ニューロモデュレーションとミトコンドリア輸送：長時間にわたって海馬ニューロンのライブイメージング

この手順の全体的な目的は、ライブセル蛍光顕微鏡を用いて、培養ニューロンにおけるミトコンドリア輸送を長期間にわたり可視化することです。まず、培養ニューロン内のミトコンドリアをオルガネラ標的型蛍光タンパク質で標識します。次に、コントロール条件下でのミトコンドリア輸送の画像を撮影します。

手順の第3ステップは、セロトニンなどの神経調節物質を急性投与した後のミトコンドリア輸送のタイムラプス画像シリーズを取得することです。手順の最終ステップは、取得したタイムラプス画像シリーズの解析を行うことです。最終的に、神経伝達物質がミトコンドリア輸送を調節することを示す結果を得ることができます。

このような結果は、ニューロン内の蛍光標識されたミトコンドリアを長時間イメージングすることによってのみ得られます。生存染色やGFPの一過性導入などの既存の手法に対する本手法の主な利点は、健康な培養ニューロンにおけるミトコンドリア輸送の長期観察が可能になることです。安定した温度と湿度環境を提供するため、本手順のデモンストレーションは、私の研究室のアソシエートフェローであるChenが行います。

ステージトップインキュベーターは、標準的な組織培養インキュベーターに密閉回路で接続されています。35 mmガラスボトム培養皿用のA-P-F-T-Eメンブレン蓋により、神経細胞培養物とインキュベーター内の環境との間でガス交換が行われます。これらおよびその他の機能により、さまざまな実験条件下で培養神経細胞の長期観察が可能になります。mito turbo redタンパク質を発現している培養海馬神経細胞を含む培養皿を、組織培養フードに移します。

プラスチック製の蓋をPTFEメンブレン蓋に交換し、培養皿を顕微鏡へと移動させます。インキュベーターのベースを顕微鏡ステージにクリップで固定し、メンブレンで覆われた培養皿を慎重に設置してください。凹みのある開口部で、インキュベーターエンクロージャをインキュベーターベースのスチールポストに合わせ、エンクロージャをベースの上に下ろします。

エンクロージャーとベースの間で十分なシールが確保されるまで、サムスクリューを締めます。イメージングソフトウェアを開く前に、顕微鏡フィルターホイールコントローラー、光源、およびCCDカメラの電源を入れます。本プロトコルでは、画像取得にスライドブック5を使用します。

63倍の油浸対物レンズに切り替え、対物レンズ回転盤を下げます。対物レンズの表面に浸油を慎重に塗布してください。ツールバーのフォーカスウィンドウアイコンをクリックし、ランプスライダーを動かして明視野ランプを点灯させます。

光強度を調整するために、接眼レンズを用いて細胞の視野に焦点を合わせ、目的の細胞を探します。スコープタブからXI 3フィルターを選択し、接眼レンズを使用して、mito turbo redタンパク質で標識された細胞内のミトコンドリアの焦点面を確認した後、CCDカメラに切り替えます。ツールバーの画像キャプチャアイコンをクリックし、初期露光時間を100 millisecondsに設定して開始します。

キャプチャウィンドウの「test」および「find best」ボタンを使用して、最適な露光量を決定します。「capture type」ボックスの下にある「time-lapse」オプションにチェックを入れ、「time-lapse capture options」で希望のイメージング間隔とイメージングセッションの時間を設定します。

キャプチャウィンドウの右下にあるスタートボタンをクリックし、タイムラプス画像の取得を開始します。コントロールのイメージングセッションを撮影した後、ステージトップインキュベーター上部の注入ポートから神経伝達物質またはその他の試薬を投与します。セロトニン受容体作動薬 8-OH-DPAT を添加すると、矢印で示されたそれまで静止していたミトコンドリアが、海馬ニューロンの軸索に沿って移動します。

セロトニン添加前の個々のミトコンドリアの平均速度と方向性がまとめられています。ミトコンドリアの大部分は静止していますが、セロトニン添加後は、ミトコンドリアの42%が方向性を持った運動を示し、セロトニン不在下で方向性を持った運動を示した個体よりも長い距離を移動します。対照的に、本手順に従いドーパミンを添加すると、イメージングセッションの最後の15分間でミトコンドリアの92%が静止状態となります。

さらなる疑問を解消するために、複数のシグナルをモニタリングする他の手法を実施することが可能です。例えば、ニューロンにおけるカルシウム活性とミトコンドリア輸送がどのように関連しているかといった点です。