Name: 新皮質の器官型スライス標本からの全細胞記録 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-06-03T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 29 s
Description: 学ぶ新皮質の器官型スライス標本からの全細胞記録法。幼齢ラットの脳切片を用いてピラミッドニューロンの電気生理学的特性を解析し、遺伝子導入後のイオンチャネル機能を詳細に調べることができます。

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著者らは、卓越した技術支援のために真弓桜庭とレベッカFoehringに感謝します。さらに、我々は博士に感謝します。トランスフェクションのためのcDNA構築物を弊社に提供するための器官スライス培養と遺伝子銃トランスフェクションプロトコールと博士ジャンヌNerbonneの実装の支援のためのロドリゴAndradeさん。 NINDS（RCFまで）からNS044163：この作品は、NIHの助成金によってサポートされていました。

<ol><li>Beique, J. C., Imad, M., Mladenovic, L., Gingrich, J. A., Andrade, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+the+5-hydroxytryptamine+2A+receptor-mediated+facilitation+of+synaptic+activity+in+prefrontal+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Mechanism of the 5-hydroxytryptamine 2A receptor-mediated facilitation of synaptic activity in prefrontal cortex.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 9870-9875 (2007).</li>
<li>Buonomano, D. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Timing+of+neural+responses+in+cortical+organotypic+slices%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Timing of neural responses in cortical organotypic slices.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 4897-4902 (2003).</li>
<li>Caeser, M., Bonhoeffer, T., Bolz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+organization+and+development+of+slice+cultures+from+rat+visual+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Cellular organization and development of slice cultures from rat visual cortex.</a> Exp Brain Res. 77, 234-244 (1989).</li>
<li>Foehring, R. C., Toleman, T., Higgs, M., Guan, D., Spain, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actions+of+Kv2.1+channels+in+rat+neocortical+pyramidal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Soc+Neurosci+Abstr%22%5BJournal%5D)">Actions of Kv2.1 channels in rat neocortical pyramidal neurons.</a> Soc Neurosci Abstr. 34, (2009).</li>
<li>Gähwiler, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organotypic+monolayer+cultures+of+nervous+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Organotypic monolayer cultures of nervous tissue.</a> J Neurosci Methods. 4, 329-342 (1981).</li>
<li>Gähwiler, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organotypic+cultures+of+neural+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Organotypic cultures of neural tissue.</a> Trends Neurosci. 11, 484-489 (1988).</li>
<li>Gähwiler, B. H., Capogna, M., Debanne, D., McKinney, R. A., Thompson, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organotypic+slice+cultures%3A+a+technique+has+come+of+age%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Organotypic slice cultures: a technique has come of age.</a> Trends Neurosci. 20, 471-477 (1997).</li>
<li>Gähwiler, B. H., Thompson, S. M., Muller, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+and+Maintenance+of+Organotypic+Slice+Cultures+of+CNS+Tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Preparation and Maintenance of Organotypic Slice Cultures of CNS Tissue.</a> Current Protocols in Neuroscience. , 6.11.1-6.11.11 (2001).</li>
<li>Guan, D., Lee, J. C., Tkatch, T., Surmeier, D. J., Armstrong, W. E., Foehring, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+and+biophysical+properties+of+Kv1+channels+in+supragranular+neocortical+pyramidal+neurones%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Expression and biophysical properties of Kv1 channels in supragranular neocortical pyramidal neurones.</a> J Physiol. 571, 371-389 (2006).</li>
<li>Guan, D., Lee, J. C. F., Higgs, M., Spain, W. J., Armstrong, W. E., Foehring, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+roles+of+Kv1+containing+channels+in+neocortical+pyramidal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Functional roles of Kv1 containing channels in neocortical pyramidal neurons.</a> J. Neurophysiol. 97, 1931-1940 (2007).</li>
<li>Guan, D., Tkatch, T., Surmeier, D. J., Armstrong, W. E., Foehring, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kv2+subunits+underlie+slowly+inactivating+potassium+current+in+rat+neocortical+pyramidal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Kv2 subunits underlie slowly inactivating potassium current in rat neocortical pyramidal neurons.</a> J Physiol. 581, 941-960 (2007).</li>
<li>Johnson, H. A., Buonomano, D. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+chronic+stimulation+of+cortical+organotypic+cultures+using+implanted+electrodes%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">A method for chronic stimulation of cortical organotypic cultures using implanted electrodes.</a> Neurosci Methods. 176, 136-143 (2009).</li>
<li>Johnson, H. A., Buonomano, D. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+plasticity+of+spontaneous+activity+and+Up+states+in+cortical+organotypic+slices%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Development and plasticity of spontaneous activity and Up states in cortical organotypic slices.</a> J Neurosci. 27, 5915-5925 (2007).</li>
<li>Malin, S. A., Nerbonne, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delayed+rectifier+K%2B+currents%2C+IK%2C+are+encoded+by+Kv2+alpha-subunits+and+regulate+tonic+firing+in+mammalian+sympathetic+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Delayed rectifier K+ currents, IK, are encoded by Kv2 alpha-subunits and regulate tonic firing in mammalian sympathetic neurons.</a> J Neurosci. 22, 10094-10105 (2002).</li>
<li>O'Brien, J. A., Holt, M., Whiteside, G., Lummis, S. C., Hastings, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modifications+to+the+hand-held+Gene+Gun%3A+improvements+for+in+vitro+biolistic+transfection+of+organotypic+neuronal+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Modifications to the hand-held Gene Gun: improvements for in vitro biolistic transfection of organotypic neuronal tissue.</a> J Neurosci Methods. 112, 57-64 (2001).</li>
<li>Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+for+organotypic+cultures+of+nervous+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">A simple method for organotypic cultures of nervous tissue.</a> J Neurosci Methods. 37, 173-182 (1991).</li>
<li>Villalobos, C., Shakkottai, V. G., Chandy, K. G., Michelhaugh, S. K., Andrade, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SKCa+channels+mediate+the+medium+but+not+the+slow+calcium-activated+afterhyperpolarization+in+cortical+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">SKCa channels mediate the medium but not the slow calcium-activated afterhyperpolarization in cortical neurons.</a> J Neurosci. 24, 3537-3542 (2004).</li>
<li>Walker, P. D., Andrade, R., Quinn, J. P., Bannon, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+analysis+of+preprotachykinin+promoter+activity+in+single+cortical+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Real-time analysis of preprotachykinin promoter activity in single cortical neurons.</a> J Neurochem. 75, 882-885 (2000).</li>
<li>Woods, G., Zito, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+gene+gun+bullets+and+biolistic+transfection+of+neurons+in+slice+culture%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Preparation of gene gun bullets and biolistic transfection of neurons in slice culture.</a> J Vis Exp. , (2008).</li>
<li>O'Brien, J. A., Lummis, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biolistic+transfection+of+neuronal+cultures+using+a+hand-held+gene+gun%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Proc%22%5BJournal%5D)">Biolistic transfection of neuronal cultures using a hand-held gene gun.</a> Nat Proc. 1, 977-981 (2006).</li>
<li>Joshi, P., Dunaevsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+gun+transfection+of+hippocampal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Gene gun transfection of hippocampal neurons.</a> J Vis Exp. , (2006).</li>
<li>Biewanga, J. E., Destree, O. H., Scharma, L. H. J Neurosci Met. 71, 67-75 (1997).</li>
</ol>

利害の衝突は宣言されません。

我々は、ラットの大脳新皮質（4、9-11）から錐体ニューロンにおける電位依存性カリウムチャネルの発現と機能的役割を研究している。なぜなら、これらのチャネルの特定の薬理学的作用物質の不足のため、我々はチャンネル式（1,14,15,17-19）を操作するための遺伝学的アプローチを使用してください。我々は、器官培養の準備（; 5月8日、2,3 12,13,15-22）利用する。Stoppiniらのアプローチから変更を（16）、細胞の形態と皮質の層のパターンを維持するために。我々は、6月17日出生日で急性最近、大脳皮質を分離して2-7日培養でスライスを維持する。これは、私たちは、急性スライスを使用して我々の仕事と同様な高齢者の神経細胞を研究することができますし、スライスにあふれんばかりの興奮性の接続の開発を最小限に抑えます。我々は赤外線照明（IR -）と電流または電圧クランプの全細胞パッチクランプと微分干渉顕微鏡（DIC）を使用して、レイヤーII / IIIまたはVで視覚的に識別された錐体ニューロンから記録。野生型または変異カリウムチャネルのDNAの遺伝子銃（遺伝子銃）トランスフェクションは、その機能（1,14,15,17）を...

手術/トランスフェクション/文化： <ol><li>脳スライサー：カムデンVibroslice＃MA572世界の精密機器、サラソタ、フロリダ州、米国</li><li>遺伝子銃システム：バイオラッドは、＃165から2431を（バイオラッドラボラトリーズ、1000アルフレッドノーベルドライブ、ヘラクレス、CA 94547）ヘリオス<ul><li>が含まれています：遺伝子銃、レギュレータ、チューブ準備ステーション（＃165〜2418）とヘリウムホースアセンブリ、シリンジキット、テフゼルチューブ、チューブカッター、最適化キット（＃165〜2424）、チューブカッターを</li><li> Bio - Rad社製ヘリウムレギュレータ（＃165〜2413） </li><li>のための使い捨ての消耗品は、Bio - Rad社からヘリオス： <ul><li> 1.6μmのゴールドのマイクロキャリア：＃165から2264 </li><li>テフゼルチューブ：＃165-2441 </li></ul></li></ul></li><li>インキュベーター：フォーマ科学的モデル＃3110（サーモサイエンティフィック：（866）984〜3766）。 </li></ol>メディア： <ol><li>馬血清：Hycloneドナーウマ＃SH 30074。 （HyClone、925ウェスト1800サウス、ローガン、ユタ州84321） </li><li> HMemの（最小必須培地を加えたHBSSとHEPES、無グルタミン：ロンザBioWhittakerカタログ番号12 - 137F）：GIBCO / Invitrogen社、（800）955から6288まで、オプション1。 </li><li> HBSS（GIBCOハンクスは、＃24020から117を緩衝生理食塩水）：GIBCO / Invitrogen社、（800）955から6288まで、オプション1。 </li><li> MEM（GIBCO最小必須培地、＃12360〜038）、GIBCO / Invitrogen社、（800）955から6288まで、オプション1。 </li><li> 250mLのミリポア0.2μmのフィルター：＃SC6PU02RE </li><li>プラスチック製のトランスファーピペット：フィッシャー＃13-711-20。 </li><li> 50 mLのミリポアsteriflip0.22μmのフィルター（＃SCGP00525） </li></ol>から得られた項目6-8：フィッシャーサイエンティフィック、1241大使ブールバード、私書箱14989、セントルイス、MO 63132。 録音： <ol><li>ピペットガラス：ハーバードGC150TF - 10：ハーバード装置、84オクトーバーヒルロード、ホリストン、マサチューセッツ州01746 </li><li>サターP - 87水平方向の電極の引き手：サター器械公司、Oneデジタルドライブ、ノヴァト、CA 94949 </li><li>アクソンインスツルメンツMulticlamp 700Bアンプ：Molecular Devices社、（株）1311オーリンズドライブ、サニーベール、カリフォルニア州94089から1136 </li><li> Molecular Devices社、社、1311オーリンズドライブ、サニーベール、カリフォルニア州94089から1136まで：10データ集録ソフトウェアをPClamp </li><li> サター器械公司 、Oneデジタルドライブ、ノヴァ、CA 94949：lectrodeの位置は、サッタROE - 200マニピュレータとPC - 200コントローラで制御されます。 </li><li>顕微鏡：IR - DIC光学系を持つオリンパスBX - 50WI正立顕微鏡</li><li>赤外線感度カメラOLY - 150（オリンパス）またはDAGE - MTI（DAGE - MTI、46360に01北Roeskeアベニュー、ミシガンシティ、）。 </li></ol>

新皮質の器官型スライス標本からの全細胞記録

Whole Cell Recording from an Organotypic Slice Preparation of Neocortex

我々は、ラットの大脳新皮質から錐体ニューロンにおける電位依存性カリウムチャネルの発現と機能的役割を研究している。なぜなら、これらのチャネルの特定の薬理学的作用物質の不足のため、我々は、チャネルの発現を操作するために遺伝学的アプローチを採用している。我々は、細胞の形態と皮質の層のパターンを維持するために器官培養の準備（16）を使用してください。我々は通常、生後日数8-10で急性最近、大脳皮質を分離して3-7日培養でスライスを維持する。これは、私たちは、急性スライスを使用して我々の仕事と同じような年齢で神経細胞を研究することができますし、スライスにあふれんばかりの興奮性の接続の開発を最小限に抑えます。我々は電流または電圧クランプの全細胞パッチクランプと赤外線照明（IR -）と微分干渉顕微鏡（DIC）を使用して、レイヤーII / IIIまたはVで視覚的に特定された錐体ニューロンから記録。我々は、その機能を研究するためにチャネルの発現を操作するために、野生型または変異カリウムチャネルのDNAの遺伝子銃（遺伝子銃）トランスフェクションを使用してください。トランスフェクションされた細胞は容易に緑色蛍光タンパク質（GFP）のcDNAとのコトランスフェクション後の落射蛍光顕微鏡で識別されます。私たちは、同じスライスから同じ層に隣接した、トランスフェクトされていないニューロンにトランスフェクトされた細胞の記録を比較する。

これは、錐体ニューロンから電気記録を作成する目的のための器官培養における新皮質スライス標本を準備し、維持するためのプロトコルです。

私たちは、ラット新皮質の錐体ニューロンにおける電位依存性カリウムチャネルの発現および機能的役割について研究してきました。...のため、

この手順の全体的な目的は、新皮質のオルガノタイプ切片からパラメタールニューロンの電気生理学的記録を得ることです。まず、生後8日から10日（P8〜P10）のラットから急性切片を作成します。次に、CD NAのBicトランスフェクションを行います。最後に、切片を3日から7日間培養します。手順の最終ステップは、電流クランプまたは電位クランプを用いて、形質導入された細胞から電気生理学的記録を得ることです。最終的に、オルガノタイプスライス中のparametal細胞が、同齢の急性スライス由来の細胞と同様の特性を持つことを示す結果を得ることができます。GFPの形質導入はこれらの特性を変化させないため、ホールセル電流クランプまたは電位クランプ記録を通じて、イオンチャネルの遺伝子操作後のニューロンの研究が可能になります。この手法の最大の利点は、急性スライスなどの手法とは対照的に、イオンチャネルを遺伝的に操作するのに十分な期間、細胞を正常な環境で維持できることです。この方法は、特定のイオンチャネル型の機能的役割など、イオンチャネル分野における重要な疑問を解決するのに役立ちます。付属の原稿に指定されている通り、層流クリーンベンチ、真空フローフード、手術用消耗品および溶液を準備します。調製した250 millilitersの切断溶液をろ過した後のすべての工程では、手袋を着用してください。そのうち40 millilitersを50 milliliterビーカーに分注します。切断チャンバー、40 mLの分注液、および残りの210 mLの切断溶液を、層流クリーンベンチ内の-20 °Cのフリーザーに置きます。6ウェルプレートの対角線上の3つのウェルに、培養液を1.1 mLずつ加えます。これを2回繰り返します。6ウェルプレート。6ウェルプレートを37°Cのインキュベーターに少なくとも1時間入れておきます。次に、滅菌済みのはさみを使用して、スライス転送に使用する転送ピペット4本の長さを短くします。溶液がスラッシュ状の混合物になった際、さらに3本のピペットをそのまま保持しておきます。40 milliliterの分注した切削液をフリーザーから取り出し、真空フードの下に置きます。そこに95%oxygen、5%carbon dioxideをバブリングさせます。次に、210 millilitersの切断溶液をフリーザーから取り出し、ラミナーフローフード内でバブリングを行います。この際、95%oxygen、5%carbon dioxideを使用します。続いて、洗浄液を冷蔵庫から取り出し、ラミナーフローフード内で100%oxygenを用いてバブリングします。2 mLの培養液をペトリ皿に入れる。残りの培養液は、脳のスライス準備に向けた週内の培地交換に使用するため、冷蔵庫で保管する。真空フード内で、50 mLビー

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

このプロトコルは、吻側渡り鳥ストリームにおける出生後の脳および神経芽細胞の遊走の高解像度のタイムラプスイメージングに最適化された器官スライスのアッセイを説明します。...

出生後の脳における神経細胞の移動の高分解能タイムラプスイメージングのための器官型スライスアッセイ

このビデオでは、細い先の尖ったピペットを脳スライスの近くに配置して、ニューロン細胞とシールを形成する方法を示します。吸引により細胞膜が破壊されるため、電気生理学実験の電流測定を可能にする全細胞パッチクランプが形成されます。...

脳スライスにおける電気生理学的記録のための全細胞電圧クランプ構成の確立

このビデオでは、ニューロン特異的な蛍光タンパク質を含むトランスジェニック脳切片の電気的活動を同時にイメージングし、記録する方法を概説しています。この手順では、脳スライスを曝気された人工脳脊髄液で灌流チャンバーに保持し、光源を使用して蛍光標識細胞を励起し、マルチチャネルプローブとパッチクランプで電気信号を記録する。...

脳切片中の神経細胞の光学的および電気生理学的同時モニタリング

Pair記録は、シナプス的に接続された2つのニューロンからの同時全細胞パッチクランプ記録であり、個々のニューロン間のシナプスの正確な電気生理学的および薬理学的特性評価を可能にします。ここでは、電気生理学が装備された任意の実験室の器官型海馬スライス培養でこの技術を確立するための詳細な方法論と要件について説明します。...

器官型海馬スライスにおけるペア全細胞記録

閉ループプロトコルは、現代の電気生理学においてますます普及しつつあります。私たちは、デスクトップコンピュータとデジタル取得ボードを使用して、in...

リアルタイム電気生理学：プローブ神経ダイナミクスとその先にクローズド·ループ·プロトコルの使用

ここでは、光反応性の非天然アミノ酸を遺伝子的にコード化することにより、短い光パルスでニューロンタンパク質を選択的に活性化する手順を、培養中または生体内でニューロンで発現するニューロンに提示します。...

ニューロンに遺伝的にコードされた非天然アミノ酸を用いた神経タンパク質の光制御

このプロトコルは、最適化されたNの実装方法を示します-メチル-D-glucamine (NMDG) 保護回復法脳スライス標本。1 つのメディアの定式化は、確実にあらゆる年齢層の様々...

最適化されたNを使用して急性脳スライスの準備-メチル-D-glucamine 保護回復法

アフリカツメガエル幼生の発達回路を勉強するセル全体パッチ ・ クランプ記録の 3...

準備やアフリカツメガエルの視蓋ニューロンの全体セル パッチ ・ クランプ記録のためのプロトコル

ここでは、脊髄スライス培養における膠 (SG) ニューロンから作られた全細胞パッチク録音のために不可欠な手順について述べる。このメソッドでは、組み込みの膜特性、シナプス伝達、調査される SG...

膠様質ニューロンの細胞パッチク ランプ記録のため急性脊髄スライスの準備

ここでは、横性属核を含む急性脳スライスの調製のためのプロトコルと、網膜原生殖器およびコルチコゲニキュレートシナプス機能の電気生理学的調査を行う。このプロトコルは、同じ急性脳スライスの高放出および低放出確率でシナプスを研究する効率的な方法を提供します。...

網膜原生殖器およびコルチコゲン化シナプス機能の電気生理学的調査

ここでは、急性げっ歯類の脳スライスにおけるシナプス特異的な電気生理学的特性評価を可能にするために、光遺伝学的構築物を備えた個別の脳領域のウイルス形質導入を記述するプロトコルを提示します。...

エクスビボ 内側前頭前野から外側嗅内皮質への長距離シナプス伝達と可塑性の光遺伝学的調べ

学ぶ新皮質の器官型スライス標本からの全細胞記録法。幼齢ラットの脳切片を用いてピラミッドニューロンの電気生理学的特性を解析し、遺伝子導入後のイオンチャネル機能を詳細に調べることができます。

新皮質の器官型スライス標本からの全細胞記録

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