マウス減数分裂細胞のフローサイトメトリーの精製

次の実験の全体的な目標は、このユニークな細胞サイクル中に起こるダイナミックなプロセスを研究するために、マウス成体精巣からの広範囲のマイティクス細胞を一度に高純度で精製することです。これは、DNAの存在下でコラゲナーゼとトリプシンによる一連の酵素消化で精巣細胞を効率的に解離することによって達成されます。1つは、第2のステップとして単一細胞精巣懸濁液を得るためのものです。

精巣懸濁液は、ハルクの3 33 42蛍光生DNA色素で染色されており、DNA含有量と密度に基づいてさまざまな筋細胞タイプを区別できます。次に、細胞遺伝学的または遺伝子発現解析などのさらなる解析に必要なすべての画分を同定および精製するために、蛍光活性化細胞ソーティングにより縮瞳細胞を解析します。包括的な細胞遺伝学的および発現アレイ研究に基づいて、入手困難な縮瞳細胞集団を高純度で効率的に精製することを示す結果が得られました。

、反復、重力沈降などの既存の方法に対するこの事実に基づくプロトコルの主な利点は、非常に高い純度で最も多くの縮瞳画分画を1つで収集できることです。この方法に不慣れな個人は、効率的なテスト解離とスタンディング、それに続く最適な細胞選別、細胞を準備する人とフローサイトメトリーオペレーターとの間の良好な相互作用、および成功に不可欠なこのプロトコルの基本を十分に理解するために、非常に異なるスキルセットを組み合わせる必要があります。細胞解離プロトコルを実演するのは、このプロトコルを大幅に改善した私たちの研究室のシニアポスドクであるDr.I Gatunです。

BVNトーレス。当社のフローサイトメトリーオペレーターが、効率的な細胞ソーティングのための最適なセットアップをご案内します。このプロトコルでは、2つの成体マウス精巣の解離が実証されますが、その量は、若年または追加の精巣に応じて適合させることができます。

まず、コラゲナーゼタイプ1のミリリットルあたり120単位をチューブに含む3ミリリットルの視線平衡塩溶液から始めます 効率的でおいしい解連合は、細胞の正しい染色とトラブルに頼るために重要です。十分なG nase 1の添加と、攪拌中にチューブを水平位置に配置することは、効率的なテスト解離にとって非常に重要です。カプセル化された1つの精巣を15ミリリットルのチューブに入れます。

10マイクロリットルのDNAを精巣に加え、精巣尿細管が解離し始めるのが見えるまで手で激しく振ってください次に、チューブを回転シェーカーで水平に固定し、チューブを最大120RPMで15分間、摂氏33度で15分間攪拌します15分後、 室温で垂直に1分間デカントします。次に、使い捨てピペットを使用して上清を捨てます。コラゲナーゼ1型を含む3ミリリットルの視線平衡塩溶液と10マイクロリットルのDナーゼ1をサンプルに加えます。

再度、チューブを手で数回振ってください。チューブを前と同じく摂氏33度で最大120RPMで最大15分間水平に攪拌し、室温で垂直に1分間攪拌した後、上清を捨てます。次に、コラゲナーゼを含む2.5ミリリットルのGBSSを追加します。

タイプ1:トリプシン50マイクロリットルとDASE10マイクロリットル。1つは、チューブを数回反転させ、摂氏33度で最大120 RPMで15分間水平に攪拌します。15分間の撹拌後、開口部の広い使い捨てプラスチック製パスピペットを使用して、サンプルを3分間静かに上下にピペットで動かします。

この時点では、塊は見えません。次に、30マイクロリットルのトリプシン、10マイクロリットルのDNA1、およびDMSOに再懸濁されたハルクス3 33 42の40マイクロリットルを追加します。チューブを数回反転させます。

摂氏33度で最大120RPMで15分間水平に撹拌します。サンプルの攪拌が完了したら、400マイクロリットルのウシ胎児血清を加え、チューブを反転させて混合してトリプシンを不活性化します。最終染色を行うには、50マイクロリットルのデマ3 33 42と10マイクロリットルのDNAを追加します。

もう一度、チューブを最大120RPMで水平に攪拌し、摂氏33度で15分間攪拌します。解離した精巣サンプルは、次に50ミリリットルの円錐管上でGBSSと事前に結合された2つの40ミクロンの使い捨てフィルターを通過します。5マイクロリットルのヨウ化プロピジウム溶液をサンプルに加え、使い捨てペーストピペットで数回ピペッティングして穏やかに混合します。

次に、サンプルを18ゲージの針で5ミリリットルのプラスチックシリンジに移します。次に、サンプル送達のために18ゲージの針を22ゲージの針に交換します。最後に、シリンジを氷上に保管し、サンプルがファックス処理の準備ができるまで光から保護します。

この実験では、Backin Dixon領域で細胞選別を行います。2つ目は、セルソーターの条件は、360ナノメートルの紫外線アルゴンレーザーと488ナノメートルのアルゴンレーザーを搭載したフローサイトメーターで以前に使用されていたものから適応されたことです。最終的には、フローサイトメーターのセットアップは、セルソーターオペレーターが最適化する必要があります。

Becton Dixon Aria two UにはUVレーザーがないため、ホーク染色を検出するためのプロトコルは、405ナノメートルのバイオレットレーザーを使用して適応されます。フックスは405ナノメートルの紫色レーザーによって励起され、488ナノメートルの青色レーザーはPI励起と前方および側方散乱検出の両方に使用されます。さらに、hos検出用のフィルターは、赤色レーザーの漏れを制限するために変更されており、その結果、散布図のシャープネスが向上しています。

バイオレットレーザーは、デマの青色発光を検出するための4 50 40ナノメートルのバンドパスと、デマの赤色発光の5 85 42ナノメートルのバンドパスで構成されています。5 0 2ナノメートルのロングパスを使用して、青色と赤色の蛍光を分離します。ここでは、2 つの異なるフィルター セットを使用した場合の違いを示します。

5 85 42ナノメートルフィルターは、6 30 30ナノメートルフィルターよりもコンパクトな細胞集団を提供します。したがって、オペレーターは、最良の妥協点を得るために、自分の機器でさまざまな組み合わせを試す準備ができている必要があります。100ミクロンのノズルは、毎秒28、000滴のドロップドライブ周波数で使用されます。

サンプルしきい値レートは、より高い分解能を維持するために1〜3の流量で、毎秒約4,000イベントです。シリンジから分注された約750マイクロリットルのアリコートにサンプルを選別します これらの一時停止中に、シリンジ内の残りのサンプルを氷上に保ち、光から保護します。選別されたサンプルを、10%FCSを添加した250マイクロリットルのDMEMを含む12 x 75ミリメートルのガラスボリッシー位置のコレクションチューブに収集します。

採取チューブ内のサンプルを摂氏4度に維持するには、選別の全期間にわたって温度制御オプションを使用します。さらに、200 RPMでサンプル攪拌機能を使用して、サンプルがソート中に沈殿するのを防ぎます。メインサンプルのアリコートを添加するたびに、採取した細胞の完全性を維持するために、採取チューブをフリックすることも重要です。

代表的な事実プロファイルは、野生型減数分裂のすべての主要なステップが識別されているこの散布図で示されています ゲート細胞が示されているこのプロットには、成人の精巣に存在する主に空の膜と精子の尾を含む大量の破片があります。代表的なヨウ化プロピジウムプロットは、サンプル中に存在するヨウ化プロピジウム陽性細胞の量が非常に限られていることを示しています。典型的な歩行は、この代表的な野生型デマ 3 33 42 ファックス プロファイルに示されています。

さらなる研究のためにこの方法を使用して精製できるさまざまな筋細胞集団は、精原細胞、プレレプチン、レプチン、接合子、パキュ、ジプロテン、および丸型スペレートを示しています。これらの最後の2つの事実プロファイルは、SPO 11 N精巣と13日齢マウスの野生型精巣からのものです。SPO 11は、ダブレット鎖を誘導して縮瞳組換えホットスポットの部位を切断する縮瞳エンドヌクレアーゼであり、ここで観察されるように、SPO O 11の不在は、レプチン接合子の初期PACUを過ぎた段階を検出できないため、明確な縮瞳不全をもたらします。

対照的に、13日間飼育された野生型雄マウスのプロファイルは、高濃度のレプチン接合子細胞を示しています。この筋症の最初の波は、明確に視覚化されているように、かなり非同期的です。この方法論を使用する この実験を行う際には、十分な量のDNAを使用することが重要です。

トラブルのない仕分けのための街の中心。研究者は最初はそれを使用することに消極的ですが、DNAの添加はサンプルの粘度を低下させ、細胞分離を促進し、無傷の細胞が損傷を受けないだけでなく、染色を促進します。マチックセルの結合のためのFOX法は、例えば、遺伝子発現ダイナミクスを研究するためのD-N-A-R-N-A抽出や、さまざまなエピジェネティックプロファイリングを確立するためのクロマチン免疫沈降技術など、幅広いダウンストリームアプリケーションで使用できます。