Name: アダルト生まれのニューロンの統合を検討し (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-03-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min
Description: 学ぶレトロウイルス標識とパッチクランプ電気生理学を用いて、マウス海馬歯状回で生まれた成体ニューロンの機能的シナプス統合を解析する方法。この技術は神経発生と回路形成の研究に有用である。

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この作品は、S.Ge.にNINDSとアメリカ心臓協会によって資金を供給されたこのアプローチは、もともと設立され、ジョンズホプキンス大学で博士宏俊歌の研究室で著者によって開発されました。我々は、彼の指導と支援のために博士宏君の歌に感謝の意を表します。

1。ウイルスのインジェクション高力価のエンジニアレトロウイルス（1 × 10 9単位/ ml）をウイルス上清の遠心分離に続いて、レトロウイルスベクターの同時トランスフェクションにより産生され、HEK293T細胞にVSVGています。源や生産方法については、優れたJoveのデモ（3）を参照してください。 注：ヤングアダルト（4-6週齢）雌のC57BL / 6マウス（Charles River）は、標準条件下で飼育されています。すべての手順は、ストーニーブルック大学のIACUCによって承認されたプロトコルの下で実験動物の管理と使用のための国立研究評議会のガイドに従ってください。 <ol><li>氷の上に動物あたりの冷凍レトロウイルスの融解2ul。 </li><li> Anaesthetize（100μgのケタミン+グラム体重あたり10μgのキシラジン）と定位フレーム（Steolting）で動物をマウント。頭の毛を削除し、70％エタノールで皮膚を拭いてください。 </li><li>頭蓋骨を公開し、以下の座標に歯科用ドリル（0.6ミリメートルドリルビット）を使用して、4つの浅い穴を開けます。 <ul><li>ブレグマからanterioposterior = -2ミリメートル、横= ± 1.6ミリメートル、腹側= 2.5ミリメートル、ブレグマからanterioposterior = -3ミリメートル、横= ± 2.6ミリメートル、腹側= 3.2 mmである。 </li><li>ブレグマからanterioposterior = -2ミリメートル、横= ± 1.6ミリメートル、腹側= 2.5ミリメートル、ブレグマからanterioposterior = -3ミリメートル、横= ± 2.6ミリメートル、腹側= 3.2 mmである。 </li></ul></li><li> 1μlのハミルトン、フラットチップシリンジをマウントし、歯状回の0.25μL/ minの速度でサイトあたり0.5μlのレトロウイルスを注入する。ゆっくり流体逆流を防ぐために注射器を引き出す前に、各注射後（腹側の深さについては、上記の座標を参照してください。）一時停止2分。注射の間で、簡単に滅菌PBSで注射器の先端部と血液の痕跡を除去するアプリケーターの外表面をすすぐ。 </li><li> 滅菌外科用縫合材料で傷口を閉じて（タイプP - 1;サイズ6-0）と注入後の希望の時間段階まで標準的な住宅の条件に動物を返します。 </li></ol> 2。スライスの準備成体マウスからの高品質の急性スライスを取得するには、我々は（下記参照）スライス標本用に変更された最先端のソリューションを使用してください。 <ol><li> 0〜4℃95％の氷とバブルのC O 2 -5％、少なくとも30分間CO 2へのプレチルカットソリューション。 </li><li> Anaesthetizeとtranscardially氷冷酸素飽和切削液で動物を灌流。 </li><li>迅速濾紙冷たい、酸素切削液であらかじめ湿らしたシャーレに脳を取り除く。小脳をカットオフし、（目に見える）注射の座標には、少なくとも1mmの前方の取り付け面をスライス。接着剤は、脳へvibrotome段階と寒さ、酸素切断溶液で満たされたカッティングチャンバにそれをマウントします。 </li><li>冠状または水平スライス（300 -350μm）を作製し、室温ACSFを含むインキュベーションチャンバーに大口径のピペットでそれらを転送するには、95％O 2 / 5％CO 2をバブリング。 </li><li> 30〜60分間32℃でのスライス、連続的にバブリングし、インキュベートする。記録の期間のために室温にチャンバーを戻す。 </li></ol> 3。電気生理学的実験<ol><li> 34℃ - スライスが連続して32℃で酸素飽和ACSFを灌流され、記録室に転送されます。 </li><li>バイポーラタングステン刺激電極は、低倍率の顕微鏡対物レンズを（10X）を使用して歯状回の分子層に配置されます。 </li><li>サブ粒状ゾーン/顆粒細胞層における新生児DGCsは、GFPまたはdTomatoの表現によって識別されます。全細胞patchclampの記録は、高倍率（40倍）下で新生ニューロンに実行されます。 </li><li>記録された細胞の発火特性は、電流クランプモードの下での電流の一連の注入によって得られる。 </li><li>電気刺激は、録音ソフトウェアによって制御される刺激アイソレータを介して刺激電極によって配信され、新生児DGCsにおける誘発性シナプス後電流が記録されます。 </li></ol> 4。データ解析誘発シナプス後応答の振幅は、成人生まれのニューロンの異なる発達段階で分析されています。 5。代表的な結果上記のプロトコルを使用して、 図1と同様に新生児歯状回の神経細胞でGFPの発現は一般的です。新生ニ​​ューロンが容易に可視化すると樹状突起と軸索の両方が確実にラベル付けされることに注意してください。薄いDGC軸索と小さな棘の発現は、ウイルスの質と力価、使用されるプロモーターおよびインビボ発現の長さによって異なります。私たちの手では、新生児の細胞と副細胞小器官は、通常、注射後数日内に、可視、および脊椎の表現であり、開発の初期段階からたどることができます。 W別の時間段階で新生ニューロンからホールセル記録では、成熟（ 図2b）中に既存の神経回路に独自の新生児の細胞特性、例えば活動電位（ 図2a）、だけでなく、シナプス統合のプロセスの研究を可能にする。 <img src="/files/ftp_upload/2548/2548fig1.jpg" alt="図1" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="図1"> 図1成体マウスの水平方向の歯状回のセクションにおける新生児の神経細胞の2光子共焦点画像。緑色の細胞はPUX - GFPレトロウイルスで標識21dpi（日後に注入）GFP発現新生児DGCsです。 <img src="/files/ftp_upload/2548/2548fig2.jpg" alt="図2" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="図2"> 図2）アクション21解像度。Bにおける新生児DGCの潜在的な発火特性を）代表は21 dpiで新生児DGCに記録された興奮性シナプス後電流（EPSCs）を誘発。

<ol><li>Zhao, C., Deng, W., Gage, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+and+functional+implications+of+adult+neurogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Mechanisms and functional implications of adult neurogenesis.</a> Cell. 132, 645-660 (2008).</li>
<li>Ge, S., Goh, E. L., Sailor, K. A., Kitabatake, Y., Ming, G. L., Song, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GABA+regulates+synaptic+integration+of+newly+generated+neurons+in+the+adult+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">GABA regulates synaptic integration of newly generated neurons in the adult brain.</a> Nature. 439, 589-593 (2006).</li>
<li>Gavrilescu, L. C., Van Etten, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+replication-defective+retrovirus+by+transient+transfection+of+293T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Production of replication-defective retrovirus by transient transfection of 293T cells.</a> J Vis Exp. , (2007).</li>
</ol>

利害の衝突は宣言されません。

哺乳類成体脳の海馬における連続的な神経新生は、成熟脳におけるニューロンの発達との統合を研究するユニークな実験モデルのシステムを提供します。ここで紹介するプロトコルは、レトロウイルス標識および成体マウスの脳における新生児歯状回顆粒ニューロンの統合を研究するために電気生理学的手法を組み合わせたもの。 あなたの実験が成功していることを確認するために、我々は、手順の重要なステップの間に次のことをお勧めします。 不要な感染症や炎症を避けるために、すべてのツールは、手術前（オートクレーブ、滅菌器の任意のタイプ、または70％エタノールによって）滅菌してください。注入前にシリンジの針の先端を洗浄する滅菌PBSを使用してください。 ウイルスの注射のために、動物はよく定位固定装置にマウントする必要があると不必要な動きの源は、注入中に最小化する必要があります。頭がよく、固定と会社であることを確認してください、との計算注入座標の前にレベルブレグマとラムダにマウスの鼻の位置を調整します。部屋の温度への曝露を最小限に抑えるために迅速にシリンジにウイルスを抽出する - レトロウイルスは、特に温度に敏感です。圧力の被害を最小限に抑えるために推奨される速度で徐々にウイルスを注入する。推奨フラット先端シリンジ（対一般的な斜めになった先端を）使用すると、均等に分散歯状回の感染症の領域を確保します。 スライスを準備する前に、ソリューションを切断し、ACSFをインキュベートは、酸素が ​​ソリューションを飽和させないために、少なくとも30分間95％O 2 -5％CO 2でバブリングされている必要があります。動物は、速やかに灌流と組織は、最高のスライス品質の寒さ、酸素飽和溶液で維持されるべきである。 シナプス後応答があるまでの記録のために、徐々に刺激強度を増加させる。必要に応じて歯状回の分子層内に刺激電極の位置を変更します。 要約すると、推奨されるアプローチは、アクティブな、成熟した回路に、初期段階の統合の間に明確な特性と成人生まれのニューロンの可能な機能的役割を探索する方法を提供しています。

<ul><li> 110塩化コリン、2.5のKCl、1.3 KH 2 PO 4、25.0炭酸水素ナトリウム、0.5 CaCl 2で 、7のMgCl 2、10デキストロース、1.3アスコルビン酸ナトリウム、0.6ピルビン酸ナトリウム、5.0キヌレン酸：解決策を（mMで）切断。 </li><li>人工脳脊髄液（ACSF、mMで）：125.0塩化ナトリウム、25.0 炭酸水素ナトリウム、2.5のKCl、2のCaCl 2、1.3 KH 2 PO 4、1.3のMgCl 2、1.3アスコルビン酸ナトリウム、0.6ピルビン酸ナトリウム、10デキストロース。 </li><li>全細胞patchclampのための内部溶液（mMで）：120カリウム、グルコン酸、15のKCl、4のMgCl 2、0.1 EGTA、10.0 HEPES、4 MgATP、0.3のNa 3 GTP、7クレアチンリン酸（pH7.4の、300 mOsm）。 </li></ul>

アダルト生まれのニューロンの統合を検討し

Studying the Integration of Adult-born Neurons

神経発生は、側脳室の副室下帯（SVZ）にし、生涯を通じて海馬歯状回のサブ粒状のゾーン（SGZ）における成体哺乳動物の脳で発生します。前回のレポートでは、成人の海馬における神経新生はてんかん、統合失調症、うつ病や不安（1）を含む多様な脳疾患、関連付けられていることが示されている。正常と異常な成人生まれのニューロンの統合のプロセスを解読すると、これらの疾患の病因を明らかにし、新しい治療法の開発を通知することができる。 SGZの成人の神経発生は、運命の仕様、マイグレーション、シナプスの統合、そして成熟の段階を含む、胚および出生後の神経発達を反映しています。しかし、完全な統合は、長期、6週間にわたって行われます。成人生まれSGZ歯状回顆粒細胞（DGCs）への最初のシナプス入力は、14日間（2）におけるグルタミン酸作動性入力に続いて、GABA作動性である。歯状回における成人生まれのニューロンの回路形成を制御する特定の要因は現在のところ不明です。 当研究室では、これらの増殖細胞に蛍光タンパク質と仮説調節遺伝子を提供するモロニーマウス白血病ウイルスを基に複製欠損レトロウイルスベクターを使用しています。このウイルスの技術は、細胞の誕生日、系統、形態、及びシナプス形成の解析のための高い特異性と分解能を提供します。 典型的な実験は、しばしばユニークなラベル、導入遺伝子、およびin vivoで 、目的の発達過程の単一細胞解析のためのプロモーター要素を含む二、三ウイルスを採用しています。次のプロトコルは単一の緑色（GFP）や赤色（dTomato）蛍光タンパク質のレトロウイルスとパッチクランプ電気生理学を用いて機能的な新生ニューロンの統合を分析するための方法を説明します。

成熟した動物で新生児歯状回顆粒細胞の統合を研究する方法が記載されている。この手法は、生体機能の統合に決定するために電気生理学的記録に続いて新生ニューロンを、ラベルを付けるために設計されたレトロウイルスを使用しています。

成体哺乳類の脳における神経新生は、側脳室の下室帯（SVZ）および、...の顆粒層下帯（SGZ）で起こります。

本手順の全体的な目的は、成体で新生した歯状回顆粒細胞の機能的統合を研究する方法を導入することです。まず、成体マウスの歯状回にレトロウイルスを立体定位的に注入し、新生した歯状回顆粒細胞を標識します。次に、特定の時間経過後、マウスを冷切片作成用溶液で灌流し、脳を摘出します。本手順の第3ステップでは、バイブレーターを用いて急性脳切片を調製します。第4ステップでは、新生歯状回顆粒細胞に対してホールセルパッチクランプ記録を行い、急性脳切片の分子層を刺激します。最終的に、新生歯状回顆粒ニューロンにおける誘発後シナプス電流を記録・解析することで、新生ニューロンの機能的なシナプス統合を示す結果を得ることができます。本手法の主な利点は、成体脳における新生ニューロンのレトロウイルスによる標識と、成体動物からの急性脳切片標本の作製が可能であることです。この方法は、成体脳における新生ニューロンの機能的喪失など、成体神経新生の分野における重要な疑問を解決するのに役立ちます。ウイルス注入の準備として、緑色蛍光タンパク質GFPまたは赤色蛍光タンパク質D-tomatoを発現するレトロウイルスをフリーザーから取り出し、氷上で解凍します。4～6週齢の雌マウスを麻酔し、動物1匹あたり2 µLのレトロウイルスを投与します。足指をつまんで麻酔状態を確認し、マウスを脳定位固定装置に固定します。頭部の被毛を剃り、皮膚を70% ethanolで拭き取ります。メスを用いて皮膚を切開し、頭蓋骨を露出させます。0.6 mmのドリルビットを装着した歯科用ドリルを使用し、bgmaとlambdaが同一の水平面上に来るようにマウスの鼻の位置を調整します。ここに示されている座標に従って、頭蓋骨に4つの穴を開けます。解凍したレトロウイルスを、1 µLのHamiltonフラットチップシリンジに迅速に充填します。レトロウイルスを歯状回に注入するため、-2 mm BGMAで作成した孔の1つに合わせます。シリンジを垂直方向に2.5 mmの深さまで下げます。液体の逆流を防ぐため、0.25 µL/minの速度で0.5 µLのレトロウイルスを注入します。各注射後、シリンジをゆっくりと引き抜く前に2分間待機します。滅菌PBSとアプリケーターを用いて、シリンジチップの外表面を軽くすすぎ、血液の痕跡を除去します。同様の手順を用いて、腹側深さ2.5 mmまたは3.2 mmの他の3か所にレトロウイルスを0.5 µLずつ注入します。滅菌済みの外科用縫合糸で傷口を閉じ、新生ニューロンが目的の成熟日に達するまで動物を飼育ケージに戻します。21日が経過した後、必要な溶液を調製し、マウス脳のスライス準備を行います。切断溶液を0～4 °Cの氷上で冷却し、95%酸素、5%二酸化炭素で少なくとも30分間バブリングさせます。人工脳脊髄液（aCSF）を室温に置き、95%酸素および5%二酸化炭素で30分以上バブリングします。30分後、氷上で冷却し、心臓灌流用の酸素飽和切断溶液を準備します。マウスを麻酔後、心臓灌流を行います。その後、速やかに脳を取り出して、切断用溶液とフィルターペーパーを入れたペトリ皿の中に置きます。小脳を切り離した後、注入部位から前方に1～2 mmの位置で冠状断を行い、平坦な面を作ります。これにより、マウントに適した状態になります。脳をVibramプラットフォームに接着します。プラットフォームを、酸素供給済みの切断液で満たしたVibram切断チャンバーに装着します。ブレードを下げ、Vibramの切断ウィンドウを設定します。組織のスライスを開始します。各スライスを正中線に沿って2等分に切断してください。大口径ピペットを使用して、これらのスライスを室温のインキュベーションチャンバーに移します。95% oxygenおよび5% carbon dioxideでバブリングしたTemperature A CSFを用います。海馬の前端が見えるまでスライスを続けます。スライスを32 °Cの水槽中で継続的にバブリングしながら、30〜60分間インキュベートします。記録の間、インキュベーションチャンバーを室温に戻します。これでスライスの記録準備が整いました。まず、32～34 °Cの酸素飽和A CSFを、約2 mL/minで記録チャンバーに灌流させます。大きなボアパペットを使用して、スライスを記録チャンバーへ移します。低倍率下で、ナイロン糸を付けたU字型の白金線をスライスの上に配置し、スライスを固定します。歯状回の中分子層を確認します。次に、刺激電極を歯状回の分子層まで下げます。高倍率下で、緑色または赤色の蛍光タンパク質標識の発現により、下顆粒層または顆粒層にある新生歯状顆粒細胞を同定します。DICフィルターと蛍光フィルターを切り替えながら、GFPまたはD tomatoを発現している新生ニューロンを特定します。ホールセルパッチクランプ記録を行うため、蛍光が比較的強く、細胞体が健全な細胞を選択します。適切な内部液を満たし、チップ抵抗が3〜6 MΩのガラスマイクロピペットを、顕微鏡の高倍率対物レンズ下にあるアンプリファイアヘッドステージのマイクロピペットホルダーに装着します。マイクロマニピュレーターを用いてマイクロピペットを、選択した歯状回顆粒細胞まで降ろし、ホールセルパッチを形成します。カレントクランプモードで一連の電流を注入し、新生ニューロンの発火特性を記録します。刺激電極を介して単一パルスまたはペアパルス電気刺激を与え、誘発されたポストシナプス電流を記録します。ポストシナプス応答が見られない場合は、刺激電極を分子層の別の位置に移動させ、新しい刺激部位から誘発されるポストシナプス電流の記録を試みて下さい。実験終了後、Clampfitを用いて、新生ニューロンから誘発されたポストシナプス応答の振幅を測定します。この図は、GFPレトロウイルスの注入から21日後の成人マウス歯状回における新生ニューロンのGFP発現を示しています。新生ニューロンは容易に視覚化され、樹状突起と軸索の両方が強力に標識されていることに注目してください。樹状突起は、細胞体から歯状回の分子層へと伸びる突起であり、軸索もまた、門（hilos）およびCA3領域で確認できます。この図は、成マウスにP-U-X-G-F-Pレトロウイルスを注入して21日後の、新生歯状回顆粒細胞における全細胞電流クランプ記録を示しています。上のトレースは、電流注入によって誘発された活動電位を示しています。この図は、ウイルス注入から21日後の新生歯状回顆粒細胞において、分子層を刺激することで誘発されたポストシナプス電流を示しています。ポストシナプス応答が存在することは、新生ニューロンがすでに既存の神経回路に組み込まれており、発生後にさまざまな起源を持つENTからのシナプス入力 Receiveしていることを示しています。この手法により、成体脳における新生ニューロンの機能的統合を探索する成体神経新生分野の研究者に道が開かれました。

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