ハイスループットマイクロRNAプロファイリング：最適化されたマルチプレックスフリューダイナミックArrayTMのIFCSでナノリッタースケールでの定量RT - PCR

本手順の全体的な目的は、マルチプレックス定量的RT-PCRとマイクロ流体プラットフォームを組み合わせることで、少ない初期サンプル量で、効率的かつ低コストにマイクロRNAの発現プロファイルを解析することです。まず、抽出したRNAを濃縮し、続いてマルチプレックス逆転写およびマルチプレックス前増幅を行います。次のステップでは、過剰なプライマーを精製して除去します。

最後に、マイクロ流体プラットフォームを用いてシングルプレックスのmicro RNA発現プロファイルを作成します。その結果、目的のサンプル間で正確かつ再現性の高いmicro RNA発現レベルが得られます。既存の手法に対するこの技術の主な利点は、pre-EMP増幅後の追加の精製ステップにより、マルチプレックスQ-R-T-P-C-R法の正確性と再現性が向上することです。

血清から抽出したRNAを用意します。RNA精製キットまたはTRIzolなどのホモジナイズした組織を用いたフェノール・クロロホルム法によるRNA抽出を行い、すべての抽出後に洗浄工程を加え、すべての保存は-80°Cで行ってください。その後、RNA溶液を濃縮します。

血清などの少量のサンプルから開始する場合は、まずMicroConサンプルリザーバーをバイアルに挿入し、ピペットチップでメンブレンに触れないよう細心の注意を払いながら、RNA溶液をリザーバーにピペットします。次に、バイアルとフィルターを、クラックバンドがローター側に来るように遠心分離機にセットし、約3時間遠心分離を行います。3時間後には、RNAがメンブレン上に完全に濃縮され、RNAを溶出させることができます。

膜に希望量のRNaseフリー水を加え、リザーバーを反転させて新しいバイアルに入れます。その後、4°Cで最大3000 ×gで3分間遠心分離します。濃縮したRNAは、使用するまで-80°Cで保存してください。xplリバースステムループプライマーを用いてRNAでRT反応を行い、続いて12〜18サイクルのPCRを行います。これにより、microRNAがcDNAストランドとして的に増幅されます。

これをPCR前産物と呼びます。次に行うqPCRに使用します。このPCR前産物を、10 bp DNAラダーと共に10%ポリアクリルアミドゲルで精製する必要があります。各レーンに、6x orange G 5.5 µLとPCR前産物 27.5 µLを混合してロードしてください。

ゲルを150 Vで55〜60分間電気泳動します。Romoフェノールブルーは、このゲルの20 bp領域に泳動されます。泳動後、光を遮断してシェーカー上で25分間、Cyber Goldでゲルを染色します。

60から80塩基対のPCR産物バンドを切り出し、ゲルブロックをラベル付きチューブに移します。産物濃度が低い場合は視認できない可能性がありますが、ゲル内には存在しています。次に、チューブ・イン・チューブ遠心分離を用いてゲルバンドを破砕し、300 µLのTEN緩衝液を加えます。

バッファーゲル混合液を37°Cで4時間、撹拌しながらインキュベートします。4時間後、液体を新しいチューブに移し、TENバッファーをさらに300 µL加えます。この混合液を4°Cで一晩、撹拌しながらインキュベートします。

翌日、チューブの内容物を再度移し、pre PCR産物のエタノール沈殿を行います。チップをパッケージから取り出した後は、24時間以内にプライミングを行い、プライミング後60分以内にサンプルをロードさせる必要があります。チップ上の各アキュムレーターに150 µLのコントロールライン液を注入し、アレイのプライミングを開始してください。

チップやインレットに液体をこぼさないように注意してください。こぼすとチップが使用不能になります。次に、チップを統合流体回路（IFC）コントローラーにセットし、コントローラーのプライミングスクリプトを実行します。プログラムが開始されたら、すぐにサンプルの調製を開始してください。

まず、presサンプルを調製します。tack man、universal master mix、およびローディング試薬を混合します。次に、96ウェルローディング形式を用いて、各サンプル 2.25 µLとpresサンプルミックス 2.75 µLを合わせて、ロード液を回収します。プレートを短時間ボルテックスし、4 °Cで迅速に遠心分離します。

サンプルプレートの準備が完了しました。次に、新しい96ウェルプレートを使用して、アッセイミックスを13倍の濃度で調製します。これは、各ウェルにユニバーサルプライマー、フォワードプライマー、および遺伝子特異的TaqManプローブを混合することで行います。

1×濃度の組成は、ユニバーサルプライマーおよびフォワードプライマーが1 µM、TaqManプローブが0.2 µMです。次に、最終ウェル容量5 µLにおいてTweenの最終濃度が0.25%となるようにTweenを添加します。気泡が入らないようによく混ぜ、プレートを軽く遠心して液を集めます。

これがアッセイプレートです。チップに液体を注入して、96.96 Q-R-T-P-C-Rを開始します。まずサンプルを注入し、次に各インレットあたり最終容量5 µLのアッセイ液をIFCに注入します。

次に、load mixスクリプトを実行して、サンプルとアッセイをチップにロードします。スクリプトの完了後、ロード済みチップから保護フィルムを剥がし、粘着テープを使用してチップ表面のほこりやゴミを除去します。これで、バイオシステムの増幅プログラムを設定します。

チップをシステムにロードし、プログラムを実行します。結果はFluid Dimeソフトウェアで分析し、増幅曲線、チップ全体のヒートマップ、およびそれぞれのCT値を算出します。ここでは、ネイティブポリアクリルアミドゲルによるサイズ分離で精製した、野生型DGCR8およびERヌル変異体のプレPCR産物を使用しています。

従来のプロトコルと比較して、RNAの調製方法を変更しました。精製ステップを導入したことで、DGCR8欠損およびER欠損の両方の背景において、より多くのmicroRNAが回収され、偽陽性シグナルが減少しました。さらに、改良されたqRT-PCR法により、希少なDGCR8非依存性かつDicer依存性のsmall RNAを適切に分類することが可能になりました。

ここでは、患者および対照群から得られた48検体のceraを用いて、384種類の異なるmicroRNAの発現変化をスクリーニングしました。データは、対照群にスパイクインを使用せず、各サンプルから対応する中央値を差し引くことで正規化しました。このビデオを視聴することで、入力RNAが非常に限られている場合でも、FluQuantプラットフォームを用いたマルチプレックスQ-R-T-P-C-Rを使用して、多くのサンプルにわたる数百種類のmicroRNAを同時にプロファイリングする方法について深く理解できるはずです。