使用BMP4のエフェクター-錯体のダウンストリームシグナリングの検出その場で PLA、近接ライゲーションアッセイ

本実験の全体的な目的は、組織培養細胞におけるBMPシグナリングを可視化し、定量化することである。BMPは細胞表面の受容体に結合し、3つのsmadエフェクターであるsmad one、smad five、およびSMAD eightをリン酸化する。これらはsmad fourと複合体を形成して核内へ移行し、そこで転写を制御する。

ここでは、BMP刺激の有無にかかわらず、組織培養細胞内における内在性SMADエフェクターとSmad4との間に形成される複合体を可視化するためにPLAを使用します。まず、3種類のリン酸化SMADエフェクターすべてを認識する一次抗体と、Smad4を認識する一次抗体の2種類を並行して使用します。次に、PLAプローブと呼ばれる二次抗体を添加します。各プローブには固有の短いDNA鎖が付着しており、これらが一次抗体に結合します。PLAプローブ同士が近接している場合、その後2種類のサークル形成DNAオリゴヌクレオチドを添加することで、DNA鎖が相互作用します。

これらは酵素的ライゲーションによって結合し、環状構造を形成します。この環状DNAは、増幅反応後にローリングサークル増幅によって増幅されます。標識された相補的オリゴヌクレオチドプローブをハイブリダイゼーションさせることで、各環状DNA産物の増幅に伴う産物蛍光スポットが強調され、容易に視認することができます。

蛍光顕微鏡で観察すると、スポットはエフェクター、seds、およびsmad fourの複合体に対応しており、これは細胞内でのBMPシグナリングの活性化を示しています。既存の手法に対するPLAの主な利点は、操作が簡便で感度が高く、バックグラウンドがないことであり、in situで活性化したBMPシグナリングを定量できることです。BMP経路は、いくつかの臓器や組織の発達、および幹細胞の増殖や分化を含むプロセスにとって不可欠です。

PLAは、BMPシグナルのダイナミクス、レベル、および細胞内局在に関する重要な疑問を解決するために使用できるだけでなく、診断にも利用可能です。この経路はいくつかの疾患の根底にあるため、BLAを用いてBMPやその他の経路の他の信号伝達成分を研究することができ、組織切片や胚全体への適用も可能です。in situ 近接結紮アッセイを開始するために、細胞培養を準備します。Neuro 2A細胞は、10% FBS、1倍非必須アミノ酸、1倍ピルビン酸、および1倍 L-glutamineを添加したGMEMで培養します。

トリプシンを用いて細胞を剥離し、1ウェルあたり15,000〜20,000個の細胞を播種します。16ウェルチャンバースライドを用い、加湿された5% carbon dioxide インキュベーター内で37 °Cで24時間培養します。24時間後。

コントロール群については、培地をサプリメント添加済みの無血清GMEMに交換し、さらに2〜3時間インキュベートする。2回目のインキュベーション後、3つのウェルに細胞を通常の培養条件下で保持する。2 µMのdorsamorphineを細胞に添加してBMP経路を阻害するか、あるいはBMP4を10〜60分間添加してシグナル伝達を誘導する。

細胞刺激後、ウェルから培地を吸引し、細胞の剥離を防ぐためにPBSで穏やかに洗浄します。PBSを細胞に直接ピペッティングしないでください。その後、PBSを吸引し、ウェル周囲のシリコンは残したままチャンバーを取り除きます。

新鮮に調製し、ろ過した4%パラホルムアルデヒドを50 µLウェルに加え、室温で振盪せずに10分間インキュベートする。固定後、コピンジャーを用いて室温で振盪しながら、PBSで5分間細胞を洗浄する。この洗浄操作を繰り返し、計3回洗浄を行う。

次に、コピンジャー内でPBSに溶解した0.5%Triton X 100を用いて細胞を透過処理し、室温で10分間、攪拌せずにインキュベートします。その後、0.05%Tween 20含有TBSを用いて、コピンジャー内で攪拌しながら1回5分間の洗浄を3回行います。スライドを軽く叩いて最後の洗浄液を除去し、ブロッキングの手順を開始します。

細胞を乾燥させないように注意しながら、各ウェルにDUO linkを1滴加えたブロッキング溶液を添加します。蒸留水をいれた空のピペットチップボックスで構成された、あらかじめ加温した加湿チャンバー内で、細胞をブロッキング溶液中で37°Cで30分間インキュベートします。

一次抗体溶液を調製するため、anti phospho smad 1 5 8およびanti SMAD fourをDuoLink 2 Antibody Diluentで1:100に希釈します。各抗体を単独および組み合わせて使用します。次に、スライドを軽く叩いてブロッキング溶液を除去し、適切なウェルに抗体溶液を40 µLずつ加えます。希釈液のみを用いたネガティブコントロールを含めることができます。

細胞が乾燥しないよう、この操作は迅速に行ってください。次に、あらかじめ温めておいた加湿チャンバー内で、スライドを37°Cで1時間インキュベートします。インキュベーション中に、2種類のPLAプローブを希釈液で希釈します。

各反応用に、各プローブ8 µLと希釈液24 µLを混合し、プローブを溶液中で5倍に希釈します。1時間のインキュベーション後、一次抗体溶液を捨て、カップリングジャーを用いて室温で攪拌しながら、Duo link 洗浄バッファーAでスライドを2回、各5分間洗浄します。洗浄完了後、スライドに残っている洗浄バッファーAを捨て、各スライドにPLAプローブ溶液を40 µL加えます。

次に、スライドをあらかじめ加温した加湿チャンバー内で37 °Cでインキュベートします。1時間の間、Duolinkライゲーションストックを扱い、ライゲーションミックスの必要量を調製します。まずDuolinkライゲーションストックをボルテックスし、高純度水で1倍に希釈してください。

リガーゼ酵素を本溶液に1/40の割合で添加し、1ウェルあたり40 µLの混合液が必要であることに留意してください。インキュベーション後、スライドからPLAプローブ溶液を拭き取り、洗浄バッファーで2回洗浄します。最後の洗浄時には、カップリングジャーを用いて室温で5分間、攪拌しながら洗浄してください。Duo link Ligaseをフリージングブロックで取り出し、ライゲーション溶液に最終希釈倍率1/40となるように加え、ボルテックスで混合します。

次に、スライドから洗浄バッファーAの最終容量を吸い取り、40 µLのリガーゼ反応液を加えます。各スライドを酵素と共に攪拌します。あらかじめ加熱した加湿チャンバー内で、スライドを30分間インキュベートします。

37 °CでDUO link増幅ストックを融解し、DUO Link増幅ストックを高純水で1倍に希釈して、インキュベーション中の増幅ステップの準備を行います。試薬は光に敏感であるため、遮光して保存してください。ライゲーションステップが完了したら、溶液を捨て、室温で攪拌しながらカップリングジャーを用いてWash Buffer Aで2分間ずつ2回スライドを洗浄します。最後の洗浄の間に、DUO link polymeraseを増幅溶液に最終希釈倍率1:280になるように加え、ボルテックスします。洗浄バッファーを捨てた後、各ウェルに増幅混合液を40 µL加え、あらかじめ37 °Cに加温した暗所湿潤チャンバー内で100分間インキュベートします。

増幅インキュベーションが完了したら、スライドからポリメラーゼ溶液を吸い取り、カップリングジャーを用いて洗浄バッファーBで2回、1回につき10分間洗浄します。試薬は光に敏感であるため、このステップの間はスライドを遮光してください。2回の洗浄後、0.1倍の洗浄バッファーBに浸します。次に、16ウェルスライドからシリコンを完全に除去し、そこに約40 µLのデュオを添加します。

カバーガラスに封入剤を滴下し、サンプル上にゆっくりと載せます。カバーガラスの下に気泡が入らないように軽く押し付け、マニキュアを用いてカバーガラスをスライドに固定・密封し、イメージングまで少なくとも15分間放置します。これらは、BMP経路の阻害剤である2 µMのdorsomorphinで処理した細胞、または25 ng/mLのBMP4で60分間処理した細胞の共焦点画像です。

活性化Smad複合体を検出するために、Phospho Smad 1 58およびSmad 4に対する抗体を用い、これらは赤色のスポットとして観察される。細胞核はDPIによって青色に染色されている。PLA信号はDUOlink ImageToolソフトウェアでカウントし、細胞あたりの核内の平均スポット数をグラフに示した。

いずれかの一次抗体を単独で使用した場合には染色は認められず、PLAプローブによる背景染まりおよびその後のオリゴヌクレオチドのライゲーションは起こっていないことが示されました。同様に、両方の一次抗体を省略した別のネガティブコントロールにおいても、スポットは検出されませんでした。Neuro 2A細胞を用いたSDS-PAGE免疫ブロット法により、未処理およびBMP処理した細胞において、リン酸化に関連するSMAD 1 5 8が検出されました。

しかしながら、背側形態でモルヒネ処理した細胞では、phospho smadのレベルが著しく低下しています。PCNAに対する抗体は、ローディングコントロールとして用いています。このビデオを視聴することで、細胞固定後6時間以内に結果を得るために我々が推奨する手順とセットアップについて、十分に理解できるはずです。

要約すると、手順は一次抗体インキュベーションのブロッキング、PLAプローブのインキュベーション、ライゲーション増幅、封入およびイメージングです。