ニューロモデュレーションとミトコンドリア輸送：長時間にわたって海馬ニューロンのライブイメージング
June 17th, 2011
我々は、長時間にわたって蛍光顕微鏡を介して神経細胞を生体内でミトコンドリアのイメージングを可能にするプロトコルを記述する。長期間にわたるイメージングは、我々の研究室で設計し、構築されたミトコンドリア標的蛍光蛋白質と安価なステージトップインキュベーターの使用のレンチウイルスを介した発現を介して実行されます。
この手順の全体的な目標は、生細胞蛍光顕微鏡を使用して、ミトコンドリアの輸送と培養されたニューロンを長期間にわたって視覚化することです。これは、最初に培養ニューロンのミトコンドリアを臓器Lを標的とした蛍光タンパク質で標識することによって達成されます。手順の2番目のステップは、制御条件下でのミトコンドリア輸送の画像を取得することです。
手順の3番目のステップは、セロトニンなどの神経調節物質の急性投与後のミトコンドリア輸送のタイムラプス画像シリーズを取得することです。手順の最後のステップは、取得したタイムラプス画像シリーズの分析を実行することです。最終的には、神経伝達物質がミトコンドリア輸送を調節することを示す結果を得ることができます。
このような結果は、ニューロン内の蛍光標識ミトコンドリアを長期間にわたってイメージングすることによってのみ達成されます。この方法が、バイタル色素の標識やGFPの一過性トランスフェクションなどの既存の技術よりも優れている点は、この方法により、健康な培養ニューロンにおけるミトコンドリア輸送の長期観察が可能になることです。この手順を実演するのは、私の研究室のアソシエイトフェローであるチェンで、安定した加熱と加湿の環境を提供するために。
ステージトップインキュベーターは、閉回路を介して標準的な組織培養インキュベーターに接続されており、35ミリメートルガラス用のA-P-F-T-Eメンブレン蓋ボトム培養皿は、ニューロン培養とインキュベーター内の環境との間のガス交換を可能にします。これらの特徴と他の特徴を組み合わせることで、さまざまな実験条件下での培養ニューロンの長期観察が可能になります。培養した海馬ニューロンを含む培養皿を移し、mito turbo redタンパク質を発現させます。
プラスチック製の蓋をPFTEメンブレンの蓋に交換し、培養皿を顕微鏡に移します。インキュベーターの基部を顕微鏡ステージにクリップで留めてから、メンブレンで覆われた培養皿に慎重に座ります。凹んだ開口部で、インキュベーターエンクロージャーをインキュベーターベースのスチールポストに合わせ、エンクロージャーをベースに下げます。
エンクロージャーとベースの間に良好なシールが得られるまで、つまみネジを締めます。イメージングソフトウェアを開く前に、顕微鏡フィルターホイールコントローラー、光源、およびCCDカメラの電源を入れてください。このプロトコルでは、スライドブック5が画像取得に使用されます。
63 x 油浸対物レンズに切り替えて、対物レンズ砲塔を下げます。対物レンズの表面にイマージョンオイルを慎重に塗布します。ツールバーのフォーカスウィンドウアイコンをクリックし、ランプスライダーを動かして明視野ランプをオンにします。
光の強度を調整するには、接眼レンズを使用して細胞のフィールドに焦点を合わせ、目的の細胞を見つけます。スコープタブでXI threeフィルターを接眼レンズで選択し、mito turbo redタンパク質で標識した細胞内のミトコンドリアの焦点面を見つけ、CCDカメラに切り替えます。ツールバーの画像キャプチャアイコンをクリックします。初期露光時間を 100 ミリ秒から開始します。
テストを使用して最適な露出を見つけ、キャプチャウィンドウで最適なボタンを見つけます。キャプチャタイプボックスの下。タイムラプスオプションを確認し、タイムラプスキャプチャオプションで目的のイメージング間隔とイメージングセッションの期間を選択します。
タイムラプス画像の取得を開始するには、キャプチャウィンドウの右下にある開始ボタンをクリックします。コントロールイメージングセッションを撮影した後、ステージトップインキュベーター上部の注入ポートから神経伝達物質またはその他の試薬を投与します。セロトニン受容体アゴニストを添加すると、矢印で示された8つのO-H-D-P-A-T-A以前は静止していたミトコンドリアが海馬ニューロンの軸索に沿って移動します。
個々のミトコンドリアの平均速度と方向性は、セロトニンを添加する前に要約されています。ミトコンドリアの大部分は静止していますが、セロトニンの添加後、ミトコンドリアの42%が指向性運動を示し、セロトニンがない状態で指向性運動を示すミトコンドリアよりも長い距離を移動するようになりました。逆に、ドーパミンを追加すると、この手順に続くイメージングセッションの最後の15分までにミトコンドリアの92%が静止しています。
追加の質問に答えるために、複数の信号を監視する他の方法を実行することができます。例えば、ニューロンにおけるカルシウム活性とミトコンドリア輸送がどのように関連しているかなどです。
概要
この記事では、延長期間にわたる蛍光顕微鏡を用いて生体ニューロン内のミトコンドリアをイメージングするためのプロトコルを提示します。この方法は、ミトコンドリア標的型蛍光タンパク質のレンチウイルス介在発現と、長期観察用に設計された安価なステージトップインキュベーターを使用します。
主要な研究構成要素
科学分野
- 神経科学
- 細胞生物学
- 蛍光顕微鏡
背景
- ミトコンドリア輸送の可視化は、神経機能の理解に不可欠です。
- 既存の技術では、長期観察に限界があります。
- この方法は、培養ニューロンの安定なイメージングを可能にします。
- 神経調節剤の使用により、ミトコンドリアダイナミクスへの影響を明らかにできます。
研究目的
- 長期間にわたる培養ニューロン内のミトコンドリア輸送を可視化する。
- 神経調節剤がミトコンドリアの動きに与える影響を評価する。
- 長期の生細胞イメージングのための信頼性の高い方法を提供する。
使用された方法
- ミトコンドリア標的型蛍光タンパク質の発現のためのレンチウイルス介在発現。
- 環境条件を維持するためのステージトップインキュベーターの使用。
- ミトコンドリア輸送を捉えるためのタイムラプス蛍光顕微鏡。
- 神経伝達物質の効果を評価するための画像系列の分析。
主要な結果
- コントロールイメージングでは、ニューロン内のミトコンドリアは静止していました。
- セロトニン投与後、ミトコンドリアの相当数が方向性のある動きを示しました。
- ドーパミン処理では、ミトコンドリアの大部分が静止したままでした。
- 結果は、神経伝達物質がミトコンドリア輸送ダイナミクスを調節することを示しています。
結論
- このプロトコルにより、ニューロン内のミトコンドリアの長期観察が可能になります。
- これは、ミトコンドリア輸送における神経伝達物質の役割に関する洞察を提供します。
- この方法は、従来のイメージング技術に比べて有利です。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Long-term imaging of mitochondrial transport in neurons enables mechanistic de-risking of neuromodulator targets by linking compound exposure to organelle dynamics. This approach supports target validation in neurodegenerative disease models by providing quantitative, time-resolved readouts of functional mitochondrial responses. The method enhances predictive confidence in early discovery by revealing how neurotransmitters modulate subcellular trafficking in disease-relevant neuronal systems.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by visualizing mitochondrial transport changes upon neuromodulator exposure.
- Operational Value: Enables functional target validation through direct observation of organelle dynamics in live neurons.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by identifying compounds that alter mitochondrial motility as a proxy for neuronal health.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Prepares validated neuronal systems for compound screening via stable mitochondrial labeling and environmental control.
- Quantitative Output: Generates measurable parameters such as mitochondrial speed, directionality, and run length for hit assessment.
- Reproducibility: Ensures consistent imaging conditions over extended durations, reducing variability in screening campaigns.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Models mitochondrial dysfunction observed in neurodegenerative disorders using primary hippocampal neurons.
- Translational Continuity: Bridges discovery and preclinical stages by assessing neuromodulator effects on a conserved cellular process.
- Risk-Adjusted Decisions: Informs advancement criteria by correlating mitochondrial transport changes with functional outcomes.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from target validation through lead identification by providing live-cell readouts of mitochondrial dynamics in response to pharmacological perturbation.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by linking neuromodulator mechanisms to mitochondrial transport phenotypes.
- Screening: Enables assay standardization through lentiviral labeling and stage-top incubator maintenance of neuronal health.
- Analytics: Delivers quantitative image-based readouts (velocity, directionality, pausing) that facilitate condition comparisons.
- Translational Research: Connects to preclinical work by modeling mitochondrial responses relevant to neuropsychiatric and neurodegenerative indications.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable imaging platform for chronic compound exposure studies in neuronal cultures.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by directly visualizing organelle responses to neuromodulators.
- Operational Value: Ensures reproducibility via stable environmental control and persistent fluorescent labeling.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by identifying early biomarkers of neuronal dysfunction.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization based on mitochondrial transport modulation profiles.
Implementation Considerations
- Requires expertise in neuronal culture, lentiviral transduction, and fluorescence microscopy.
- Depends on stage-top incubator, xenon light source, CCD camera, and environmental control systems.
- Necessitates standardization across teams for consistent imaging parameters and analysis pipelines.
- Involves adaptation considerations when applying to different neuronal subtypes or disease models.
- Limited by phototoxicity risks despite mitigation strategies, requiring optimization of exposure times and light intensity.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:17
Overview of Stage-top Incubator for Long-term Neuronal Imaging
1:46
Application of the Membrane Lid to the Culture Dish and Placement in the Incubator
2:19
Live Imaging of Mitochondria in Hippocampal Neurons
3:44
The Effects of Neuromodulation on Mitochondrial Movement in Cultured Hippocampal Neurons
4:27
Conclusion
