Name: 運動誘発性リンパ球のアポトーシスの決定のための指先穿刺の採血方法 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-02-24T17:30:00.000+00:00
Duration: 4 min 37 s
Description: 学ぶ運動誘発性リンパ球アポトーシスの迅速測定法。指先穿刺採血とフローサイトメトリーにより、運動後の免疫細胞動態を正確に解析し、運動免疫学研究の新たな枠組みを提供する。

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この研究は、ケンタッキー州西部大学の学部奨学金委員会から新学部のグラントによってサポートされていました。

1。フィンガースティック採血<ol><li>全血のコレクションは、通常、ベースラインの測定（通常10〜15分座って休息の後）のため、運動では、次の中や直後、および運動後の期間を通じて安静時に取得されます（一般的には1-3時間からの停止後運動）。 </li><li>普遍的予防策を使用して、最初の70％イソプロピルアルコールで指先を消毒する。 </li><li>次に、穿刺自動化されたランセットまたは類似のデバイスを使用してサイト。我々は被験者の快適さを提供するために30ゲージのランセットを使用していますが、より大きなゲージの針を利用することができます。 </li><li>血液の最初のドロップを拭き取りますし、凝固を防ぐためにリチウムヘパリン処理毛細管またはmicrovettesに血液を集める。 </li></ol> 2。細胞の表現型およびアポトーシスの染色<ol><li> 250μL結合バッファーでtitred抗体のパネル（表1の回路図を参照）に10μLヘパリン加全血を追加。我々は成功で1:20の希釈率を使用しましたが、各研究室では、最高の実用的なソリューションを決定するために、その試薬を力価してください。 白血球サブセットにおける運動誘発性アポトーシスの決定のための表1。抗体パネル。後期のアポトーシスをアネキシンVと7 - AADとの二重陽性標識によって定義されている間早期のアポトーシスは、アネキシンVの式によって定義されました。壊死細胞は、唯一のアネキシンV -および7 - AAD +細胞であった。 <table border="1"><tbody><tr><td>チューブ1 </td><td>チューブ2 </td><td>チューブ3 </td><td>チューブ4 </td></tr><tr><td>細胞のみ管</td><td>アネキシンV - FITC </td><td>アネキシンV - FITC </td><td>アネキシンV - FITC </td></tr><tr><td></td><td>抗ヒトCD4 - PE </td><td>抗ヒトCD8 - PE </td><td>抗ヒトCD19 - PE </td></tr><tr><td></td><td> 7 - AAD </td><td> 7 - AAD </td><td> 7 - AAD </td></tr><tr><td></td><td>抗ヒトCD45RA - APC </td><td>抗ヒトCD45RA - APC </td><td></td></tr></tbody></table> 7 - AAD = 7 - アミノアクチノマイシンD、APC =アロフィコシアニン、CD4 =ヘルパーTリンパ球、CD8 =細胞傷害性/抑制性Tリンパ球、CD19 = Bリンパ球、CD45RA =ナイーブ細胞サブセット、FITC =フルオレセインイソチオシアネート、PE =フィコエリスリン。 </li><li> 30分間暗所で室温でインキュベートする。 </li><li> 5〜10分間1075 × gで遠心する。 </li><li>デカントは、300μL赤血球溶解バッファーを追加し、徹底的にボルテックス。 </li><li>室温で15分間インキュベートする。 </li><li>赤血球溶解反応を停止するには300μLのPBSを追加。 </li><li> 5〜10分間1075 × gで遠心する。 </li><li>デカント、ラック、および50μLの結合バッファーを加える。 </li><li>フローサイトメトリーにより分析する。 </li></ol>それは最低限、次のコントロールを利用することが推奨されます：バックグラウンドの自家蛍光を検出するのネガティブコントロールとして機能するだけチューブセル、および個々の入ったチューブは、フローサイトメーターのセットアップ、最初の時の補償を設定するには、蛍光色素。さらに、我々の実験を設定するには成功報酬の標準ビーズを使用している。

<ol><li>Simpson, R. J., Florida-James, G. D., Whyte, G. P., Black, J. R., Ross, J. A., Guy, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptosis+does+not+contribute+to+the+blood+lymphocytopenia+observed+after+intensive+and+downhill+treadmill+running+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Res.+Sports+Med%22%5BJournal%5D)">Apoptosis does not contribute to the blood lymphocytopenia observed after intensive and downhill treadmill running in humans.</a> Res. Sports Med. 15, 157-174 (2007).</li>
<li>Steensberg, A., Morrow, J., Toft, A. D., Bruunsgaard, H., Pedersen, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prolonged+exercise%2C+lymphocyte+apoptosis+and+F2-isoprostanes%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Appl.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Prolonged exercise, lymphocyte apoptosis and F2-isoprostanes.</a> Eur. J. Appl. Physiol. 87, 38-42 (2002).</li>
<li>Mooren, F. C., Bloming, D., Lechtermann, A., Lerch, M. M., Völker, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphocyte+apoptosis+after+exhaustive+and+moderate+exercise%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Appl.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Lymphocyte apoptosis after exhaustive and moderate exercise.</a> J. Appl. Physiol. 93, 147-153 (2002).</li>
<li>Peters, E. M., Eden, M. V. an, Tyler, N., Ramautar, A., Chutergoon, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prolonged+exercise+does+not+cause+lymphocyte+DNA+damage+or+increased+apoptosis+in+well-trained+endurance+athletes%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Appl.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Prolonged exercise does not cause lymphocyte DNA damage or increased apoptosis in well-trained endurance athletes.</a> Eur. J. Appl. Physiol. 98, 124-131 (2006).</li>
<li>Wang, J. -S., Huang, Y. -H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+exercise+intensity+on+lymphocyte+apoptosis+induced+by+oxidative+stress+in+men%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Appl.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Effects of exercise intensity on lymphocyte apoptosis induced by oxidative stress in men.</a> Eur. J. Appl. Physiol. 95, 290-291 (2005).</li>
<li>Mooren, F. C., Lechtermann, A., Völker, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exercise-induced+apoptosis+of+lymphocytes+depends+on+training+status%5BTitle%5D)+AND+%22Med.+Sci.+Sports+Exerc%22%5BJournal%5D)">Exercise-induced apoptosis of lymphocytes depends on training status.</a> Med. Sci. Sports Exerc. 36, 1476-1483 (2004).</li>
<li>Navalta, J. W., Sedlock, D. A., Park, K. -S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood+treatment+influences+the+yield+of+apoptotic+lymphocytes+after+maximal+exercise%5BTitle%5D)+AND+%22Med.+Sci.+Sports+Exerc%22%5BJournal%5D)">Blood treatment influences the yield of apoptotic lymphocytes after maximal exercise.</a> Med. Sci. Sports Exerc. 37, 369-373 (2005).</li>
</ol>

利害の衝突は宣言されません。

低侵襲サンプルの収集手順とその後の分析は、運動誘発性のリンパ球のアポトーシスの初期および後期段階の両方の分析のために示されている。それは明らかに壊死、およびアポトーシスとなっていない細胞を、除外することも可能です。この手順では、中、および直後に運動した後、前に、複数の時点での肘前部からの侵襲的な静脈穿刺に伴う欠点や不快感を克服し、または運動の期間中、カテーテルを確保する。調査官の面では、このような手順は、通常ではない、すべての個人が持っている瀉血療法の専門訓練を、必要とする。さらに、被験者募集および保存は、1つが存在する場合には有意な効果を見つけることの潜在的な統計的検出力を増加させるので、この手順を使用して拡張される予定です。 静脈穿刺採血を採用した従来の研究では、全体的なリンパ球のために安静時と運動後の値を報告している。アネキシンV、シンプソンらを。活用することで安静時の約1.2％アポトーシスリンパ球を報告し、そして〜1.3％以下のトレッドミルは、1を実行している。同様に、Steensberg らは 2を</s...

<table><tbody><tr><td>フローサイトメトリー結合バッファー</td><td></td><td>eBioscience</td><td>00-4222-26</td><td></td></tr><tr><td>赤血球溶血バッファー</td><td></td><td>eBioscience</td><td>00-4333-57</td><td></td></tr><tr><td>ランセットデバイス</td><td>Accu Check Soft Touch</td><td>Roche Group</td><td></td><td></td></tr><tr><td>キャピラリーチューブ</td><td>ヘパリン処理キャピラリーチューブ</td><td>Chase Scientific Glass, Inc.</td><td>501</td><td></td></tr><tr><td>遠心分離機</td><td>GmC Lab</td><td>Gilson, Inc.</td><td>PMS-880</td><td></td></tr><tr><td>Annexin V-FITC 結合体</td><td></td><td>Biovision Inc.</td><td>K201-400-1</td><td></td></tr><tr><td>CD4-PE 結合体</td><td>抗ヒト, clone RPA-T4</td><td>eBioscience</td><td>12-0049-42</td><td></td></tr><tr><td>CD8-PE 結合体</td><td>抗ヒト, clone OKT8</td><td>eBioscience</td><td>12-0086-73</td><td></td></tr><tr><td>CD19-PE 結合体</td><td>抗ヒト, clone HIB19</td><td>eBioscience</td><td>12-0199-42</td><td></td></tr><tr><td>7-AAD 生存細胞染色溶液</td><td></td><td>eBioscience</td><td>00-6993-50</td><td></td></tr><tr><td>CD45RA-APC 結合体</td><td>抗ヒト, clone HI100</td><td>eBioscience</td><td>17-0458-42</td><td></td></tr><tr><td>フローサイトメーター</td><td>C6</td><td>Accuri</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

運動誘発性リンパ球のアポトーシスの決定のための指先穿刺の採血方法

Finger-stick Blood Sampling Methodology for the Determination of Exercise-induced Lymphocyte Apoptosis

運動は免疫細胞にアポトーシスを誘導可能な生理的刺激です。これまでに、様々な制限は特に事前の細胞死の評価に血液サンプルを分離し、治療に必要な時間の量に関連する、この現象の計測と同定されている。このため、それは免疫細胞のアポトーシスに報告された増加は、システム上の運動の実際の効果に貢献し、または時間と最終的にこの測定を得るために必要な処理の反射であることができるかどうかを判断するのは困難である。この記事では、運動誘発性リンパ球のアポトーシスの解析のための迅速かつ低侵襲の手順を示しています。他の技術とは異なり、全血は検体を入手した時点で直ちに抗体のパネルに追加されます。潜伏期間の後、赤血球を溶解し、試料は、分析する準備が整いましたされています。指先穿刺のサンプリング手順の使用は、必要な血液量が減少し、被験者に不快感を最小限に抑えることができます。

運動は免疫細胞にアポトーシスを誘導することが可能です。様々な測定の制限は特に事前評価への血液サンプルを分離し、治療に必要な時間の量に関連する、があります。が示され、運動誘発性リンパ球アポトーシスの解析のための迅速かつ低侵襲です。

運動は、免疫細胞にアポトーシスを誘導させ得る生理学的刺激である。これまで、その測定にはさまざまな限界があることが指摘されてきた……

こんにちは。ウェスタンケンタッキー大学キネシオロジー・レクリエーション・スポーツ学科エクササイズサイエンスプログラムのジェームズ・ボルタです。今回は、運動誘発性のリンパ球アポトーシスを測定するために私たちが開発し、実際に使用している手順をご紹介します。それでは、詳しく見ていきましょう。ユニバーサル・プリコーションに従い、指先穿刺により血液サンプルを採取します。指先を滅菌した後、穿刺を行います。最初の一滴の血液は拭き取り、その後、血液をキャピラリーチューブまたはマイクロベッドに採取します。フローサイトメトリー用の抗体パネルを含むバッファーに、全血 10 µL をピペットで分注します。このパネルには、Annexin V、7-AAD、CD4、CD8、または CD19、および CD45RA などの適切な蛍光色素が含まれています。また、細胞のみのチューブに加え、実験のセットアップを補助するためのコントロールとしてコンペンセーションビーズを使用しました。サンプルをボルテックスで十分に混合した後、室温・暗所で 30 分間インキュベートします。インキュベーション後、サンプルを 10 分間遠心分離し、その後、一度のスムーズな動作で上清をデカンテーションします。300 µLの赤血球溶解バッファーを添加し、サンプルを十分にボルテックスします。サンプルと溶解バッファーを完全に混合させることが非常に重要です。赤血球を最大限に除去するため、サンプルが濁り始めることに留意してください。室温で少なくとも15分間インキュベートすると、赤血球が溶血するため溶液が透明になります。次に、溶血反応を停止させるためのストップソリューションとして、300 µLのリン酸緩衝生理食塩水を加えます。その後、サンプルを再び10分間遠心分離します。遠心分離の手順後、チューブの底に細胞のペレットが形成されることに注意してください。一連の滑らかな動作で上清をデカンテーションし、ボルテックスで十分に撹拌して細胞を溶液に再懸濁させます。これで、サンプルをフローサイトメトリーで分析する準備が整いました。ここでは、リンパ球サブフラクションへのゲーティングを示す代表的な前方散乱・側方散乱プロットと、そのサブセット内におけるAnnexin V陽性細胞の同定について示します。以上で、運動誘発性リンパ球アポトーシスを判定するために用いた手法について説明しました。この手法は、今後さらに多くのアプリケーションに応用できると考えています。この手法は、リンパ球およびそのサブフラクション以外であらゆる種類の白血球の観察に利用可能です。また、細胞表面に存在するあらゆるマーカーの測定にも使用できるため、より幅広い応用が期待できると考えています。

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