培養海馬ニューロンの樹状突起棘の蛍光タグ融合タンパク質の光退色後蛍光回復（FRAP）

FRAPは、緑色蛍光タンパク質（GFP）タグ付き培養細胞中のタンパク質の移動度を定量化するために使用されています。我々は、光退色後蛍光回復の割合を分析することにより、GFPのモバイル/不動の分画を検討した。本研究では、FRAPは、海馬ニューロンのスパインで行われました。

この手順の全体的な目標は、関心領域におけるタンパク質のfrapを測定することにより、増強された緑色蛍光タンパク質の移動度を決定することです。これは、培養ラット海馬ニューロンのEGFPベクターを最初にトランスセクトすることによって達成されます。Next Fre Recordingは、Zeiss seven 10共焦点顕微鏡を使用して目的の脊椎で行います。

その後、Image JとGraphPad Prismソフトウェアを使用して光退色率を計算できます。最終的には、共焦点顕微鏡法により、培養された海馬ニューロンから脊椎におけるEGFPの可動性を示す結果を得ることができます。このプロトコルは、Chazenが私、Ronald Pet、Ya、Wang Bahar Kisha、および2009年10月に亡くなった元の論文の筆頭著者であるRobert Olと共同で開発しました。

私たちはこのビデオを彼の記憶に捧げます。この方法は、関心領域における関心タンパク質の代謝回転率など、タンパク質ダイナミクス分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この手順を開始する前に、トランスフェクションを開始する前に、クローン技術Cal Foss哺乳類トランスフェクションキットを使用して、ポリデリジンコーティングされたmattec 35ミリメートルガラスボトムディッシュで16〜18日間のin vitroトランスフェクションニューロンで胚の18日目ラット海馬ニューロンを培養することから始めます。

元の培地は、後で使用するために滅菌済みの15ミリリットルチューブに保存してください。トランスフェクションの30分前に、各35mmディッシュに1.5ミリリットルのDOL ecoの改変イーグル培地を入れます。次に、10マイクログラムのP-E-G-F-P-N 1つの血漿DNAと12.4マイクロリットルの2モルカルシウム溶液を組み合わせ、滅菌水で総容量を最大100マイクロリットルにします。

DNA混合物DROPWISEを100マイクロリットルの2つのxヒープ緩衝生理食塩水に加えます。各ドロップが追加された後にバッファーをボルテックスします。最終混合物を室温で20分間放置した後、緩衝DNA溶液をDMEMインキュベートニューロンに加えます。

ニューロンを摂氏37度で1〜1時間半インキュベートします。インキュベーション後、リン酸カルシウム含有培地を培養皿から取り出し、DMEMで細胞を洗浄します。DMEM洗浄を合計3回繰り返します。

DMEM培地を元の培地と交換してから、インキュベーターに戻します。ニューロンは、トランスフェクションの2〜4日後にフラッキング実験に使用されます。まず、35mmガラス底皿の培地をすぐにプレウォームチロ溶液と交換します。

Zeiss LSM seven 10共焦点顕微鏡は、フラック実験に使用されます。Zeissの臨時モジュールシステムは、作業システムの温度、湿度、および二酸化炭素の割合を維持します。二酸化炭素タンクが接続されていること、および湿度のバランスをとるために使用されるウォーターボトルが水で満たされていることを確認してください。

顕微鏡をセットアップしたら、100 x 対物レンズでトランスフェクションされた成熟樹状突起を見つけます。ディッシュ内のトランスフェクションされた細胞がまばらな場合は、40 x 対物レンズで目的の細胞を検索します。次に、100 x 対物レンズに切り替えます。

画像をキャプチャするには、5 倍の光学ズームと 2 56 x 2 56 ピクセルの解像度を使用します。いくつかの棘を持つ短い樹状突起をイメージします。画像をキャプチャするには、公称速度9を使用します(これには0.5秒かかります)。

スキャンを終了するには、ピンホールを2マイクロメートルに設定して、強力な蛍光を取得します。画像を撮影するときは、画像全体の光退色を避けるために、レーザー透過率を1〜5%など低くしてみてください。次に、この実験で目的の背骨を選択します。

脊椎頭部径が約1マイクロメートルのキノコ棘を選抜し、ラップ実験を行います。漂白する前に5つの制御画像を撮影し、公称100%で目的の脊椎を10回漂白しますレーザー透過率 漂白直後に一連の画像をキャプチャします。時間間隔は、さまざまなターゲティングタンパク質とさまざまな実験デザインに従って調整する必要があります。

この実験では、漂白後15秒間、毎秒画像を撮影します。次に、データを分析するために画像を保存します。Image Jソフトウェアで画像を開くと、位置合わせツールを使用して画像のスタックを整列させ、目的の背骨が浮かず、同じ位置に留まるようにします。

画像上で、トランスフェクションされたが漂白されていない領域である目的の脊椎の相対的な蛍光強度を測定します。画像の強度対時間モニターツールを使用して、タイムラプス画像の背景領域を測定します。GraphPad Prismソフトウェアまたは他の同様のソフトウェアで、背景領域曲線が蛍光強度を一相指数方程式で適合させるため、非蛍光領域を使用します。最後に、蛍光の移動性および不動性の割合を計算します。表示。

これは、培養された海馬ニューロンからの脊椎におけるEGFP蛍光のフラック測定値です。背骨のコントロールと背景の領域がマークされ、赤い矢印は写真の漂白の時間を示します。同じ領域の写真は、写真漂白前と0、1、5、10、および15秒後に撮影されました。

EGFP蛍光のFRA曲線は15秒間にわたって示され、曲線上のドットは毎秒のFRAを表しています。曲線は、1 つの位相指数方程式によって近似されました。光退色前の平均蛍光は100%と数えられましたこの実験では、移動画分は87%、不動画分は13%Aです。

このビデオを見れば、FRAPPE技術を使用してA GFPタグ付きタンパク質の移動度を測定する方法について十分に理解できるはずです。