Name: 使用BMP4のエフェクター-錯体のダウンストリームシグナリングの検出その場で PLA、近接ライゲーションアッセイ (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-03-03T17:03:00.000+00:00
Duration: 12 min 52 s
Description: 学ぶBMP4刺激下のエフェクター-錯体形成を可視化する近接ライゲーションアッセイ（PLA）法。固定細胞内のBMPシグナル伝達を定量化し、神経系細胞における動態解析に応用できます。

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この研究は、MRCとBBSRCの助成金によって運営されている。我々は技術と有用な助言を設定すると助けるために、ウルフLandegrenの研究室でウプサラ大学の阿形ZiebaとカテリーナPardalisに感謝。技術的なヘルプとプレゼンテーションのためのBiosienceをOlink。

1。細胞のプレーティングとBMPによる治療<ol><li> GMEMの文化Neuro2a細胞は10％FBSを添加した、1 ×非必須アミノ酸（NEAM）、1Xピルビン酸ナトリウムとL -グルタミン1X。トリプシン（0.05％- EDTA）とプレート16ウェルチャンバースライドにウェル当たり15.000から20.000までの細胞を用いて細胞を分割する。 文化HEK293Tまたは10％FBS、1X L -グルタミンおよび1xペニシリン/ストレプトマイシンを含むDMEMでCOS7細胞。 70％エタノールでそれらを浸漬し、1cm 2の井戸を描くImmedgeのペンを使用してpolysineスライドを滅菌する。 50μlの培地でトリプシン（0.05％- EDTA）とプレートウェルあたり20.000から25.000の細胞を用いて細胞を分割する。 </li><li> 37細胞をインキュベートします加湿、5％CO 2インキュベーターでC。 </li><li> 24時間後には、Neuro2aのための無血清GMEM（アルブミン0.1％、1 × NEAM、1Xピルビン酸ナトリウムおよび1x L -グルタミンを添加した）、またはHEK293Tための無血清DMEM（L -グルタミンおよび1xペニシリン/ストレプトマイシンを補充）で培地を交換してください/ COS7と2〜3時間細胞をインキュベートコントロールとして使用するために、通常の培養条件下で細胞（すなわち、10％FBS）で3つのウエルに保管してください。 </li><li>希望の時間のためのdorsomorphin（BMP経路の阻害剤、2μM）またはBMP4（25 ng / ml）を持つセル（10分1時間など）5を扱います。 </li></ol> 2。固定と透過処理<ol><li>固定、4％PFAを準備します。 100ミリリットルPBS中4％溶液を調製するPFAの4gを秤量する。 50で解決策を温める·それがクリアされているCまで。使用するまで4℃で0.22μmフィルターとストア° Cを介してソリューションをフィルタリングします。 （2日以上保管されていない）新鮮な固定剤を使用してください。 </li><li>井戸から培地を吸引除去し、1xPBSで洗浄する。これは、細胞の剥離に繋がる可能性があるので、細胞に直接ソリューションをピペッティングしないでください。チャンバースライドが使用されている場合、次のステップに進む前に、チャンバーを取り外しますが、井戸の周囲にシリコンを残す。 </li><li>攪拌することなく、室温で、10分間50μlを4％PFAとインキュベートする。 </li><li>室温で攪拌しながらコプリンジャーに3 × 5分間PBSで細胞を洗浄する。 </li><li> 0,5％トリトンPBSでX - 100を10分間室温で攪拌することなく細胞を扱う。 </li><li>室温で攪拌しながらコプリンジャーに3 × 5分間TBSに0.05％のTween 20（TBS - T）で細胞を洗浄する。 </li></ol> 3。ブロッキング<ol><li> TBS - Tをオフにタップします。ウェルあたりDuolink IIブロッキング溶液（1X）の一滴を追加。 </li><li> 37℃で1時間予備加熱湿度チャンバ内のスライドをインキュベート℃に</li></ol> 4。一次抗体<ol><li> 1:100でaP-Smad1/5/8（ウサギポリクローナル）およびDuolink IIの抗体希釈液で1:100（1 ×）で、であるSmad4を（マウスモノクローナル）混和し希釈する。コントロールに使用される同じ濃度でもaP-Smad1/5/8と単独で、であるSmad4を準備します。 </li><li>スライドからのブロッキング溶液をオフにタップします。できる限り多くのブロッキング溶液を除去しますが、抗体を加える前に細胞が乾燥させないよう細心の注意を払って。ウェルに抗体溶液40μlを添加する。つでも追加のネガティブコントロールとしてのみ抗体希釈液を加える。 </li></ol> 5。 PLAプローブ<ol><li>抗体希釈液で2つのPLAプローブ（Duolink II抗マウスMINUSとDuolink II抗ウサギPLUS）1:5に希釈する。 </li><li>スライドからの一次抗体溶液をオフにタップします。 5分× 1 Duolink IIでそれぞれ室温で攪拌しながらコプリンジャーに洗浄バッファーをスライドを2回洗浄する。 </li><li>スライドから洗浄バッファーをオフにタップして、PLAプローブ溶液（40μl/ウェル）を追加します。 37℃で1時間予備加熱湿度チャンバ内のスライドをインキュベート℃に</li></ol> 6。ライゲーション<ol><li>渦Duolink IIのライゲーションの株式（5倍）と高純度の水と混合で1:5に希釈する。水の体積を計算する場合、考慮にちょうど井戸のミックスの添加前1:40の最終希釈で追加されるリガーゼのボリュームを取る。 </li><li>スライドからのPLAのプローブ溶液をオフにタップします。 1 ×洗浄バッファーでスライドを室温で攪拌しながらコプリンジャーに2回、5分ごとに洗浄する。 </li><li>凍結ブロック（-20℃）を使用してフリーザーからリガーゼを取り出してください。 1時40分希釈と渦におけるライゲーション溶液（6.1で調製）にリガーゼを追加。 </li><li>スライドから洗浄バッファーをオフにタップして、各ウェルにライゲーション-リガーゼの溶液（40μl/ウェル）を追加します。 37℃で30分間予備加熱湿度チャンバ内のスライドをインキュベート℃に</li></ol> 7。増幅注：ライトセンシティブ試薬。遮光してスライドしてください。 <ol><li>高純度の水とミックスでDuolink II増幅株式（5x）を1:5に希釈する。水の体積を計算するとき考慮にちょうど目にミックスの添加前1:80の最終希釈で追加されるポリメラーゼの量を取る電子井戸。 </li><li>スライドからライゲーション-リガーゼのソリューションをオフにタップします。室温で攪拌しながらコプリンジャーに2回2分間ずつで1 ×洗浄バッファーでスライドを洗浄します。 </li><li>凍結ブロック（-20℃）を使用してフリーザーからポリメラーゼを取り出してください。 1:80希釈し、ボルテックスで増幅液（7.1で調製）にポリメラーゼを追加。 </li><li>スライドから洗浄バッファーをオフにタップして、各ウェルに増幅 - ポリメラーゼの溶液（40μl/ウェル）を追加します。 37℃で100分間予備加熱湿度チャンバ内のスライドをインキュベート℃に</li></ol> 8。イメージングのための準備注：ライトセンシティブ試薬。遮光してスライドしてください。 <ol><li>スライドから増幅 - ポリメラーゼのソリューションをオフ]をタップし、室温で攪拌しながらコプリンジャーに1X Duolink IIウォッシュバッファーBでそれぞれ2回10分間洗浄する。 </li><li> 0.1 × Wash BufferをBにスライドを浸し</li><li>完全に16ウェルスライドからシリコーンを削除します。カバースリップ上DAPIでミディアムを取り付けDuolink IIの〜40μlのを加え、穏やかにわずかにカバースリップの下に気泡がないこと、それを押すとサンプルの上に置きます。マニキュアを使用してスライド上にカバースリップを修正し、シールします。イメージングに進む前に、少なくとも15分間待ちます。 </li><li>共焦点または蛍光顕微鏡でサンプルを分析する。デジタル画像を取得します。 </li></ol> 9。定量化注：ライトセンシティブ試薬。遮光してスライドしてください。 <ol><li>信号レベルの測定値を得るために画像信号をカウントするDuolink imagetoolを使用してください。 </li><li>測定値を比較し、グラフを作る。 </li></ol> 10。代表的な結果 その場 PLAの実験での結果は離散蛍光スポットとして表示されます。信号の場所は調査特定のタンパク質に依存します。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/2631/2631fig1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図1"> 図1 その場 PLA において BMP4刺激後のNeuro2a細胞で。細胞は60分または（CE）放置しておくために2μMdorsomorphin（BMP経路の阻害剤）（）または25 ng / mlのBMP4（B）で処理した。 P-Smad1/5/8とであるSmad4に対する抗体は、AとBの一次抗体単独でaP-Smad1/5/8（C）と - であるSmad4アローン（D）または一次の不作為に積極的に複合体を検出するために使用された抗体（E）をコントロールとして使用した。青：DAPI、赤：PLA信号。写真は、ライカSP5共焦点顕微鏡で得られた。 （F）PLA信号がDuolink imagetoolでソフトウェアを用いて計数し、細胞あたりの核のスポットの平均数をグラフで表示されます。 （G）Neuro2a細胞は未処理のままかDorsomorphin（2μM）または60分間BMP4（25 ng / ml）を処理した。細胞を溶解し、タンパク質をSDS - PAGEに供し、コントロールを読み込むとaP-Smad1/5/8と、PCNAを用いたイムノブロッティングにより分析した。 （*）非特異的バンド。 aP-Smad1/5/8抗体であるSmad4と複合体中に存在3種類のタンパク質を区別できないことに注意してください。

<ol><li>Miyazono, K., Kamiya, Y., Morikawa, M. B. one <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((morphogenetic+protein+receptors+and+signal+transduction%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biochem%22%5BJournal%5D)">morphogenetic protein receptors and signal transduction.</a> J Biochem. 147, 35-51 (2010).</li>
<li>Gustafsdottir, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proximity+ligation+assays+for+sensitive+and+specific+protein+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Proximity ligation assays for sensitive and specific protein analyses.</a> Anal Biochem. 345, 2-9 (2005).</li>
<li>Soderberg, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+observation+of+individual+endogenous+protein+complexes+in+situ+by+proximity+ligation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Direct observation of individual endogenous protein complexes in situ by proximity ligation.</a> Nat Methods. 3, 995-1000 (2006).</li>
<li>Soderberg, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterizing+proteins+and+their+interactions+in+cells+and+tissues+using+the+in+situ+proximity+ligation+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Characterizing proteins and their interactions in cells and tissues using the in situ proximity ligation assay.</a> Methods. 45, 227-232 (2008).</li>
<li>Yu, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dorsomorphin+inhibits+BMP+signals+required+for+embryogenesis+and+iron+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Dorsomorphin inhibits BMP signals required for embryogenesis and iron metabolism.</a> Nat Chem Biol. 4, 33-41 (2008).</li>
<li>Baan, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+proximity+ligation+detection+of+c-Jun%2FAP-1+dimers+reveals+increased+levels+of+c-Jun%2FFra1+complexes+in+aggressive+breast+cancer+cell+lines+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">In situ proximity ligation detection of c-Jun/AP-1 dimers reveals increased levels of c-Jun/Fra1 complexes in aggressive breast cancer cell lines in vitro and in vivo.</a> Mol Cell Proteomics. 9, 1982-1990 Forthcoming.</li>
<li>Massinen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+interaction+of+DYX1C1+with+estrogen+receptors+suggests+involvement+of+hormonal+pathways+in+dyslexia%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">Functional interaction of DYX1C1 with estrogen receptors suggests involvement of hormonal pathways in dyslexia.</a> Hum Mol Genet. 18, 2802-2812 (2009).</li>
<li>Thymiakou, E., Zannis, V. I., Kardassis, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physical+and+functional+interactions+between+liver+X+receptor%2Fretinoid+X+receptor+and+Sp1+modulate+the+transcriptional+induction+of+the+human+ATP+binding+cassette+transporter+A1+gene+by+oxysterols+and+retinoids%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Physical and functional interactions between liver X receptor/retinoid X receptor and Sp1 modulate the transcriptional induction of the human ATP binding cassette transporter A1 gene by oxysterols and retinoids.</a> Biochemistry. 46, 11473-11483 (2007).</li>
</ol>

このビデオ記事の生産は、近接ライゲーションアッセイの手順で使用される試薬を作るOLINKが後援した。

その場でのタンパク質複合体の可視化は、特に蛋白質の相互作用とタンパク質修飾は、細胞がその表面から核へシグナルを送るために使用することを意味している場所シグナリングにおける研究のために、大きな需要があります。それは前に免疫蛍光を用いたin situ の 2つの内在性タンパク質との間の複合体を可視化し定量化することは不可能であった。抗体の共局在は、低解像度を示し、真の相互作用を可視化するために使用することはできません。 PLAは、研究者は大成功6、7と異なるシステムでの使用を開始した新しい技術です。ここでは、PLAを使用するだけでなく、視覚化するだけでなく、時間をかけてBMPの刺激の下流で活性化Smadであるエフェクターの間に内在性の複合体を定量化する方法を示します。我々は、Neuro2aとこの（図1）を達成するために別の種（マウスA -であるSmad4とウサギaP-Smad1/5/8）で提起された商業抗体に依存していたなどの異なる組織培養細胞を使用していました。このメソッドは、すべてであるSmad4とのアクティブな複合体に従事されていない可能性がありますリン酸化Smad1/5/8の単なる存在ではなく、時間をかけてBMPエフェクター複合体の活性化を参照して、初めての、私達を許可。我々は、信号をカウントし（図1F）と同じセル8（図1G）の免疫から得られる定量化と測定比較した。私たちは、スポットの数は時間をかけて信号レベルの正確な比較測定を提供すると結論した。技術はまた、同様の結果と他の細胞株（HEK293TとCOS7）（データは示さず）に適用されました。 技術の原理は、Duolinkキットで提供されている2つのユニークなプローブに基づいています。各PLAのプローブは、レポーターとして機能するユニークな合成オリゴヌクレオチド、に接続された二次抗体で構成されています。プローブの近接は、これらのプローブが近接して接続されている正確な位置でDNAライゲーションすることができます。 DNAハイブリダイゼーションおよびライゲーションが小さく（&lt;40nmプロセス）、そのためであることができるオリゴヌクレオチド、の距離、相互作用するタンパク質だけがライゲーションを許可することができます。連結したDNAを増幅し、増幅された配列の標識されたオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションによって検出することができる。増幅は、DNA - DNAハイブリダイゼーションの原理に依存するように特有のものであり、連結したDNAは、初期のライゲーションのイベントの強化、その結果いくつかの倍に増幅されるとしても高感度を提供します。増幅されたDNAは、標識されたオリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションによって検出し、目に見えるとかなり大きなスポットを生成しています。スポットをカウントできるように、PLAの信号だけでなく、正確な空間情報（相互作用のイベントの位置）だけでなく、2月4日 、これらのイベントを定量化する客観的な方法を提供します。 タンパク質相互作用の検出のために雇用されている他の技術は共免疫沈降法、immunofluoresenceと蛍光共鳴エネルギー移動（FRET）を含める。共免疫沈降アッセイは、広くタンパク質複合体の分離を可能にするために使用されます。方法は、タンパク質が検出されるために比較的高いレベルで発現されなければならないことを意味する免疫ブロッティングを伴っている。高いバックグラウンドやビーズにいくつかのタンパク質の非特異的結合の問題は時々共免疫沈降法で克服することは困難です。さらに、共免疫沈降アッセイは、タンパク質複合体の一部にすることができますが、互いに物理的に相互作用が非常に近接しているものを区別することができないタンパク質の検出を可能にする。さらに、共同免疫沈降法は、細胞内のタンパク質複合体の局在上の単一のセルの解像度や情報の定量を提供することはできません。 immunofluoresenceでセルまたはセルコンパートメント内のタンパク質複合体の共存の検出は、拡散信号とそのための重複に基づいて、低空間分解能を持ち、タンパク質の相互作用について正確​​な情報を提供することはできません。差は数倍であり、かつ正確またはPLAのスポットとして測定することができない場合にのみ、immunofluoresence信号の定量化は、視覚的に推定することによって行うことができます。 FRETは、生きた細胞内のタンパク質複合体の可視化を可能にし、抗体の必要性とエピトープの露出を克服。しかし、FRETは、通常、PLAのような内因性のタンパク質複合体を反映していない可能性があります人工的な融合タンパク質の過剰発現に依存する。 PLAプロトコルのブロッキング状態は、抗体の凝集が発生するとバックグラウンドを増加させる可能性があるので重要です。代替、ブロッキング条件が抗体の製品シートに記載されています。一次および二次抗体の省略と適切なコントロールが間違っているかもしれないものについての情報を提供し、彼らは常に含める必要があります。彼らは一緒にいるとき、それらを単独で使用され、少なくとも背景と最高のシグナルを与える別の抗体をスクリーニングすることが重要です。セルの固定不十分な固定は、手順のステップ中に、タンパク質複合体の損失につながる可能性があります一方、過固定では、タンパク質複合体が完全に変性し、低下させる可能性があるため、lsは重要です。これを3％に固定液の濃度を低下させることによってまたは固定の時間を制限することによって制御することができます。しかし、固定では一次抗体は変性したタンパク質を認識するかどうかによっても異なります。 PLA法は非常に敏感なので、特別な注意はインキュベーション時間と異なるサンプル間で等しいマイクロ条件を維持するために必要です。 サンプルは、最後のステップの前にどのような場合で乾燥させるままにしないでください。サンプルの乾燥は、増加の背景につながることができます。ブロッキング溶液の完全な除去にも背景を回避するために重要です。低温では酵素反応を遅くするように洗浄バッファーは、常に、使用前に室温に戻してください。さらにトラブルシューティングを行うにはキットのマニュアルを参照してください。 それは、PLAの信号（例えばDAPI、アクチンなど）のサブ細胞内局在を確認するために汚れを使用すると便利です。ここでは、核を染色するためにDAPIを（封入剤で）使用している。 PLAは、細胞型または細胞区画（ここでは図示せず）を決定する抗体で免疫蛍光の使用と互換性があります。正確な定量化は、信号と特定のソフトウェア（Duolinkのイメージツール、Olink Biosience）の使用を数えることにより行うことができます。 結論として、我々は固定された細胞でのBMPシグナル伝達を検出するためにDuolinkキットを使用して、 その場 PLA で使用する方法を実証し、その利点提示している：高感度で使いやすい、、無背景、そしてその場でアクティブなBMPのシグナル伝達を定量化するユニークな能力を。 異なるタンパク質間相互作用を研究するためにこの手法を適用の制限は、調査中のタンパク質を認識する一次抗体の可用性と品質に依存します。

<table><tbody><tr><td>GMEM</td><td>Invitrogen</td><td>21710025</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Invitrogen</td><td>21063029</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>AutogenBioclear</td><td>7.01</td><td></td></tr><tr><td>非必須アミノ酸</td><td>Invitrogen</td><td>11149068</td><td></td></tr><tr><td>ピルビン酸ナトリウム</td><td>Invitrogen</td><td>11360070</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン / ストレプトマイシン</td><td>Invitrogen</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamine</td><td>Invitrogen</td><td>25030-054</td><td></td></tr><tr><td>トリプシン, 0.05% (1X) EDTA 4Na含有, 液体</td><td>Invitrogen</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>16ウェルチャンバースライド</td><td>Lab-Tek</td><td>178599</td><td></td></tr><tr><td>ポリリシン</td><td>VWR international</td><td>631-0107</td><td></td></tr><tr><td>カバーガラス</td><td>VWR international</td><td>631-0138</td><td></td></tr><tr><td>a-pSmad1/5/8</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>9511</td><td></td></tr><tr><td>a-Smad4 (B8)</td><td>Santa Cruz Biotechnology, Inc.</td><td>sc-7966</td><td></td></tr><tr><td>ドルソモルフィン</td><td>Merck &amp;amp; Co., Inc.</td><td>171260-10MG</td><td></td></tr><tr><td>リコンビナントマウスBMP-4</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>5020-BP-010</td><td></td></tr><tr><td>PFA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X 100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Promega Corp.</td><td>H5151</td><td></td></tr><tr><td>&lt;a href=&quot;http://www.olink.webbhuset.com/products_services/duolink_products.php?menu=380">Duolink II 検出試薬 (Orange)&lt;/a&gt;</td><td>Olink Bioscience</td><td>92007-0100</td><td></td></tr><tr><td>&lt;a href=&quot;http://www.olink.webbhuset.com/products_services/duolink_products.php?menu=380">Duolink II PLA プローブ anti-Mouse MINUS&lt;/a&gt;</td><td>Olink Bioscience</td><td>92004-0100</td><td></td></tr><tr><td>&lt;a href=&quot;http://www.olink.webbhuset.com/products_services/duolink_products.php?menu=380">Duolink II PLA プローブ anti-Rabbit PLUS&lt;/a&gt;</td><td>Olink Bioscience</td><td>92002-0100</td><td></td></tr><tr><td>&lt;a href=&quot;http://www.olink.webbhuset.com/products_services/duolink_products.php?menu=380">Duolink II DAPI含有封入剤&lt;/a&gt;</td><td>Olink Bioscience</td><td>82040-0005</td><td></td></tr><tr><td>&lt;a href=&quot;http://www.olink.webbhuset.com/products_services/duolink_products.php?menu=380">Duolink II 洗浄バッファー (蛍光用)&lt;/a&gt;</td><td>Olink Bioscience</td><td>82049</td><td></td></tr></tbody></table>

使用bmp4のエフェクター-錯体のダウンストリームシグナリングの検出その場で pla、近接ライゲーションアッセイ

Detection of Signaling Effector-Complexes Downstream of BMP4 Using in situ PLA, a Proximity Ligation Assay

BMPは、発達と生物学的影響の広範な責任があります。 BMPの受容体が活性化（リン酸化）Smad1/5/8エフェクター、その次に、であるSmad4と複合体を形成し、彼らはBMP特定の下流効果1を開始する転写因子として機能する核内に移行。リン酸化のSmadペプチドに対する抗体を持つ伝統的な免疫蛍光技術は、低感度、高いバックグラウンドを示し、これは蛍光感光性である場合は、特に抗体のシグナルの強度に依存しているとして、総定量化を提供します。さらに、リン酸化されたSmadはすべてであるSmad4との複合体ではない可能性があり、アクティブな転写に従事。 その場で PLAは、高い特異性と感度が2から4と ​​タンパク質の相互作用を検出することができる技術です。タンパク質のDNAサロゲートの増幅と、この新しい技術のカップルの抗体の認識。それは認識イベントの正確な位置を明らかに斑点の形でローカライズされた、離散信号を生成する。信号の数をカウントし、測定を提供することと比較することができます。我々は、これらのシグナリングでのみ発生する、複雑で近接すなわち、内にあるときのみBMPシグナル伝達のエフェクターphospho-Smad1/5/8とSmad4の検出を可能にする抗体の組み合わせで、Duolinkキットを使用して、 その場 PLA の適用活性化。これは、BMP4刺激下のタイムコース実験で高い特異性と感度を持つ内因性BMPシグナル伝達の可視化と計測、初めて許可。

ここでは、骨形成タンパク質（BMP）固定された細胞のシグナル伝達を可視化する抗体の組み合わせで近接ライゲーションアッセイ（PLA）を、使用する方法を示します。このテクニックは、私たちは、内因性BMP活性化エフェクター複合体の核内蓄積を追跡し、BMP4刺激下で時間をかけて自分のレベルを定量することができました。

使用BMP4のエフェクター-錯体のダウンストリームシグナリングの検出その場で PLA、近接ライゲーションアッセイ

BMPは、広範な発生および生物学的効果を担っています。BMP受容体はSmad1/5/8エフェクターを活性化（リン酸化）し、その後...

本実験の全体的な目的は、組織培養細胞におけるBMPシグナリングを可視化し、定量化することである。BMPは細胞表面の受容体に結合し、3つのsmadエフェクターであるsmad one、smad five、およびSMAD eightをリン酸化する。これらはsmad fourと複合体を形成して核内へ移行し、そこで転写を制御する。ここでは、BMP刺激の有無にかかわらず、組織培養細胞内における内在性SMADエフェクターとSmad4との間に形成される複合体を可視化するためにPLAを使用します。まず、3種類のリン酸化SMADエフェクターすべてを認識する一次抗体と、Smad4を認識する一次抗体の2種類を並行して使用します。次に、PLAプローブと呼ばれる二次抗体を添加します。各プローブには固有の短いDNA鎖が付着しており、これらが一次抗体に結合します。PLAプローブ同士が近接している場合、その後2種類のサークル形成DNAオリゴヌクレオチドを添加することで、DNA鎖が相互作用します。これらは酵素的ライゲーションによって結合し、環状構造を形成します。この環状DNAは、増幅反応後にローリングサークル増幅によって増幅されます。標識された相補的オリゴヌクレオチドプローブをハイブリダイゼーションさせることで、各環状DNA産物の増幅に伴う産物蛍光スポットが強調され、容易に視認することができます。蛍光顕微鏡で観察すると、スポットはエフェクター、seds、およびsmad fourの複合体に対応しており、これは細胞内でのBMPシグナリングの活性化を示しています。既存の手法に対するPLAの主な利点は、操作が簡便で感度が高く、バックグラウンドがないことであり、in situで活性化したBMPシグナリングを定量できることです。BMP経路は、いくつかの臓器や組織の発達、および幹細胞の増殖や分化を含むプロセスにとって不可欠です。PLAは、BMPシグナルのダイナミクス、レベル、および細胞内局在に関する重要な疑問を解決するために使用できるだけでなく、診断にも利用可能です。この経路はいくつかの疾患の根底にあるため、BLAを用いてBMPやその他の経路の他の信号伝達成分を研究することができ、組織切片や胚全体への適用も可能です。in situ 近接結紮アッセイを開始するために、細胞培養を準備します。Neuro 2A細胞は、10% FBS、1倍非必須アミノ酸、1倍ピルビン酸、および1倍 L-glutamineを添加したGMEMで培養します。トリプシンを用いて細胞を剥離し、1ウェルあたり15,000〜20,000個の細胞を播種します。16ウェルチャンバースライドを用い、加湿された5% carbon dioxide インキュベーター内で37 °Cで24時間培養します。24時間後。コントロール群については、培地をサプリメント添加済みの無血清GMEMに交換し、さらに2〜3時間インキュベートする。2回目のインキュベーション後、3つのウェルに細胞を通常の培養条件下で保持する。2 µMのdorsamorphineを細胞に添加してBMP経路を阻害するか、あるいはBMP4を10〜60分間添加してシグナル伝達を誘導する。細胞刺激後、ウェルから培地を吸引し、細胞の剥離を防ぐためにPBSで穏やかに洗浄します。PBSを細胞に直接ピペッティングしないでください。その後、PBSを吸引し、ウェル周囲のシリコンは残したままチャンバーを取り除きます。新鮮に調製し、ろ過した4%パラホルムアルデヒドを50 µLウェルに加え、室温で振盪せずに10分間インキュベートする。固定後、コピンジャーを用いて室温で振盪しながら、PBSで5分間細胞を洗浄する。この洗浄操作を繰り返し、計3回洗浄を行う。次に、コピンジャー内でPBSに溶解した0.5%Triton X 100を用いて細胞を透過処理し、室温で10分間、攪拌せずにインキュベートします。その後、0.05%Tween 20含有TBSを用いて、コピンジャー内で攪拌しながら1回5分間の洗浄を3回行います。スライドを軽く叩いて最後の洗浄液を除去し、ブロッキングの手順を開始します。細胞を乾燥させないように注意しながら、各ウェルにDUO linkを1滴加えたブロッキング溶液を添加します。蒸留水をいれた空のピペットチップボックスで構成された、あらかじめ加温した加湿チャンバー内で、細胞をブロッキング溶液中で37°Cで30分間インキュベートします。一次抗体溶液を調製するため、anti phospho smad 1 5 8およびanti SMAD fourをDuoLink 2 Antibody Diluentで1:100に希釈します。各抗体を単独および組み合わせて使用します。次に、スライドを軽く叩いてブロッキング溶液を除去し、適切なウェルに抗体溶液を40 µLずつ加えます。希釈液のみを用いたネガティブコントロールを含めることができます。細胞が乾燥しないよう、この操作は迅速に行ってください。次に、あらかじめ温めておいた加湿チャンバー内で、スライドを37°Cで1時間インキュベートします。インキュベーション中に、2種類のPLAプローブを希釈液で希釈します。各反応用に、各プローブ8 µLと希釈液24 µLを混合し、プローブを溶液中で5倍に希釈します。1時間のインキュベーション後、一次抗体溶液を捨て、カップリングジャーを用いて室温で攪拌しながら、Duo link 洗浄バッファーAでスライドを2回、各5分間洗浄します。洗浄完了後、スライドに残っている洗浄バッファーAを捨て、各スライドにPLAプローブ溶液を40 µL加えます。次に、スライドをあらかじめ加温した加湿チャンバー内で37 °Cでインキュベートします。1時間の間、Duolinkライゲーションストックを扱い、ライゲーションミックスの必要量を調製します。まずDuolinkライゲーションストックをボルテックスし、高純度水で1倍に希釈してください。リガーゼ酵素を本溶液に1/40の割合で添加し、1ウェルあたり40 µLの混合液が必要であることに留意してください。インキュベーション後、スライドからPLAプローブ溶液を拭き取り、洗浄バッファーで2回洗浄します。最後の洗浄時には、カップリングジャーを用いて室温で5分間、攪拌しながら洗浄してください。Duo link Ligaseをフリージングブロックで取り出し、ライゲーション溶液に最終希釈倍率1/40となるように加え、ボルテックスで混合します。次に、スライドから洗浄バッファーAの最終容量を吸い取り、40 µLのリガーゼ反応液を加えます。各スライドを酵素と共に攪拌します。あらかじめ加熱した加湿チャンバー内で、スライドを30分間インキュベートします。37 °CでDUO link増幅ストックを融解し、DUO Link増幅ストックを高純水で1倍に希釈して、インキュベーション中の増幅ステップの準備を行います。試薬は光に敏感であるため、遮光して保存してください。ライゲーションステップが完了したら、溶液を捨て、室温で攪拌しながらカップリングジャーを用いてWash Buffer Aで2分間ずつ2回スライドを洗浄します。最後の洗浄の間に、DUO link polymeraseを増幅溶液に最終希釈倍率1:280になるように加え、ボルテックスします。洗浄バッファーを捨てた後、各ウェルに増幅混合液を40 µL加え、あらかじめ37 °Cに加温した暗所湿潤チャンバー内で100分間インキュベートします。増幅インキュベーションが完了したら、スライドからポリメラーゼ溶液を吸い取り、カップリングジャーを用いて洗浄バッファーBで2回、1回につき10分間洗浄します。試薬は光に敏感であるため、このステップの間はスライドを遮光してください。2回の洗浄後、0.1倍の洗浄バッファーBに浸します。次に、16ウェルスライドからシリコンを完全に除去し、そこに約40 µLのデュオを添加します。カバーガラスに封入剤を滴下し、サンプル上にゆっくりと載せます。カバーガラスの下に気泡が入らないように軽く押し付け、マニキュアを用いてカバーガラスをスライドに固定・密封し、イメージングまで少なくとも15分間放置します。これらは、BMP経路の阻害剤である2 µMのdorsomorphinで処理した細胞、または25 ng/mLのBMP4で60分間処理した細胞の共焦点画像です。活性化Smad複合体を検出するために、Phospho Smad 1 58およびSmad 4に対する抗体を用い、これらは赤色のスポットとして観察される。細胞核はDPIによって青色に染色されている。PLA信号はDUOlink ImageToolソフトウェアでカウントし、細胞あたりの核内の平均スポット数をグラフに示した。いずれかの一次抗体を単独で使用した場合には染色は認められず、PLAプローブによる背景染まりおよびその後のオリゴヌクレオチドのライゲーションは起こっていないことが示されました。同様に、両方の一次抗体を省略した別のネガティブコントロールにおいても、スポットは検出されませんでした。Neuro 2A細胞を用いたSDS-PAGE免疫ブロット法により、未処理およびBMP処理した細胞において、リン酸化に関連するSMAD 1 5 8が検出されました。しかしながら、背側形態でモルヒネ処理した細胞では、phospho smadのレベルが著しく低下しています。PCNAに対する抗体は、ローディングコントロールとして用いています。このビデオを視聴することで、細胞固定後6時間以内に結果を得るために我々が推奨する手順とセットアップについて、十分に理解できるはずです。要約すると、手順は一次抗体インキュベーションのブロッキング、PLAプローブのインキュベーション、ライゲーション増幅、封入およびイメージングです。

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Research

JoVE Journal

Biology

生物学

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このビデオでは、近接ライゲーションアッセイ(PLA)を使用して、ショウジョウバエ神経筋接合部(NMJ)でのタンパク質間相互作用の可視化を示しています。体壁を単離した後、相互作用するタンパク質を一次抗体とPLA標識二次抗体でプローブします。相互作用するタンパク質が近接しているため、コネクターオリゴヌクレオチドによるプローブのライゲーションが促進され、環状DNAが形成され、ローリングサークル増幅によって増幅されます。蛍光プローブは増幅されたDNAに結合し、NMJでのタンパク質間相互作用の可視化を可能にします。...

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小胞体とミトコンドリアの相互作用の研究によって、<em&gt;その場で</em固定された細胞における&gt;近接ライゲーションアッセイ

ここでは、 in situ Proximity Ligation Assay（PLA）を使用して、遺伝毒性ストレスに曝された懸濁細胞培養におけるATMとp53との間の直接タンパク質 - タンパク質相互作用の検出および可視化を実証する。...

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その場で近接結紮アッセイを用いたタンパク質アイソ フォームの Heterodimerization の検出

コグネートJドメインタンパク質はHsp70シャペロンと協力して、タンパク質の折りたたみから分解に至るまで、無数の生物学的プロセスを支援します。ここでは、細菌、酵母およびヒト細胞におけるこれらの一時的に形成されたシャペロン機械のモニタリングを可能にする、その場近近性ライゲーションアッセイについて説明する。...

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近接ライゲーションアッセイを用いた異流体せん断応力条件下でのTGFβ/BMP/SMADシグナル伝達の可視化と定量化

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学ぶBMP4刺激下のエフェクター-錯体形成を可視化する近接ライゲーションアッセイ（PLA）法。固定細胞内のBMPシグナル伝達を定量化し、神経系細胞における動態解析に応用できます。

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