ハイスループットマイクロRNAプロファイリング：最適化されたマルチプレックスフリューダイナミックArrayTMのIFCSでナノリッタースケールでの定量RT - PCR
2011年8月3日
ここでは、サンプルの限られた量を扱う場合は特に、マイクロRNA（miRNA）の発現レベルのコストと時間効果のハイスループットスクリーニングのツールとしてのマイクロ流体プラットフォームとの組み合わせで最適化された多重逆転写定量PCR（定量RT - PCR）プロトコルについて説明します。
この手順の全体的な目標は、マルチプレックス定量R-T-P-C-Rとマイクロ流体プラットフォームを組み合わせることで、マイクロRNA発現を効率的、安価、最小限の出発材料でプロファイリングすることです。これは、抽出されたRNAの濃縮から始まり、その後、マルチプレックス逆転写とマルチプレックスプレアンプリフィケーションが続きます。次のステップは、過剰なプライマーを精製することです。
最後に、シングルプレックスマイクロRNA発現をマイクロ流体プラットフォームを使用してプロファイリングします。その結果、対象サンプル全体で正確で再現性の高いマイクロRNA発現レベルが得られます。既存の方法のこの手法の主な利点は、EMP前増幅後の追加の精製ステップにより、マルチプレックスQ-R-T-P-C-R法の精度と再現性が向上することです。
血清から抽出したRNAから始めます。トリオールのような均質化された組織からのRNA精製キットまたはフェノールクロロホルムベースのRNA法を使用して、すべての抽出に続いて洗浄ステップを行い、すべての保存を摂氏マイナス80度で行う必要があります。RNA溶液を濃縮します。
血清など、限られた量のサンプルから開始する場合は、MicroConサンプルリザーバーをバイアルに挿入し、次にRNA溶液をリザーバーにピペットで入れます。次に、バイアルとフィルターをクラックバンドをローターに向けて遠心分離機に置き、遠心分離を約3時間実行します。3時間後、RNAはメンブレンに完全に集中し、RNAを溶出します。
必要な量のRNAフリー水をメンブレンに加え、リザーバーを反転させて新しいバイアルに入れます。次いで、必要なまでマイナス80°Cで濃縮されたRNAを最大3000回 G.Store して摂氏4度で3分間回転させ、xpl逆ステムループプライマーを用いてRNA上でRT反応を行った後、続いて12〜18ラウンドのPCRサイクルを行う。マイクロRNAはCD NA鎖で表されます。
これをプレPCR産物といいます。近日公開予定のQPCRについて言及します。プレPCR産物は、10塩基対DNAラダーロードとともに10%ポリアクリルアミドゲル上で精製する必要があり、各レーンに5.5マイクロリットルの6 x オレンジGと27.5マイクロリットルのプレPCR製品を組み合わせて
ロードします。ゲルを150ボルトで55〜60分間泳がせます。ロモフェノールブルーは、このゲルの20塩基対領域に作用します。ゲルを泳いだ後、光に触れずに、染色したゲルのシェーカーで25分間サイバーゴールドで染色します。
PCR前製品のバンドを60塩基対から80塩基対に切り取り、ゲルブロックを標識チューブに移します。製品の濃度が低い場合、目に見えない場合がありますが、ゲル内には残ります。次に、チューブ遠心分離でチューブを使用してゲルバンドを粉砕し、300マイクロリットルのTENバッファーを追加します。
緩衝ゲル混合物を攪拌しながら摂氏37度で4時間インキュベートします。4時間後、液体を新しいチューブに移し、さらに300マイクロリットルのTENバッファーを追加します。この混合物を摂氏4度で一晩インキュベートし、攪拌します。
翌日、チューブの内容物を再度移し、PCR前生成物のエタノール沈殿を進めます。チップをパッケージから開封するときは、24時間以内にプライミングし、プライミングから60分以内にロードする必要があります。チップ上の各アキュムレータに150マイクロリットルの制御ライン液を注入することにより、アレイのプライミングを開始します。
チップやインレットに液体をこぼすと、チップが使用できなくなりますのでご注意ください。次に、チップを集積流体回路またはIFCコントローラに配置し、コントローラのプライミングスクリプトを実行します。プログラムが開始されたらすぐに、サンプルの準備を開始します。
まず、presサンプルを調製し、タックマン、ユニバーサルマスターミックス、ローディング試薬の組み合わせをミックスします。次に、96ウェルローディングフォーマットを使用して、各サンプルの2.25マイクロリットルと2.75マイクロリットルのプレサンプルミックスを組み合わせて、ロードされた流体を収集します。プレートを短時間ボルテックスし、摂氏4度で迅速に遠心分離します。
これでサンプルプレートの準備が整いました。次に、新しい96ウェルプレートを使用して、アッセイ混合物の13倍濃度を調製します。これは、ウェルごとに1つのユニバーサルプライマー、フォワードプライマー、および遺伝子特異的タックマンプローブを混合することによって行われます。
1つのX濃度は、ユニバーサルプライマーとフォワードプライマーの場合は1マイクロモル、タックマンプローブの場合は0.2マイクロモルです。次に、最終ウェル容量5マイクロリットルに最終濃度0.25%トゥイーンとなるように十分なトゥイーンを加えます。気泡を避けてよく混ぜ、プレートを短時間回転させて液体を集めます。
これがアッセイプレートです。96.96 Q-R-T-P-C-Rをチップにロードして開始します。最初にサンプルをロードし、次にIFCへのインレットあたり5マイクロリットルの最終容量でアッセイをロードします。
次に、ロードミックススクリプトを実行して、サンプルとアッセイをチップにロードします。スクリプトが終わったら、ロードされたチップから保護フィルムをはがし、粘着テープを使用してチップ表面のほこりや破片を取り除きます。次に、バイオシステム増幅プログラムを設定します。
チップをシステムにロードし、プログラムを実行します。結果は、流体ダイムソフトウェアで分析し、増幅曲線、チップ全体のヒートマップ、およびそれぞれのCT値を提供できます。未加工のポリアクリルアミドゲル、野生型DG CR eightおよびERヌル変異体でサイズ分離して精製したpre PCR産物をよく使用しています。
RNAは、以前のプロトコルと比較して調製されました。精製ステップにより、DGCR eight nullバックグラウンドとER nullバックグラウンドの両方で、より多くのmicroRNAと偽陽性シグナルの損失が発生します。さらに、修正されたQR TPCR Rアプローチにより、希少なD gcr 8つの独立したダイサー依存性small RNAを適切に分類できます。
ここでは、患者と対照群の48のセラを、384の異なるマイクロRNAの発現変化についてスクリーニングしました。データは、対応する中央値を減算することにより、各サンプルについて正規化され、コントロールのスパイクは使用されません。このビデオを見れば、インフルエンザラインプラットフォーム上のマルチプレックスQ-R-T-P-C-Rを使用して、非常に限られたインプットのRNAから開始した場合でも、多くのサンプルで数百のマイクロナーゼを同時にプロファイリングする方法を十分に理解できるはずです。
概要
この記事では、マイクロフロープレートフォームと統合された最適化されたマルチプレックス逆転写酵素定量PCR（qRT-PCR）プロトコルを提示し、マイクロRNA（miRNA）の発現レベルの効率的なプロファイリングのために設計されています。この方法は、限られたサンプル量の研究に特に有利です。
主要な研究構成要素
科学の分野
- 神経科学
- バイオテクノロジー
- 分子生物学
背景
- マイクロRNAは遺伝子調節に重要な役割を果たします。
- miRNAのプロファイリングの従来の方法はリソースを多く必要とします。
- マイクロフロープレートフォームは高スループット機能を提供します。
- プロトコルの最適化により、精度と再現性が向上します。
研究の目的
- miRNA発現プロファイリングのための費用対効果が高く時間効率の良い方法を開発すること。
- 分析に必要な開始物質の量を最小限に抑えること。
- qRT-PCR結果の精度と再現性を向上させること。
使用された方法
- 血清サンプルからのRNAの抽出と濃縮。
- miRNAのマルチプレックス逆転写と事前増幅。
- ポリアクリルアミドゲル電気泳動による事前PCR産物の精製。
- 高スループットqRT-PCRのためのマイクロフロープレートフォームの利用。
主要な結果
- miRNA発現レベルの精度と再現性の向上。
- サンプル間での384種類の異なるマイクロRNAのプロファイリングの成功。
- 変異体背景における偽陽性の信号の減少。
- 希少な小RNAの分類の改善。
結論
- 最適化されたプロトコルは、高スループットmiRNA分析に効果的です。
- この方法は、サンプル利用可能性が限られた研究に適用できます。
- 将来の応用には、様々な生物学的文脈におけるmiRNAプロファイルのより広範なスクリーニングが含まれる可能性があります。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Accurate microRNA profiling is critical for target validation and biomarker discovery in early drug development, particularly when working with limited clinical samples. This optimized multiplex qRT-PCR method on microfluidic platforms enhances data reliability while reducing reagent consumption, supporting cost-effective high-throughput screening. The purification step addresses a key limitation in existing methods, improving confidence in downstream mechanistic and translational decisions.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by providing accurate miRNA expression data across disease models.
- Operational Value: Reduces false positive signals through primer purification, increasing target validation confidence.
- Predictive Value: Supports categorization of rare small RNAs, aiding in the identification of novel regulatory mechanisms.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Allows simultaneous profiling of 384 miRNAs, enabling comprehensive biomarker screening campaigns.
- Operational Value: Microfluidic nanoliter format significantly reduces reagent costs and sample input requirements.
- Assay Readiness: Purified pre-PCR products ensure reproducible singleplex detection, improving assay standardization.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Generates quantitative, normalized miRNA expression data suitable for cross-study comparison and biomarker alignment.
- Preclinical Modeling: Demonstrated utility in mutant backgrounds (DGCR8, DICER) supports validation of disease-relevant systems.
- Risk De-risking: Improved accuracy reduces biological ambiguity in target selection and pathway analysis.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from early target hypothesis testing through lead optimization, where reliable miRNA expression data informs target prioritization and mechanism of action studies.
- Discovery Biology: Supports pathway clarification and functional validation by delivering reproducible miRNA profiles from limited starting material.
- Screening: Enables high-throughput, multiplexed miRNA expression analysis with quantitative CT outputs for hit selection.
- Analytics: Provides normalized expression values (via median subtraction) that allow cross-sample comparison and statistical evaluation.
- Translational Research: Generates biomarker-relevant data applicable to preclinical validation and early clinical correlation.
- Enterprise Reuse: Microfluidic platform compatibility allows reuse across projects, standardizing miRNA profiling workflows.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation through accurate, reproducible miRNA quantification.
- Operational Value: Standardization via microfluidic automation and purification-enhanced specificity.
- Strategic Value: Enables better go/no-go decisions by reducing biological false positives in screening campaigns.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of targets with improved mechanistic de-risking.
Implementation Considerations
- Requires expertise in RNA handling, gel-based purification, and microfluidic chip operation.
- Dependent on access to Fluidigm Dynamic Array IFCs and compatible qPCR instrumentation.
- Necessitates standardized protocols for RNA concentration and primer removal across teams.
- Adaptation to alternative model systems requires validation of purification efficiency and miRNA recovery.
- Practical limitation: Gel-based purification step adds hands-on time compared to fully automated methods.
