の複合植物の世代ウマゴヤシtruncatula根粒形成のアッセイに使用

こんにちは。Dan Plant Science CenterのOliver Yuです。本日は、アグロバクテリウムを用いてUte Compote植物を作製する方法をご紹介します。この手法は、現在オハイオ州立大学に在籍されているChris Taylor博士によってDan Centerに導入されました。

長年にわたり、私の以前のグループメンバー数名がこれらの手法を改良してきました。そして現在、グループメンバーであるDr. StoneとMaoが、Harry Root Composite Plantsの作製方法を示すためにこのビデオをまとめました。Agrobacterium ZOSは、植物に外来DNAを導入するという点でAgrobacterium tumefaciensと非常に似ていますが、ZOSは野生型組織においてより高い根形成を誘導でき、このような複合植物（composite plants）を形成させることができます。したがって、これらの複合植物では、一部の根は形質転換されていますが、地上部は依然として野生型のままです。

したがって、この技術によって形質転換種子が生成されることはありません。しかし、高根茎植物には、この技術を非常に有用にする3つの大きな利点があります。第一に、多くの植物種、特に双子葉植物は、アグロバクテリウム法によって形質転換が可能です。

第二に、形質転換の前に組織培養を確立させる必要はありません。苗やシュート、根などの植物の多くの部位を用いて、直接的に形質転換植物を作製することが可能です。そして最後に、わずか数週間で形質転換された根組織を得ることができます。

ダイズおよびメディカルカーゴの形質転換において、本手法を用いれば、OPIS形質転換よりも3週間早く形質転換根を得ることができます。全体として、この高効率な根細胞植物技術は、遺伝子機能や根に関連する表現型の研究において非常に有用なツールとなります。こんにちは、Ongと申します。

こんにちは、私の名前は[名前]です。こちらはカメラマンのBillです。本日は、Harry root Composite Plantプロトコルをご紹介します。はい、私たちはこのプロトコルをいくつかのプロジェクトで使用しています。

それでは、開始しましょう。今回のデモンストレーションでは、例としてmeta cargo Tulaを使用します。これらはmeta cargoの成熟したポッドです。

ポッドを研磨箱に入れ、長くしっかりと力を入れて研磨します。軽く振って種子をポッドから分離し、種子を50 mL centrifuge tubeに入れます。その後、5 mLの濃硫酸を加えます。

非常に慎重にスキャニングを行います。これには約10分かかります。チューブを2～3回ボルテックスします。

酸処理を行うと、種皮が黄色に変化します。チューブから硫酸を取り除き、種子を滅菌水で少なくとも5回すすぎます。種子を脱イオン水に浸し、室温で6時間浸漬させた後、4 °Cで2日間保存します。

発芽を同期させるため、20〜30粒の種子をシャーレ内の湿らせたフィルターペーパー上に広げます。5〜6日後、種子を土壌に移植し、温室で4週間栽培します。

複合植物形質転換には、通常アグロバクテリウムZony K 5 99株を使用します。シャトルベクターまたはバイナリーベクターは、標準的なアグロバクテリウム腫瘍誘発形質転換プロトコルに従ってK 5 99に導入できます。アグロバクテリウムを接種し、30 °Cで16～24時間培養します。培養後、培養液を50 mL遠心チューブに移して細胞を回収します。

遠心分離機を用いて5,000 Gで30分間遠心分離します。ペレットを窒素除去栄養液で再懸濁します。アグロバクテリウム細胞をOD 600で0.3になるように希釈してください。

この濃度は、形質転換効率を最大化するために重要です。支持マトリックスとしてロックウォールを使用します。高頻度の形質転換を実現するには、この材料の使用が重要となります。

岩壁を適切なサイズにカットします。プラグを作成し、上部に直径約1.5～2 cmの穴を開けます。ピペットチップを用いて、各プラグに5 mLのResuspended Agrobacterium Zony溶液を加えます。

側芽が2〜3個ある茎の節を選択し、斜めに切断します。植物の切断片を岩壁の穴に挿入します。切断した植物を生育チャンバーまたはラボベンチに3週間置きます。

10日ごとに各プラグに5 mLの栄養液を加えます。3週間後、切断側から根が再生します。植物を水に浸してください。

軟化した岩壁を慎重に取り除き、根を傷つけないようにしてください。岩壁を完全に除去してください。根毛複合植物を砂またはパーライトに移植することができます。共生実験を行う場合は、根粒菌を酵母エキスマニト培地で30°Cで7日間培養してください。

zoia細胞を回収し、再懸濁します。ペレットを窒素不含栄養液で懸濁させます。この溶液をOD 600で0.08まで希釈します。

各複合植物培養にZOA溶液を10 milliliters加え、根粒を形成させるため、さらに2〜3週間植物を育成します。複合植物を根こそぎ抜き取り、洗浄して砂を除去します。緑色蛍光タンパク質の発現を用いて、形質転換根を確認します。

これには蛍光顕微鏡を使用します。当研究室のすべての根毛構築物には、形質転換系統をスクリーニングするための構成的GFPカセットが含まれています。この写真は、蛍光顕微鏡で観察したGFP形質転換根毛複合植物を示しています。

より明るい緑色蛍光を示す形質転換根は、非形質転換根と容易に区別できます。複合植物のhairy rootには根粒が形成されます。以下に完全なプロトコルを記します。

繰り返しになりますが、毛根複合植物の作製は、特に二倍体種において、大量の形質転換組織を迅速かつ容易に得ることができる手法です。この方法では形質転換種子を得ることはできませんが、わずか数週間で形質転換材料を産生することが可能です。特に、組織培養の確立や形質転換が困難な植物に適しています。

長年にわたり、我々はこの技術を用いて、遺伝子機能、プロモーター機能、microRNA、根および側根の発達、防御および抗生物質ストレス応答、根粒形成およびその他の共生プロセスを研究してきました。また、高次根複合植物を用いて、ホルモン応答、メタボローム解析、遺伝子プロファイリング、およびプロテオーム解析を行いました。本ビデオが、皆様のお好みの種にこのシステムを適応させる際の手助けとなることを願っております。

本技術に関するご質問がございましたら、お気軽にお問い合わせください。ご健闘をお祈りいたします。