Name: マウス減数分裂細胞のフローサイトメトリーの精製 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-04-15T11:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 43 s
Description: 学ぶマウス精巣からの減数分裂細胞のFACSによる高純度精製法。コラゲナーゼとトリプシンを用いた酵素処理と蛍光DNA染色により、DNA含量と核密度に基づいて各減数分裂段階の細胞を効率的に分離・収集する技術を習得する。

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このプロジェクトは、フロリダ州のスクリップスと受賞の数字をそれぞれ一般医科学研究所と国立小児保健発育研究所からR01GM085079とR21HD061304、に金銭によって部分的にサポートされていました。これは、スクリップス研究所の論文番号20917です。

このプロトコルは2つの主要なステップに分けることができる：（1）に続くマウス精巣細胞の解離とヘキスト33342染色は、必要に応じて、（2）FACSでの生殖細胞から、減数分裂のすべての段階を含む、関連する減数分裂分画、のソート円形精子細胞。が収集されると、これらの高度に濃縮さ減数分裂集団は、分析の広い範囲に使用することができます。このプロトコルは、大人一人の精巣の解離を説明し、ボリュームは少年のためにまたは追加の精巣のためのそれに応じて適応させることができる。 1。精巣解離<ol><li>片足で15 mlのチューブに精巣をカプセル化が解除。 </li><li>コラゲナーゼタイプI 120 U / mlを含有するGeyのバランス塩溶液（GBSS）の3 mlを加え</li><li> DNアーゼI（50％グリセロールで1mg/mlのストック溶液）10μlを追加し、解離し始めて精巣細管が表示されるまで、手で強くそれを振る。 </li><li> 33℃で15分間で120 rpmの最大で水平方向に攪拌する</li><li>室温で垂直方向に1分間デカントして上清を捨てる。 </li><li> 1.5手順1.2を繰り返します。 </li><li>コラゲナーゼI型、1mMのHCl溶液、およびDNase I（1mg/ml）10μlに再懸50mg/mlトリプシンストック溶液の50μlを、含むGBSS 2.5 mlを加え、チューブを数回転倒。 </li><li> 33℃で15分間で120 rpmの最大で水平方向に攪拌する</li><li>広い開口部とプラスチック製の使い捨てのパスツールピペットを用いて、ピペットで静かに上下3 min.No塊のためのこの時点で表示されるはずです。 </li><li>トリプシン30μlの、DNアーゼI、DMSO（10 mg / mlの）中に再懸濁しヘキスト3334240μlの、10μlを加え、チューブを数回転倒。 </li><li> 33℃で15分間で120 rpmの最大で水平方向に攪拌する</li><li>ウシ胎児血清（FCS）の400μlを加え、トリプシンを不活性化するために転倒混和する。 </li><li>最終的な染色はヘキスト3334250μlのDMSO（10 mg / mlの）中に再懸濁し、およびDNase I（1 mg / ml）を10μlを添加することにより行われます。 </li><li> 33℃で15分間で120 rpmの最大で水平方向に攪拌する</li><li>解離精巣サンプルはその後、2つの40μmのGBSS 50 mlコニカルチューブオーバープレ接液使い捨てフィルターを通過され、次に5ヨウ化プロピジウムの溶液（PI）溶液を加え、サンプルを穏やかに使い捨てのパスツールで数回ピペッティングして混合され、ピペット。 </li><li>サンプルを18ゲージの針を通して5 mlのプラスチック注射器に転送されます。後者は、サンプル配信のために22ゲージ針で置き換えられます。注射器は、氷上で保存し、FACSの処理のための準備が整うまで、光から保護されています。 </li></ol> 2。 FACSのセットアップおよび精製<ol><li>並べ替えは、ベクトンディッキンソン-アリアIIUのセルソーターを行った。説明された条件は、したがって、異なる機器を使用して、特に出発点として使用する必要があります。我々は以前に7,8を説明した条件を使用していました。 </li><li>アリアIIUはUVレーザーを持っていないので、我々は前方および側方散乱を検出するために488nmの青色レーザーを使用するほかに、405nmのバイオレットレーザーを使用してHoescht染色を検出するためのプロトコルを適応した。さらに、一部のフィルタが改良された散乱プロットの鋭さで、その結果、いくつかの赤色レーザーの漏出を制限するために変更されました。 </li><li>バイオレットレーザーはHoescht青色発光を検出するための450/40nmバンドパスとHoeschtレッド放出の585/42nmバンドパスで構成されました。 502nmロングパスは赤色蛍光から青を分離するために使用されていました。 </li><li> 100μmのノズルは、28000滴/秒のドロップ駆動周波数で使用されました。サンプルのしきい値の率は、約4000イベント/秒であった。温度制御のオプションが4で、サンプルとコレクションチューブを維持するために使用された℃でのソートの全体の持続時間。さらに、サンプルの攪拌機能がソート全体の沈降からサンプルを防止するために200rpmで使用されていました。 </li><li>通常2〜3精巣は各人口に対して0.5〜2.0x10 6個の細胞（代表的なセクションを参照）の収集を可能にする6時間のソートごとに処理されました。 </li><li>サンプルは、シリンジから分配さ約750μlのアリコートでソートされた。一方、これらの中にコレクションチューブを、4℃に保たれた光から保護され、ゆっくりと前に再開ソートに混合した一時停止します。 </li><li>ソートされたサンプルは、10％FCSを添加した250μlのDMEMを含む12x75mmガラスborosilicatedコレクションチューブに回収した。 </li></ol> 3。代表的な結果： 典型的なFACSプロファイルを図1に示されています。減数分裂の主な手順のすべてが識別され、凡例に示されます。ヘキスト33342染色液が最適でない場合は、グローバルプロファイルは、よりコンパクトに表示され、以下に定義されます。一般的な問題は、急速な細胞の凝集を誘発するに十分なDNaseを、追加しないことを考えています。すべての起訴のステップで余分なDNaseの添加は、通常、この問題を解決します。凍結番目DNアーゼ在庫切れawing（-20℃で保存）酵素活性の急速な損失でこの結果として、最小限に抑える必要があります。 Spo11は減数分裂組換えのホットスポット12の部位で二本鎖切断を指示する減数分裂エンドヌクレアーゼである。 図2は放棄減数分裂12にその結果、形成されただけでなく、されていない二重鎖切断Spo11 -ヌル精巣の典型的なプロファイルを示しています減数分裂のこの最初の波の非同期な性質を明らかに、13日齢マウスのプレpuberousプロファイル。シナプトネマ複雑なタンパク質3（SCP3）とリン酸化ヒストンH2AX抗体のステージ固有の減数分裂のマーカーの組み合わせを使用して標準的な細胞遺伝学的解析は、最初elswhere 11を説明するように、ソートされた減数分裂細胞の純度や性質を確認するために使用する必要があります。 <img src="/files/ftp_upload/2602/2602fig1.jpg" alt="図1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図1"> 図1野生型減数分裂のFACSプロファイル。 A）代表的な散布図が表示されます。ゲートのセルが表示されます。主に空の膜と精子細胞の尾を含む成人精巣内に存在する破片が大量に注意してください。 B）代表的なPIのプロットは試料中に存在するPI陽性細胞のごく限られた量を示しています。典型的なゲートが表示されます。 C）代表的な野生型ヘキスト33342 FACSプロファイルが表示されます。さらなる研究のためにこの方法を用いて精製することができる様々な減数分裂細胞集団が示されている：精原細胞（SP）、プリ細糸期（PL）、細糸期、接合期（L / Z）、早期パキテン期（EP）、ミドルパキテン期（ MP）、後期パキテン期（LP）、複糸期（D）、及び円形精子細胞（RS）。 <img src="/files/ftp_upload/2602/2602fig2.jpg" alt="図2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図2"> 図2。Spo11 - nullと野生型の13日目減数分裂FACSプロファイル。 A）典型的なSpo11 - nullのプロファイルは、接合糸期/細糸期早期パキテン期過去のないステージが検出されないことができる明確な減数分裂の失敗、と示されています。 B）13日齢の野生型雄マウスのプロフィールは、細糸期/接合糸期の細胞の高濃度を示しています。減数分裂のこの最初の波は、明確にこの手法を用いて可視化ではなく、非同期です。

<ol><li>Meistrich, M. L., Bruce, W. R., Clermont, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+composition+of+fractions+of+mouse+testis+cells+following+velocity+sedimentation+separation%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Cellular composition of fractions of mouse testis cells following velocity sedimentation separation.</a> Exp. Cell Res. 79, 213-227 (1973).</li>
<li>Grabske, R. J., Lake, S., Gledhill, B. L., Meistrich, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Centrifugal+elutriation%3A+separation+of+spermatogenic+cells+on+the+basis+of+sedimentation+velocity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Centrifugal elutriation: separation of spermatogenic cells on the basis of sedimentation velocity.</a> J. Cell. Physiol. 86, 177-189 (1975).</li>
<li>Purification, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((culture%2C+and+fractionation+of+spermatogenic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">culture, and fractionation of spermatogenic cells.</a> Methods Enzymol. 225, 84-113 (1993).</li>
<li>Romrell, L. J., Bellve, A. R., Fawcett, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Separation+of+mouse+spermatogenic+cells+by+sedimentation+velocity.+A+morphological+characterization%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Separation of mouse spermatogenic cells by sedimentation velocity. A morphological characterization.</a> Dev. Biol. 49, 119-131 (1976).</li>
<li>Meistrich, M. L., Trostle, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Separation+of+mouse+testis+cells+by+equilibrium+density+centrifugation+in+renografin+gradients%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Separation of mouse testis cells by equilibrium density centrifugation in renografin gradients.</a> Exp. Cell Res. 92, 231-244 (1975).</li>
<li>Namekawa, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Postmeiotic+sex+chromatin+in+the+male+germline+of+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Postmeiotic sex chromatin in the male germline of mice.</a> Curr. Biol. 16, 660-667 (2006).</li>
<li>Lassalle, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Side+Population%27+cells+in+adult+mouse+testis+express+Bcrp1+gene+and+are+enriched+in+spermatogonia+and+germinal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Side Population' cells in adult mouse testis express Bcrp1 gene and are enriched in spermatogonia and germinal stem cells.</a> Development. 131, 479-487 (2004).</li>
<li>Bastos, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometric+characterization+of+viable+meiotic+and+postmeiotic+cells+by+Hoechst+33342+in+mouse+spermatogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Flow cytometric characterization of viable meiotic and postmeiotic cells by Hoechst 33342 in mouse spermatogenesis.</a> Cytometry A. 65, 40-49 (2005).</li>
<li>Chowdhury, R., Bois, P. R., Feingold, E., Sherman, S. L., Cheung, V. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+analysis+of+variation+in+human+meiotic+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Genetic analysis of variation in human meiotic recombination.</a> PLoS Genet. 5, e1000648-e1000648 (2009).</li>
<li>Roig, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+TRIP13%2FPCH2+is+required+for+recombination+and+normal+higher-order+chromosome+structure+during+meiosis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Mouse TRIP13/PCH2 is required for recombination and normal higher-order chromosome structure during meiosis.</a> PLoS Genet. 6, (2010).</li>
<li>Getun, I. V., Wu, Z. K., Khalil, A. M., Bois, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleosome+occupancy+landscape+and+dynamics+at+mouse+recombination+hotspots%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Rep%22%5BJournal%5D)">Nucleosome occupancy landscape and dynamics at mouse recombination hotspots.</a> EMBO Rep. 11, 555-560 (2010).</li>
<li>Romanienko, P. J., Camerini-Otero, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mouse+Spo11+gene+is+required+for+meiotic+chromosome+synapsis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">The mouse Spo11 gene is required for meiotic chromosome synapsis.</a> Mol. Cell. 6, 975-987 (2000).</li>
</ol>

利害の衝突は宣言されません。

本明細書において提示されるプロトコルは、研究者がこの基本的なプロセスのダイナミクスを研究することができます、1つは同時に成体雄マウスから非常に高純度で減数分裂段階の細胞の範囲全体を浄化することができます。精製された細胞は、RNA抽出9,10、ヌクレオソームマッピング11、組換え分子の検出、タンパク質解析、および多くに至るまで多数のアプリケーションに使用することができます。しかし、検出方法は、精製された減数分裂細胞の量に適合させる必要があります。また、この方法の高い再現性と、それは特定の実験に必要な材料の量を増やすために、異なる日に行われた同じ割合のプールに複数の独立したソートに可能です。また、この方法は1つが急速に遺伝子ノックアウト、発達の進行の収差、または（ 例えば 、照射減数分裂に影響を与えることを目的とする特定の治療の効果の効果を評価することができます全体の減数分裂過程のユニークなビジュアル表現、と研究者を提供する、または小分子阻害剤による治療）。 このプロトコルの重要なステップは、（i）大幅に細胞塊及び凝集体を避...

<table><tbody><tr><td>コラゲナーゼ Type-1</td><td>Worthington Biochemical</td><td>CLSS1</td><td>GBSSを用いて12,000U/mlに溶解し、4&amp;#x00B0;Cで保存</td></tr><tr><td>トリプシン</td><td>Worthington Biochemical</td><td>TRL3</td><td>1mM HClを用いて50mg/mlに溶解し、4&amp;#x00B0;Cで保存</td></tr><tr><td>H&amp;#8211;chst 33342</td><td>Acros Organics</td><td>230001000</td><td>飽和溶液（DMSO中で10mg/ml）、4&amp;#x00B0;Cで保存</td></tr><tr><td>DNAse I</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DNEP</td><td>水/50%グリセロールを用いて1mg/mlに溶解し、-20&amp;#x00B0;Cで保存</td></tr><tr><td>Gey&amp;rsquo;s 平衡塩溶液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9779</td><td></td></tr><tr><td>6&quot; 転送ピペット</td><td>Fisher Scientific</td><td>137119D</td><td></td></tr></tbody></table>

マウス減数分裂細胞のフローサイトメトリーの精製

Flow Cytometry Purification of Mouse Meiotic Cells

精巣の細胞型の異種性質と減数分裂細胞培養モデルの不在は、減数分裂時のマニフェストの一意の分化プログラムの研究に大きなハードルとなっている。 BSAおよび/またはパーコール勾配を使用して水簸またはStaput（沈降）：二つの主要なメソッドは、程度の差は、成人および幼若動物の両方から様々な減数分裂分画を精製するために開発されている。これらのメソッドの両方は1-5減数分裂細胞を分離するためにセルサイズと密度に依存しています。全体的に、少数の細胞集団6を除いて、これらのプロトコルは、詳細な分子解析のために必要な多数の減数分裂細胞集団の十分な純度を得るために失敗する。また、そのような方法で減数分裂細胞の通常一種類は、減数分裂細胞のサンプルを比較するときに再現性と均質性に関する複雑さの余分なレベルを追加する所定の時間、で精製することができる。 ここでは、ヘキスト33342染色7,8と組み合わせてFACSを用いて、生殖細胞から円形精子細胞に、1つは簡単に、視覚化、識別、および減数分裂細胞を浄化するための洗練された方法を説明します。このメソッドは、全体の減数分裂過程の全体のスナップショットを提供し、一つ非常に減数分裂の最もステージから生細胞を浄化することができます。これらの精製された細胞は、その後、遺伝子発現9,10と減数分裂組換え11のホットスポットでのヌクレオソームの占有率のダイナミクスの例の変更については、減数分裂を通しての進行に伴う分子の変化を詳細に分析することができます。

マウス精巣から高度に精製された実行可能な減数分裂分画を得るために効率的な方法は、蛍光活性化細胞選別（FACS）による洗練された細胞解離のプロトコルを組み合わせています、説明されています。このメソッドは、離散的な減数分裂画分のDNA含量の違いと核密度を利用しています。

精巣内における細胞型の不均一性と、減数分裂細胞の培養モデルが存在しないことが、…の研究における大きな障害となってきました。

本実験の全体的な目的は、マウス成体精巣から広範な有糸分裂細胞を一度に高純度で精製し、このユニークな細胞周期中に起こる動的なプロセスを研究することです。これは、collagenaseおよびtrypsinによる一連の酵素消化を行い、dnaの存在下で精巣細胞を効率的に解離させることで達成されます。第2ステップとして、単一細胞精巣懸濁液を得ます。試験懸濁液をHulk's 3 33 42蛍光生存DNA染料で染色します。これにより、DNA量と密度に基づいてさまざまな有糸分裂細胞の種類を区別することが可能になります。次に、有糸分裂細胞を蛍光活性化細胞分取（FACS）で解析し、細胞遺伝学的解析や遺伝子発現解析などのさらなる分析に必要なすべての分画を同定・精製します。包括的な細胞遺伝学的研究および発現アレイ研究に基づき、得がたい有糸分裂細胞集団を高純度で効率的に精製できるという結果が得られます。遠心分離、リトラシオン、または重力沈降などの既存の手法に対する、この事実に則ったプロトコルの主な利点は、極めて高純度で最も多くの有糸分裂画分を一度に回収できることです。この手法に不慣れな方は、効率的な組織解離と静置を行い、その後に最適な細胞ソートを実施するために、全く異なるスキルセットを組み合わせる必要があります。そのためには、細胞を準備する担当者とフローサイトメトリーのオペレーターとの良好な連携に加え、成功に不可欠なこのプロトコルの基本事項を十分に理解していることが重要です。細胞解離プロトコルの実演は、当研究室のシニアポストドクで、本プロトコルを大幅に改良したDr.I Gatunが行います。BVN Toresです。フローサイトメトリーのオペレーターが、効率的なセルソーティングのための最適なセットアップについて解説します。本プロトコールでは、成マウス2匹の精巣の解離について実演しますが、量については若齢マウスや精巣の数を増やす場合に合わせ、適宜調整してください。まず、120 units/mLのcollagenase type oneを含むgaze balanced salt solution 3 mLをチューブに入れます。効率的かつ完全な組織解離は、細胞の正確な染色とトラブルのない分取において極めて重要です。十分な量のcollagenase oneの添加と、撹拌中のチューブの水平保持が、効率的な組織解離には不可欠です。カプセルに包まれた精巣1個を15 mLチューブに入れます。DNase Iを10 µL精巣組織に加え、精巣細管が解離し始めるまでチューブを手で激しく振ります。次に、チューブをローテーティングシェーカーに水平に固定し、33 °Cで最大120 RPMで15分間攪拌します。15分後、室温で1分間垂直に遠心分離して上清を分離させます。その後、使い捨てピペットを用いて上清を除去します

flow-cytometry-purification-of-mouse-meiotic-cells

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

のフローサイトメトリーベースの精製<em&gt; S.セレビ</em&gt;受精卵

酵素および洗剤を回避するげっ歯類の材料から精巣細胞懸濁液を機械的に調製するための新規なプロトコルは、記載されている。この方法は非常に簡単、迅速、再現性があり、フローソーティングおよびRNA抽出のために適している良質の細胞懸濁液を、レンダリングする。...

精巣細胞懸濁液の調製のためのシンプルで効率的な手法

フローサイトメトリーを用いたマウス精子細胞の選別戦略を記述します。精子細胞は、円形(精子形成ステップ1-9)、早期伸長(精子形成ステップ10-12)、後期伸長(精子形成ステップ13-14)、細長い精子細胞(精子形成ステップ15-16)の4つの高純度集団に分類されます。DNAの染色、サイズ、および顆粒度が選択パラメータとして使用されます。...

フローサイトメトリーによるマウス精子細胞のステップ固有のソート

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マウスの骨髄から形質細胞様樹状細胞の精製のために、蛍光活性化細胞選別

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機械的組織解離およびフローサイトメトリーによる哺乳動物雄胚細胞のマルチシード精製のための標準的アプローチ

この記事は、ミトコンドリアや細胞内のリソソームを定量化する強力な方法を示しています。リソソームやミトコンドリア固有染料表面マーカー蛍光に活用された抗体との組み合わせにより、初代培養細胞を用いた組織サンプルから収穫のような混合細胞集団におけるこれらのオルガネラの定量化フローサイトメトリー マルチ...

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ここでは、初期バースト形成ユニット赤血球(BFU-e)およびコロニー形成ユニット赤血球(CFU-e)前駆細胞を新鮮なマウス骨髄および脾臓から直接前向きに単離するための新しいフローサイトメトリー法について説明します。単一細胞トランスクリプトームデータに基づいて開発されたこのプロトコルは、組織のすべての赤血球前駆細胞を高純度で分離した最初のプロトコルです。...

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