃棄します。スライドをカバーで覆います。

マニキュアで滑らせて密封します。共焦点顕微鏡を使用して卵巣を直接視覚化します。これらの数値は、抗体のさまざまな組み合わせで染色された2〜3個の卵巣からのものです。

最初の画像では、1つの抗体が体細胞と染色の輪郭を示しています。矢印で示されているふそうは、細胞内小器官です。緑色で示されている始原生殖細胞内には、末端フィラメントとキャップ細胞があり、これらが一緒になってニッチの体細胞を形成し、矢印はキャップ細胞を指しています。

この図は、青色で描かれた生殖細胞に直接接触するマゼンタの混ざり合った細胞を示しています。卵巣の体細胞は緑色で輪郭が描かれています その発達後。この技術は、幹細胞生物学の分野の研究者がTezo卵巣のニッチ形成と幹細胞の確立を探求する道を開きました。