の複合植物の世代ウマゴヤシtruncatula根粒形成のアッセイに使用

こんにちは。Dan Plant Science CenterのOliver Yuです。本日は、Agrobacterium Ognを用いたUte Compote植物の作製方法について解説します。この手法は、現在はオハイオ州立大学に在籍しているDr. Chris TaylorによってDan Centerに導入されました。

私の以前のグループメンバー数名が長年にわたりこれらの手法を改良し、現在はグループメンバーであるDr.StoneとMaoが、Harry Root Composite Plantsをどのように作製するかを示すためにこのビデオをまとめました。Agrobacterium ZOSは、外来DNAを植物に導入するという点でAgrobacterium tumefaciensと非常に似ていますが、ZOSは野生型組織のより高い根形成を誘導し、このような複合植物を形成させることができます。そのため、これらの複合植物では、一部の根は形質転換されており、地上部は依然として野生型のままとなります。

したがって、この技術によって形質転換種子が生成されることはありません。しかしながら、高根圏密度を持つ植物には、この技術を非常に有用にする3つの大きな利点があります。第一に、多くの植物種、特に双子葉植物がアグロバクテリウム法によって形質転換可能です。

第二に、形質転換の前に組織培養を確立させる必要がありません。実生やシュート、根など、植物の多くの部位を用いて直接的に形質転換植物を作製することが可能です。そして最後に、わずか数週間で形質転換された根組織を得ることができます。

ダイズおよびメディカルカーゴの形質転換において、本手法を用いることで、OPIS形質転換よりも3週間早く形質転換根を得ることが可能です。総じて、この高効率な根細胞植物技術は、遺伝子機能および根に関連する表現型の研究において非常に有用なツールとなります。こんにちは、Ongです。

こんにちは、私の名前は（名前）です。こちらはカメラマンのビルです。今日は、ハゲロウ（Harry root）の複合植物プロトコルについてご紹介します。はい、私たちはこのプロトコルをいくつかのプロジェクトで使用しています。

それでは、開始します。デモンストレーションでは、例としてmeta cargo Tulaを使用します。これらはmeta cargoの成熟したポッドです。

莢を研磨ボックスに入れ、強く長い動作で研磨します。軽く振って種子を莢から分離し、種子を50 milliliterの遠心管に入れます。次に、5 milliliterの濃硫酸を加えます。

非常に慎重にスキャニングを行います。約10分かかります。チューブを2〜3回ボルテックスします。

酸処理中、種皮は黄色に変化します。チューブから硫酸を取り除き、滅菌水で種子を少なくとも5回洗浄してください。種子を脱イオン水に浸し、室温で6時間浸漬させた後、4 °Cで2日間保存します。

発芽を同期させるため、20〜30粒の種子をペトリ皿の中の湿らせたフィルターペーパー上に広げます。5〜6日後、種子を土壌に移植し、温室で4週間育成します。

複合植物形質転換には、通常アグロバクテリウムZony K 5 99株を使用します。シャトルベクターまたはバイナリーベクターは、標準的なアグロバクテリウム腫瘍誘導性形質転換プロトコルに従ってK 5 99に導入できます。アグロバクテリウムを接種し、30 °Cで16〜24時間培養します。培養後、培養液を50 mL遠心チューブに移して細胞を回収します。

遠心分離機を用いて 5,000 G で 30 分間遠心分離します。ペレットを窒素欠乏 nutrient solution で再懸濁します。アグロバクテリウム細胞を OD 600 で 0.3 まで希釈してください。

この濃度は、形質転換を最大化させるために重要です。支持マトリックスとしてロックウォールを使用します。高頻度の形質転換を実現するには、この材料の使用が不可欠です。

岩壁を適切なサイズに切り出し、プラグを作成します。上部に直径約1.5〜2 cmの穴を開けます。ピペットチップを用いて、各プラグに5 mLの再懸濁したAgrobacterium Zony溶液を加えます。

2〜3個の側芽がある茎のセクションを選択し、斜めにカットします。植物のセクションをロックウォールの穴に挿入します。カットした植物を、成長チャンバーまたはラボベンチに3週間置きます。

10日ごとに各プラグに5 mLの栄養液を加えます。3週間後、切断側から根が再生されます。その後、植物を水に浸します。

軟化した岩壁を慎重に除去し、根を傷つけないようにしてください。岩壁はすべて完全に取り除いてください。 hairy root複合植物は、砂またはパーライトに移植可能です。共生実験を行う場合は、酵母エキスマンニト培地を用いて、30 °Cで7日間リゾビウムを培養してください。

zoia細胞を回収し、再懸濁する。ペレットを窒素除去栄養液で懸濁させる。溶液をOD 600で0.08まで希釈する。

各複合植物培養にZOA溶液を10 milliliters加え、根粒が形成されるまでさらに2〜3週間植物を栽培します。複合植物を抜根し、洗浄して砂を除去します。緑色蛍光タンパク質の発現を用いて、形質転換根を確認します。

これには蛍光顕微鏡を使用します。当研究室のすべての毛状根構築物には、形質転換系統をスクリーニングするための構成的GFPカセットが組み込まれています。この写真は、蛍光顕微鏡で観察されたGFP形質転換毛状根複合植物を示しています。

より明るい緑色蛍光を発する形質転換根は、非形質転換根と容易に区別できます。複合植物の hairy root には根粒が形成されます。以下に完全なプロトコルを示します。

繰り返しになりますが、毛状根複合植物の作製は、特に双子葉植物種において、大量の形質転換組織を迅速かつ容易に得るための有効な手法です。この方法では形質転換種子を得ることはできませんが、わずか数週間で形質転換体を産生することが可能です。特に、組織培養や形質転換の確立が困難な植物に適しています。

長年にわたり、私たちはこの技術を用いて、遺伝子機能、プロモーター機能、microRNA、根および側根の発達、防御および抗生物質ストレス応答、根粒形成およびその他の共生プロセスの研究を行ってきました。また、高次根複合植物を用いて、ホルモン応答、メタボリックプロファイリング、遺伝子プロファイリング、およびプロテオーム解析を研究しました。このビデオが、皆様のお好みの種にこのシステムを適応させる際の手助けとなれば幸いです。

本技術に関するご質問がございましたら、お気軽にお問い合わせください。ご健闘をお祈りいたします。