Name: ニューロモデュレーションとミトコンドリア輸送：長時間にわたって海馬ニューロンのライブイメージング (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-06-17T12:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 50 s
Description: 学ぶ 海馬ニューロンのミトコンドリア輸送を長時間ライブイメージングする方法。レンチウイルスによる蛍光タンパク質発現とステージトップインキュベーターを用いて、神経伝達物質がミトコンドリア動態に与える影響を可視化します。

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我々は、ステージ上インキュベーターの設計と製造の間に彼の技術的な専門知識と優れた技術を貢献するためにドナルドハットソンに感謝します。私たちは、彼女の優秀な技術支援のためにもAyda Dashtaeiに感謝しています。すべての作業は、神経科学研究財団によってサポートされていました。

<ol><li>Ligon, L. A., Steward, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Movement+of+mitochondria+in+the+axons+and+dendrites+of+cultured+hippocampal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Movement of mitochondria in the axons and dendrites of cultured hippocampal neurons.</a> J Comp Neurol. 427, 340-350 (2000).</li>
<li>Miller, K. E., Sheetz, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+evidence+for+coherent+low+velocity+axonal+transport+of+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Direct evidence for coherent low velocity axonal transport of mitochondria.</a> J Cell Biol. 173, 373-381 (2006).</li>
<li>Macaskill, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Miro1+is+a+calcium+sensor+for+glutamate+receptor-dependent+localization+of+mitochondria+at+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Miro1 is a calcium sensor for glutamate receptor-dependent localization of mitochondria at synapses.</a> Neuron. 61, 541-555 (2009).</li>
<li>Morris, R. L., Hollenbeck, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axonal+transport+of+mitochondria+along+microtubules+and+F-actin+in+living+vertebrate+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Axonal transport of mitochondria along microtubules and F-actin in living vertebrate neurons.</a> J Cell Biol. 131, 1315-1326 (1995).</li>
<li>Rintoul, G. L., Filiano, A. J., Brocard, J. B., Kress, G. J., Reynolds, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutamate+decreases+mitochondrial+size+and+movement+in+primary+forebrain+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Glutamate decreases mitochondrial size and movement in primary forebrain neurons.</a> J Neurosci. 23, 7881-7888 (2003).</li>
<li>Crawley, J. N. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCrawley%2C+JN+%22Current+protocols+in+neuroscience%22">Current protocols in neuroscience</a>. , J. Wiley. (1999).</li>
<li>Fedoroff, S., Richardson, A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFedoroff%2C+S+%22Protocols+for+neural+cell+culture%22">Protocols for neural cell culture</a>. , 3rd edn, Humana Press. (2001).</li>
<li>Chen, S., Owens, G. C., Crossin, K. L., Edelman, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serotonin+stimulates+mitochondrial+transport+in+hippocampal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Serotonin stimulates mitochondrial transport in hippocampal neurons.</a> Mol Cell Neurosci. 36, 472-483 (2007).</li>
<li>Chen, S., Owens, G. C., Edelman, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dopamine+inhibits+mitochondrial+motility+in+hippocampal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Dopamine inhibits mitochondrial motility in hippocampal neurons.</a> PLoS One. 3, e2804-e2804 (2008).</li>
<li>Chen, S., Owens, G. C., Makarenkova, H., Edelman, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HDAC6+regulates+mitochondrial+transport+in+hippocampal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">HDAC6 regulates mitochondrial transport in hippocampal neurons.</a> PLoS One. , e10848-e10848 (2010).</li>
<li>Curran, M. A., Kaiser, S. M., Achacoso, P. L., Nolan, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+transduction+of+nondividing+cells+by+optimized+feline+immunodeficiency+virus+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Efficient transduction of nondividing cells by optimized feline immunodeficiency virus vectors.</a> Mol Ther. 1, 31-38 (2000).</li>
</ol>

利害の衝突は宣言されません。

レンチウイルスを介した感染培養神経細胞のミトコンドリアをターゲットと蛍光タンパク質の発現と延長期間のための生細胞のイメージングを可能にする安価なラボ構築ステージトップインキュベーターを採用し、我々は、ミトコンドリアの動きと神経調節の信号間のリンクを調査することができた、セロトニン（5 - HT）、ドーパミン（DA）、及びアセチルコリン（ACH）など。神経機能の心臓部である - 私たちの研究は、その、初めて、リンクなどの5 - HTとDAのような神経伝達物質によって変調されたニューロンの活動の変化にミトコンドリアの人身売買シグナル伝達経路を解明するために役立っています。我々は、標的蛍光タンパク質の使用は、より多くの生理学的に関連する重要な染料を使用して可能なはるかに短い期間よりも可能性が長期間にわたって培養神経細胞を生体内でミトコンドリアというラベルの観察を可能にすることがわかります。さらに、蛍光タンパク質のシグナルの強度は、光退色や光毒性の可能性を最小限に抑え、私たちは画像取得時の露光時間を短くすることができます。最後に、シンプルで安価なステージトップインキュベーターメディアの蒸発を最小限に抑えながら、周囲温度、湿度、およびCO 2のレベルを維持し、私たちはさらに数時間または数日にわたってニューロンを生体内でミトコンドリアの動きをたどることができます。ライブニューロンのミトコンドリアの長期的な観測のためにステージトップインキュベーターを作製する研究者が使用する材料の特性（例えば、ガス透過性膜媒体の蒸発を避けるために提供されて、私たちのデザインの正確な詳細に従う必要はありません）と（例えば、温度、湿度コントロール、浸透圧のpHは、メンテナンスのバッファリング）適用される原則は、一般的にこのプロトコールに記載されているものと一致している。

<table border="1"><tbody><tr><th>数量</th><th>説明（と図1の位置） </th></tr><tr><td> 1 </td><td>組織培養インキュベーター（H） </td></tr><tr><td> 1 </td><td>耐熱性プラスチックの筐体（デルリンまたは同等の）（） </td></tr><tr><td> 1 </td><td> 35ミリメートルGBMのふた用プラスチックフレーム（ペトリ皿に膜を貼るための）（M） </td></tr><tr><td> 1月2日</td><td>リニアフィートクリアPFTE（テフロン）膜材料</td></tr><tr><td> 4 </td><td>真鍮のつまみねじ</td></tr><tr><td> 2 </td><td>小さな10kOhmヒートシンク抵抗（ステージトップインキュベーターのエンクロージャ内部に発熱体として使用される） </td></tr><tr><td> 1 </td><td>変圧器（抵抗に9Vの電流の供給） </td></tr><tr><td> 1 </td><td>テラリウムの温度調節器とプローブ（トランスを経由してヒートシンクの抵抗への電源の恒温調節） </td></tr><tr><td> 1 </td><td> 2000ミリリットルの三角フラスコ（ステージトップインキュベーターの前にホースの振動抑制用マフラー）（K） </td></tr><tr><td> 1 </td><td> 1 / 8&quot;sorbothaneシート（ステージトップインキュベーターのベース用ガスケットの材料） </td></tr><tr><td> 1 </td><td>気密ABS（または同等の）プラスチック製のボックス（水槽ポンプ用ハウジング）（J） </td></tr><tr><td> 1 </td><td>水槽のポンプ（I） </td></tr><tr><td> 1 </td><td>小さなコンピュータの冷却ファン</td></tr><tr><td> 1 </td><td>冷却ファン用のプラスチック製筐体（L） </td></tr><tr><td> 1 </td><td>コンピュータの冷却ファン用9Vトランス</td></tr><tr><td> 20〜30フィート</td><td> Nalgeneまたはシリコーンのホース（組織培養とステージトップインキュベーター間の接続は、水分のトラップ）（F、G、N） </td></tr><tr><td> 2 </td><td>プラスチック製のストップコック（ステージトップインキュベーターの前と後の空気の流れを開いたり閉じたりする）（O） </td></tr><tr><td> 4 </td><td>とげのある真鍮のホースコネクタ（ステージトップインキュベーターと水槽のポンプのエンクロージャへの/からのホース接続用） </td></tr><tr><td> 2 </td><td>真鍮クイックカプラー（ホース接続用まで/ステージトップインキュベーターから） </td></tr><tr><td> 2 </td><td>真鍮クイックカプラー（ホース接続用まで/ステージトップインキュベーターから） </td></tr></tbody></table> 表1。ステージトップインキュベーターの部品： <table border="1"><tbody><tr><th>試薬の名前</th><th>会社</th><th>カタログ番号</th></tr><tr><td>ポリ- D -リジン</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> P7280 - 5mgの</td></tr><tr><td>ラミニン</td><td>ロシュダイアグノスティックス</td><td> 11243217001 </td></tr><tr><td> 35ミリメートルのガラスボトムディッシュ</td><td>マテック</td><td> P35GC - 0 - 14 - C </td></tr><tr><td> DMEM </td><td>ライフテクノロジーズ</td><td> 10567 </td></tr><tr><td> B27 </td><td>ライフテクノロジーズ</td><td> 17504-044 </td></tr><tr><td>グルタミン</td><td>ライフテクノロジーズ</td><td> 35050 </td></tr><tr><td>脂質が豊富なBSA </td><td>ライフテクノロジーズ</td><td> 11020-021 </td></tr><tr><td> L -アスパラギン</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> P0380 - 100G </td></tr><tr><td> L -プロリン</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> A8381 - 100G </td></tr><tr><td>ビタミンB - 12 </td><td>シグマアルドリッチ</td><td> V2876 - 100mgの</td></tr><tr><td> 5 - HT </td><td>シグマアルドリッチ</td><td> H9523 - 25mgを</td></tr><tr><td> 8 - OH - DPAT </td><td>シグマアルドリッチ</td><td> H8520 - 25mgを</td></tr><tr><td>ドーパミン</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> H8502 - 5G </td></tr><tr><td>ブロモクリプチン</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> B2134 - 25mgを</td></tr><tr><td> SKF38393 </td><td>シグマアルドリッチ</td><td> D047 - 100mgの</td></tr></tbody></table>

ニューロモデュレーションとミトコンドリア輸送：長時間にわたって海馬ニューロンのライブイメージング

Neuromodulation and Mitochondrial Transport: Live Imaging in Hippocampal Neurons over Long Durations

ミトコンドリア輸送と神経機能の関係を理解するために、それは1-3拡張された期間のためのライブ培養神経細胞におけるミトコンドリアの挙動を観察することが重要です。これは生きている細胞の細胞骨格成分、細胞小器官、および他の構造を標識することができるとの重要な染料と蛍光タンパク質を使用することで可能になりましたし、動的な蛍光顕微鏡を介して可視化した。例えば、胚性ニワトリ交感神経ニューロンにおいて、ミトコンドリアの動きは生体染色色素のローダミン123 4を用いて特徴付けられた。別の研究で、ミトコンドリアはミトコンドリア標的EYFP 5のトランスフェクションにより、ラットの前脳の神経細胞で可視化した。しかし、一次分以上のニューロン、時間、または数日間の撮影は、多くの問題を提示。何よりもこれらの間にある：1）そのような温度、湿度、および長時間の撮像セッション中に、pHなどの培養条件の維持、画像解析時に信号強度の取得画像の品質と正確な測定の両方を確保するため2）強い、安定した蛍光シグナル;および3）退色最小限に抑え、光毒性を避けるために、画像取得時の露光時間を制限する。 ここでは、観察、可視化、および高時間分解能で、最適な生命維持の条件下で培養海馬神経細胞におけるミトコンドリアの動きの分析を可能にするプロトコルを記述する。我々は、良好な温度調節と雰囲気ガスの流れを提供する手頃なステージトップインキュベーターを建設し、また安定したpHと浸透圧を確保し、メディアの蒸発の程度を制限している。このインキュベータは、一定の湿度レベルを提供する標準組織培養インキュベーター、5〜10％のCO 2 /空気の雰囲気に、入口、出口ホースを経由して、接続されている。この設計は、必ずしも多くの時間あるいは数日にわたって細胞の生存を保証していないはるかに高価な顕微鏡のインキュベーターに代わるコスト効率を提供しています。ミトコンドリア可視化するために、我々は、ミトコンドリアを対象としている赤色蛍光蛋白質をコードするレンチウイルスで細胞を感染させる。これは安定キセノン光源の使用と併せて、私たちは画像取得時の露光時間を制限することを可能にし、すべてが光退色と光毒性排除する、強力かつ持続的な信号を、保証します。ステージトップインキュベーターの上部にある2つの注入ポートは、意図した神経伝達物質や他の試薬の急性投与は、ミトコンドリアの動きを調節することができます。オルガネラを標的と赤色蛍光タンパク質と私たちのステージトップインキュベーター、従来の倒立蛍光顕微鏡、CCDカメラ、およびキセノン光源の組み合わせの和、レンチウイルスを介した表現で私たちがでミトコンドリア輸送のタイムラプス画像を取得することができます従来の重要な染料と既製の生命維持システムを導入する研究の可能性よりも長い期間にわたって生きているニューロン。

我々は、長時間にわたって蛍光顕微鏡を介して神経細胞を生体内でミトコンドリアのイメージングを可能にするプロトコルを記述する。長期間にわたるイメージングは​​、我々の研究室で設計し、構築されたミトコンドリア標的蛍光蛋白質と安価なステージトップインキュベーターの使用のレンチウイルスを介した発現を介して実行されます。

ミトコンドリア輸送とニューロン機能の関係を理解するためには、生きた培養...におけるミトコンドリアの挙動を観察することが極めて重要である。

この手順の全体的な目的は、ライブセル蛍光顕微鏡を用いて、培養ニューロンにおけるミトコンドリア輸送を長期間にわたり可視化することです。まず、培養ニューロン内のミトコンドリアをオルガネラ標的型蛍光タンパク質で標識します。次に、コントロール条件下でのミトコンドリア輸送の画像を撮影します。手順の第3ステップは、セロトニンなどの神経調節物質を急性投与した後のミトコンドリア輸送のタイムラプス画像シリーズを取得することです。手順の最終ステップは、取得したタイムラプス画像シリーズの解析を行うことです。最終的に、神経伝達物質がミトコンドリア輸送を調節することを示す結果を得ることができます。このような結果は、ニューロン内の蛍光標識されたミトコンドリアを長時間イメージングすることによってのみ得られます。生存染色やGFPの一過性導入などの既存の手法に対する本手法の主な利点は、健康な培養ニューロンにおけるミトコンドリア輸送の長期観察が可能になることです。安定した温度と湿度環境を提供するため、本手順のデモンストレーションは、私の研究室のアソシエートフェローであるChenが行います。ステージトップインキュベーターは、標準的な組織培養インキュベーターに密閉回路で接続されています。35 mmガラスボトム培養皿用のA-P-F-T-Eメンブレン蓋により、神経細胞培養物とインキュベーター内の環境との間でガス交換が行われます。これらおよびその他の機能により、さまざまな実験条件下で培養神経細胞の長期観察が可能になります。mito turbo redタンパク質を発現している培養海馬神経細胞を含む培養皿を、組織培養フードに移します。プラスチック製の蓋をPTFEメンブレン蓋に交換し、培養皿を顕微鏡へと移動させます。インキュベーターのベースを顕微鏡ステージにクリップで固定し、メンブレンで覆われた培養皿を慎重に設置してください。凹みのある開口部で、インキュベーターエンクロージャをインキュベーターベースのスチールポストに合わせ、エンクロージャをベースの上に下ろします。エンクロージャーとベースの間で十分なシールが確保されるまで、サムスクリューを締めます。イメージングソフトウェアを開く前に、顕微鏡フィルターホイールコントローラー、光源、およびCCDカメラの電源を入れます。本プロトコルでは、画像取得にスライドブック5を使用します。63倍の油浸対物レンズに切り替え、対物レンズ回転盤を下げます。対物レンズの表面に浸油を慎重に塗布してください。ツールバーのフォーカスウィンドウアイコンをクリックし、ランプスライダーを動かして明視野ランプを点灯させます。光強度を調整するために、接眼レンズを用いて細胞の視野に焦点を合わせ、目的の細胞を探します。スコープタブからXI 3フィルターを選択し、接眼レンズを使用して、mito turbo redタンパク質で標識された細胞内のミトコンドリアの焦点面を確認した後、CCDカメラに切り替えます。ツールバーの画像キャプチャアイコンをクリックし、初期露光時間を100 millisecondsに設定して開始します。キャプチャウィンドウの「test」および「find best」ボタンを使用して、最適な露光量を決定します。「capture type」ボックスの下にある「time-lapse」オプションにチェックを入れ、「time-lapse capture options」で希望のイメージング間隔とイメージングセッションの時間を設定します。キャプチャウィンドウの右下にあるスタートボタンをクリックし、タイムラプス画像の取得を開始します。コントロールのイメージングセッションを撮影した後、ステージトップインキュベーター上部の注入ポートから神経伝達物質またはその他の試薬を投与します。セロトニン受容体作動薬 8-OH-DPAT を添加すると、矢印で示されたそれまで静止していたミトコンドリアが、海馬ニューロンの軸索に沿って移動します。セロトニン添加前の個々のミトコンドリアの平均速度と方向性がまとめられています。ミトコンドリアの大部分は静止していますが、セロトニン添加後は、ミトコンドリアの42%が方向性を持った運動を示し、セロトニン不在下で方向性を持った運動を示した個体よりも長い距離を移動します。対照的に、本手順に従いドーパミンを添加すると、イメージングセッションの最後の15分間でミトコンドリアの92%が静止状態となります。さらなる疑問を解消するために、複数のシグナルをモニタリングする他の手法を実施することが可能です。例えば、ニューロンにおけるカルシウム活性とミトコンドリア輸送がどのように関連しているかといった点です。

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