Name: 開発ゼブラフィッシュ前脳におけるクローン関連の神経前駆細胞のタイムラプスライブイメージング (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-04-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 49 s
Description: 学ぶ ゼブラフィッシュ前脳の神経前駆細胞のタイムラプスライブイメージング法。電気穿孔と共焦点顕微鏡を組み合わせ、個々の細胞のin vivo発達を観察します。この手法は神経発生と脳発達の理解に貢献します。

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この作業はtheNIH grantNS042626によってサポートされていました。我々は、クルトソーンとイメージングの支援のためのUCSFニコンイメージングセンターに感謝します。

1。ゼブラフィッシュ胚の調製<ol><li>エレクトロ二日前、女性とは別の男性にディバイダを使用して、野生型の魚の交尾ケージを設定。 </li><li>エレクトロポレーションの前にある日は、前日からケージを交配することで仕切りを引き出します。 </li><li>胚を収集し、28.5で0.003％フェニルチオ尿素（PTU）を含む30ミリリットル胚培地℃で50受精胚をインキュベート</li><li>エレクトロポレーションの日に、胚が22hpfの発達段階に達したときに微細な鉗子（イノックス5、デュモン電子、スイス）と手動で胚dechorionate。その後、0.003％のPTUを含む10ミリリットルエレクトロポリンガーの3（180 mMのNaCl、5mMのKClを、1.8 mMの塩化カルシウム、5mMのHepes緩衝液pH7.2）に胚を移す。 </li><li>呼出音が胚を麻酔だ10mlのエレクトロポレーション、420μlのtricaine株式（4mg/ml）を追加します。 </li></ol> 2。エレクトロポレーションのための準備<ol><li>ガラスの注射針は、フレーミング、ブラウンP897プラー（サッタインスツルメンツ、ノヴァト、カリフォルニア州、米国）で（1.2 mm外径、0.9mmのID、フィラメントを持つ）の毛細血管から引っ張られた。針の先端は、図1Dに示すように鋭い端を得るために鉗子で中断してしまった。先端の直径は10μm程度である必要があり、テーパー角度は30度前後となるはずです。 </li><li>エレクトロポレーションリンゲル溶液で0.8％、1％低融点アガロース（シェルトンサイエンティフィック社カタログ＃IB70050を）準​​備する。 2 mlのマイクロチューブに分注しアガロース溶液。 〜37℃でヒートブロックに分注しておく</li><li> Gal4/UASシステムは、エレクトロポレーション胚の神経前駆細胞における遺伝子発現を駆動するために使用されます。二つのプラスミドが使用されています：プラスミドGal4FFがEF1αユビキタスプロモーターによって駆動されるEF1α- GFF - PT2KXIG、、そしてプラスミドUAS - E1B - EGFP - PT2KXIGを。 </li><li> EF1α- GFF - PT2KXIGとGenEluteTM HPプラスミドミディプレップキット（Sigma）を使用してUAS - E1B - EGFP - PT2KXIGプラスミドDNAを準備します。 </li><li>プラスミドを、10mMトリス· Clの1〜2μgの/μlの最終濃度（PH 8.5）に酢酸ナトリウム/エタノール沈殿により濃縮されています。 </li><li>二つのプラスミドを混合し、各プラスミドに500 ng /μLの中の最終濃度にヌクレアーゼフリー水で希釈する。ソリューションへのフェノールレッドの加算は、（総容積1 / 10に希釈）配信の可視化に適しています。氷の上にDNA溶液を保管してください。 </li><li>右2μlのDNA溶液とエレクトロポレーション、積み込む注射針の前に、2 NLへの注入量を調整する。 </li></ol> 3。エレクトロポレーション<ol><li> steroの解剖顕微鏡（50倍の最大倍率を持つツァイスSTEMI 2000）、エア圧力インジェクター（ナリシゲIM 300インジェクター）、2つのマニピュレーター（WPI M3301R、世界の精密機器、サラソタ、フロリダ州、米国）、及び電気刺激（SD9図1Aに示すように方形パルス刺激、グラスTlefactor、ウエストワーウィ​​ック、ロードアイランド州、米国）が設定されています。 </li><li> 1％低融点アガロースで胚、浸漬2胚をマウントする。その後すぐにガラスピペットでアガロースから胚を削除します。 </li><li>アガロースの個々の滴で反転プラスチックシャーレの蓋に胚を置きます。アガロースは、脳が電極とマイクロインジェクションの針（図1B）の両方にアクセスできるように固化する前に、背アップ位置までファイバープローブで軽く胚を親しませる。胚は、個々のアガロースドロップにマウントされている必要があります。 </li><li>左のマニピュレータで電極を操作する。図1Bに示すように、アガロースに電極を挿入します。カスタムプラチナイリジウムパラレルバイポーラ電極を直径と間隔が500μmで125μmのは、離れてエレクトロポレーション（FHC、カタログ＃PBSA0575）に使用されます。 </li><li>前脳の脳室内にマイクロインジェクションの針を挿入し、赤い液体が流れると心室の腫脹が観察できるように、4nl DNAミックスを注入する。 </li><li>すぐに、一28.5 Vパルス持続的な1ミリ秒は手動で適用した。その後、極性を逆にし、複数28.5 Vパルス持続する1ミリ秒を適用します。これは、前脳の神経前駆細胞の二国間のモザイクのラベルになります。 </li><li> 10胚のエレクトロポレーション後、胚を解放するために顕微ナイフで胚とアガロース皮をカバーするために5ミリリットル胚培地を加える。 </li><li> 28.5で0.003パーセントPTUとインキュベートを含む30ミリリットル胚培地の新鮮な料理℃にエレクトロポレーション胚を転送する</li></ol> 4。マウントとコマ撮りライブイメージング<ol><li>落射蛍光解剖顕微鏡下で観察した場合、エレクトロポレーション後4時間程度、EGFPのシグナルが観測される。 </li><li>エレクトロポレーションから5時間後の、非常にモザイクが前脳の領域に強いEGFPの発現と胚を選択する。 </li><li> 0.003％のPTUを含む10ミリリットル胚培地に選択された胚を移す。 </li><li> 10ミリリットル胚培地tに420μlのtricaine株式（4mg/ml）を追加Oは、胚を麻酔。 </li><li>胚をマウントするには、0.8％低融点アガロースに1胚を浸す。その後すぐにガラスピペットでアガロースから胚を削除と35mmガラスボトムディッシュ（マテック株式会社、部品番号P35GC - 1.5 - 10 - C、の中心に胚を置く<a href="http://www.glass-bottom-dishes.com/">www.glass -ボトムdishes.com</a> ） 。 </li><li>アガロースが固まる前に背アップ位置までファイバープローブで軽く胚を親しませる。 </li><li>図1C（我々は上右の目標とニコンC1スペクトル共焦点顕微鏡を使用）に示すように共焦点顕微鏡の温度制御されたステージ上で適切に皿を置きます。 28.5温度を調整して℃に</li><li> 3ミリリットル28.5 °の胚をカバーするためにPTU 0.003％含むC予熱胚培地を追加。胚は、現在のイメージングのための準備ができています。 </li><li>水浸対物レンズを用いて一定の間隔でタイムラプスライブイメージングを実行します。 </li></ol> 5。代表的な結果図2に示すように22 HPFでEF1α- GFF + UAS - E1B - EGFPのエレクトロ胚のタイムラプス共焦点ライブイメージングのフレームが選択されています。 <img src="/files/ftp_upload/2594/2594fig1.jpg" alt="図1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図1"> 図1の装置において、設定する。エレクトロポレーション装置の（A）組立：グラスSD9方形パルス刺激（i）を、左のマニピュレータ（II）、電極（III）、ツァイス解剖顕微鏡（IV）、注射針（V）、右のマニピュレータ（VI）とナリシゲIM 300マイクロインジェクター（VII）。 （B）の電極（i）は、前脳脳室（II）及び注射針（iii）の相対位置。赤い色のDNA溶液が前脳の脳室に注入されています注意してください。 （C）ニコンC1共焦点顕微鏡でライブイメージングのアセンブリ：温度調節器（i）は、客観LEN（II）とガラスの底の培養皿（ⅲ）（Dの低融点アガロースに埋め込まれているエレクトロポレーション胚を浸漬する水DNAのマイクロインジェクションのためのプルアップとカット針の）イメージ。 <img src="/files/ftp_upload/2594/2594fig2.jpg" alt="図2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図2"> 図2。22 HPFでEF1α- GFF + UAS - E1B - EGFPとエレクトロ胚の18時間のタイムラプス共焦点ライブイメージングの選択されたフレーム。心室の表面には、各画像フレームの底面側にあります。スケールバーは10μmを表す。

<ol><li>Temple, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+development+of+neural+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The development of neural stem cells.</a> Nature. 414, 112-117 (2001).</li>
<li>G#246;tz, M., Huttner, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cell+biology+of+neurogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The cell biology of neurogenesis.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 6, 777-788 (2005).</li>
<li>Cerda, G. A., Thomas, J. E., Allende, M. L., Karlstrom, R. O., Palma, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroporation+of+DNA%2C+RNA%2C+and+morpholinos+into+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Electroporation of DNA, RNA, and morpholinos into zebrafish embryos.</a> Methods. 39, 207-211 (2006).</li>
<li>Hendricks, M., Jesuthasan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroporation-based+methods+for+in+vivo%2C+whole+mount+and+primary+culture+analysis+of+zebrafish+brain+development%5BTitle%5D)+AND+%22Neural.+Dev%22%5BJournal%5D)">Electroporation-based methods for in vivo, whole mount and primary culture analysis of zebrafish brain development.</a> Neural. Dev. 2, 6-6 (2007).</li>
<li>Tawk, M., Bianco, I. H., Clarke, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Focal+electroporation+in+zebrafish+embryos+and+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Focal electroporation in zebrafish embryos and larvae.</a> Methods Mol. Biol. 546, 145-151 (2009).</li>
<li>Tawk, M., Tuil, D., Torrente, Y., Vriz, S., Paulin, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-efficiency+gene+transfer+into+adult+fish%3A+a+new+tool+to+study+fin+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">High-efficiency gene transfer into adult fish: a new tool to study fin regeneration.</a> Genesis. 32, 27-31 (2002).</li>
</ol>

利害の衝突は宣言されません。

このビデオでは、我々は開発ゼブラフィッシュの脳のクローンレベルでの神経前駆細胞のタイムラプスライブイメージングのための方法を示しています。我々はテストされ、既存のエレクトロポレーションプロトコル4-6遺伝的および蛍光個々の神経前駆細胞を標識するように変更。少数の細胞がまばらにエレクトロポレーションの相対的な低電圧で標識されて以来、クローン的に関連する子孫細胞で構成される系統樹を確立することができます。 EGFPに加えて、神経前駆細胞は、subcellularly単に他の蛍光マーカーでEGFPを置き換えることにより、種々の蛍光タンパク質で標識することができます。核が赤色蛍光タンパク質で標識される一方で例えば、EF1α- GFFがUAS - E1B - memberane - EGFPとUAS - E1B - H2B - MRFPと共同エレクトロされて​​いる場合、個々の前駆細胞の膜は、緑色蛍光タンパク質で標識されます。ライブイメージング中に観察されたエレクトロ胚といくつかのアポトーシスの一般的な正常な発達により明らかなように標識した前駆細胞のほとんどは健康です。また、胚をマウントし、細胞の健康を保つために共焦点ライブ...

開発ゼブラフィッシュ前脳におけるクローン関連の神経前駆細胞のタイムラプスライブイメージング

Time-lapse Live Imaging of Clonally Related Neural Progenitor Cells in the Developing Zebrafish Forebrain

神経前駆細胞の分裂、遊走や分化の正確なパターンは、適切な脳の発達と機能の1,2に不可欠です。 生体内環境における複雑な神経前駆細胞の挙動を理解するために、無傷の脳内の神経前駆細胞のタイムラプスライブイメージングは、批判的に必要となります。このビデオでは、我々はin vivoでの脳の神経前駆細胞の発達を視覚化するためにゼブラフィッシュ胚のユニークな機能を利用する。我々は遺伝的にとまばらに個々の神経前駆細胞を標識するためにエレクトロポレーションを使用してください。簡単に言えば、DNAは、蛍光マーカーのためのコーディング構造22時間後に受精の前脳の脳室に注入した（HPF）ゼブラフィッシュの胚と電気パルスは即座に配信されていました。 6時間後、エレクトロポレーションゼブラフィッシュの胚をガラス底の培養皿に低融点アガロースでマウントされた。蛍光標識した神経前駆細胞は、水浸対物レンズを用いて共焦点顕微鏡下で一定の間隔で36hoursのために画像化した。本方法は、前脳の神経前駆細胞のin vivoでの開発に洞察を得るために手段を提供し、ゼブラフィッシュの胚の中枢神経系の他の部分に適用することができます。

現在のビデオは、開発ゼブラフィッシュの脳内の個々の神経前駆細胞のライブイメージングを実行するためのエレクトロポレーション、共焦点顕微鏡の組み合わせを活用する方法を示しています。<em&gt; in vivoで</emクローンレベルで前脳の神経前駆細胞の発達の&gt;分析は、この方法で達成することができます。

神経前駆細胞の分裂、遊走、分化の精密なパターンは、脳の適切な発達と機能にとって極めて重要です1,2。...

本実験の目的は、ゼブラフィッシュ胚のタイムラプスライブイメージングを通じて、個々の前脳神経前駆細胞のin vivoでの発生を観察することです。これは、まばらに配置された前脳神経前駆細胞を標識する蛍光マーカーをコードするDNAコンストラクトをエレクトロポレーションすることで達成されます。エレクトロポレーションした胚を低融点アガロースで固定し、麻酔をかけた状態でタイムラプス共焦点顕微鏡を用いてイメージングを行います。結果は、特定の前脳神経前駆細胞のin vivoにおける発生を示しています。この手法は、前脳神経前駆細胞のin vivoでの発生に関する知見を提供できます。また、脳膜、脳幹、脊髄など、中枢神経系の他の領域にも適用可能です。本手法、および単細胞期のDNAまたはRNA注入などの既存手法の主な利点は、任意の発生段階において標的を正確に指定できることです。このプロトコルは、エレクトロポレーション実施予定日の前日から開始します。午前中に、交配させたゼブラフィッシュから受精卵を50個回収し、フェニルチオウレア（PTU）を含む胚培地で胚を浸します。浸漬した胚を28.5 °Cで22時間インキュベートし、翌日に備えます。受精後22時間で、胚はエレクトロポレーションが可能な状態になります。まず、微細ピンセットを用いて胚を手動でコーティングします。次に、コーティングした胚をPTUを含む10 millilitersのエレクトロポレーション用リンガー液に移し、胚を麻酔します。4 mg/mL濃度のTricaストック溶液420 µLを溶液に加えます。これで胚がエレクトロポレーションに準備できたことになります。次に、エレクトロポレーションに必要な注入針を準備します。ガラスキャピラリーを延伸し、ピンセットで先端を折って、鋭い0.2の低融点に仕上げます。また、エレクトロポレーション用リンガー液に懸濁させた1%溶液と、マウント用の胚培養培地に含まれる0.8%溶液を含む、アグロ溶液も必要です。これら2種類の異なるアグロ溶液を2 mLマイクロ遠心チューブに分注し、ヒートブロックを用いて約37 °Cで準備しておきます。本プロトコルでは、神経前駆細胞における遺伝子発現を誘導するためにGAL4-UASシステムを使用します。2種類のプラスミドを使用します。一方はGAL4ffを普遍的に発現させ、もう一方はGAL4ffに応答してGFPを発現させます。両方のプラスミドはキットを用いて調製し、10 mM Tris-HCl溶液中での酢酸ナトリウム・エタノール沈殿法により、濃度を1〜2 µg/µLに濃縮します。プラスミド濃度を決定した後、両方のプラスミドをヌクレアーゼフリーウォーターを用いて単一の溶液にまとめ、500 ng/µLに希釈します。この濃度で、溶液の導入を可視化するためにまとめて評価し、全溶液量の10%のフェノールレッドで染色します。これで溶液はエレクトロポレーションに準備が整ったため、氷上に置いてください。エレクトロポレーション装置は、最大倍率50倍の実体解剖顕微鏡で構成されています。この装置には、空気圧注入器、2台のマイクロマニピュレーター、および電気刺激装置が装備されています。左側のマイクロマニピュレーターに取り付けられた電極は、カスタム製の白金イリジウム平行バイポーラ電極です。エレクトロポレーションを行う直前に、注入針に2 µLのDNA溶液をバックロードし、注入量を4 nLに調整します。ここからの手順（胚の固定、浸漬、および1%低融点アガロース溶液からの2個の胚の迅速な取り出し）は、習熟するための練習が必要です。ガラスピペットを用いて、それぞれをプラットフォーム上またはディッシュ内のagroの液滴に転移させます。agroが凝固する前に、ファイバープローブを使用して胚をゆっくりと背側を上にした状態で方向付けます。これにより、電極とマイクロインジェクション針の両方で前脳にアクセスできるようになります。準備したすべての胚が10個の液滴すべてにロードされるまで、この操作を繰り返します。電極をエアロスに挿入し、マイクロインジェクション針を前脳室に挿入します。ここで、4 nLのDNAミックスを注入します。流れに注意し、心室の膨張を観察します。膨張が観察された直後に、持続時間1 msの0.5 Vパルスを4回（2回ずつ交互に）印加します。これら4つのパルスは、逆極性で印加する必要があります。その結果、4つの脳神経前駆細胞に両側性のモザイク標識がなされます。次に、注入針を前脳から抜き、ステージを次の胚まで移動させます。残りの各胚に対して、注入とエレクトロポレーションの工程を繰り返します。10個すべての胚に電気穿孔を行った後、胚を移動させるために5mLの胚培養液を注ぎます。マイクロサージカルナイフでアガロースを剥がし、30mLの胚培養液が入った新しいディッシュに胚を移動させます。イメージングを行う前に、電気穿孔から約4時間後まで、胚を28.5°Cでインキュベートします。EGFPシグナルが観察されます。エレクトロポレーションの1時間後または5時間後に落射蛍光解剖顕微鏡で観察し、brainin領域の4箇所に、モザイク状ではあるが強いEGFP発現が見られる胚を選択します。選択した胚を10 mLの培地に移し、濃度4 mg/mLのtricaストック液を420 µL添加して麻酔をかけます。イメージングは、正立対物レンズを備えた共焦点顕微鏡の温度制御ステージ上で行います。ステージの温度を28.5 °Cに設定して、顕微鏡の準備をします。また、胚培養液を28.5 °Cに予熱しておきます。胚を固定するには、ガラスピペットを使用して胚を短時間 agarose に浸し、35 millimeter のガラスボトム培養皿の中心に配置します。agarose が凝固する前に、ファイバープローブを用いて胚をゆっくりと背側が上になるように向きを整え、3 milliliters の予熱済み培地で覆います。これで、水浸対物レンズを用いた固定間隔のタイムラプス生体イメージングの準備が整いました。ここに、1つの神経前駆細胞のタイムラプス共焦点画像を示します。この方法を用いることで、受精後28.5時間から41.5時間の間に、この細胞が移動し、2回分裂する様子を観察することができます。レーザー出力を最小限に抑え、胚に培地を補充することで、受精後60時間まで連続的に画像を撮影することが可能です。このビデオを視聴することで、遺伝的に標識された神経前駆細胞へのエレクトロポレーションの実施方法、およびエレクトロポレーション後の胚の取り扱い方法について十分に理解できるはずです。共焦点タイムラプスレベルイメージングにおいて、習熟すれば、適切に行うことでこのエレクトロポレーションは1時間以内に完了できます。

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