単一細胞のトランスクリプトーム解析

この手順の全体的な目的は、トランスクリプトーム解析のために単一細胞からサンプルを調製することです。まず、単離に適した細胞を特定することでこれを達成します。次に、単離対象の細胞の隣にマイクロピペットを配置します。

次に、細胞がマイクロピペットのチップ内に吸い込まれるまで、シリンジで吸引します。手順の最後の手順は、マイクロピペットのチップを回収チューブ内で破断し、マイクロピペットに残っている内容物をチューブ内に排出することです。最終的に、本プロトコルでも説明されているarna増幅法を用いて増幅した材料のマイクロアレイ解析や、PCR、次世代シーケンシングなどの他のアプリケーションを通じて、細胞間のmRNA集団の違いを示す結果を得ることができます。

この手法は、単一細胞間の洞察や差異を明らかにできるだけでなく、樹状突起や特定の種類の樹状突起などの細胞内コンパートメントにも適用でき、樹状突起の機能に関する重要な情報を提供できます。本手順のデモンストレーションを行うのは、私の研究室のポストドクであるJennifer Singhです。このプロトコルの開始前に、ラットの胎生18日目（embryonic day 18）の海馬から採取した初代ニューロンを、35 mmディッシュ内の12 mmカバースリップ上に播種し、書面によるプロトコルに従って維持しました。回収用のピペットを準備するには、マイクロピペットプラーを用いて、オートクレーブ済みのガラスピペットを電気生理学に適した直径まで引き伸ばしてください。

メーカーのプリセットプログラムを使用するため、チップは細胞回収前に切断されるため、ボアサイズは重要ではありません。細胞回収の準備が整った際にチップが破損していないよう、マイクロピペット保管容器などのホコリのない環境にピペットを注意深く保管してください。回収した試料を保存するため、1.7 mLのエプンドーチューブに必要な数だけ用意し、2 µLのPBSを加えておきます。

組織培養フード内で、インキュベーターからカバーガラスが入った35 mmディッシュを1つ取り出します。このディッシュからカバーガラス1枚を、HBSSを入れた新しい35 mmディッシュの蓋の上に素早く移動させます。細胞の状態が悪くなるため、操作していないカバーガラスは速やかにインキュベーターに戻すことが極めて重要です。

長期間放置しないでください。細胞の回収には、マイクロマニピュレーターを備えた40倍対物レンズ付きの倒立光顕微鏡が必要です。ピペットホルダーには柔軟なチューブを取り付け、回収中のピペットの不要な動きを防ぐため、チューブを安定した面に固定して使用してください。

チューブの端にニードルを挿入し、ルアーロック接続の1 mLシリンジを取り付け、ユーザー間で交換できるようにします。マイクロピペットの準備として、片手の指でキムワイプをピンと張り、ピペットのチップを紙の上で1〜2回非常にゆっくりと撫でることで、コントロールされた方法でチップ先端を破損させます。開口部は、標的細胞サイズの約75〜100%にする必要があります。

マイクロピペットをマイクロピペットホルダーに固定し、マイクロピペットホルダーをマイクロマニピュレーターのインサートに取り付けます。最後に、40倍の対物レンズを設定します。ディッシュを顕微鏡ステージに置き、回収に適した細胞領域を探します。

初代ニューロン培養の場合、細胞は周囲の細胞から比較的孤立している必要があります。周囲の細胞や突起の採取を防ぐため、採取対象の細胞を視野の中心に配置してください。マイクロマニピュレーターを使用して、マイクロピペットをディッシュ内の溶液中、光学経路へと進めます。

ピペットチップを溶液の中に浸します。接眼レンズを通して観察すると、視野内にピペットが影として現れます。ここから、細胞の平面より十分上の位置でシリンジを軽く吹くことで、陽圧をかけます。

ピペットチップが視野に入るまで位置を調整し、粗動ミクロメータを用いてピペットチップに焦点を合わせます。この時点で、ピペットの内径が大きすぎないか、または小さすぎないかを確認してください。内径が不適切な場合は、回収領域でのピペットの破損を防ぐため、適切な内径のマイクロピペットが見つかるまで別のものに交換してください。

マイクロマニピュレーターを用いてピペットチップを細胞に近づける前に、コースフォーカスを使用して焦点面を移動させます。細胞が近づいたら、細胞とピペットチップの両方にピントが合うまで微動フォーカスを使用します。細胞をカバーガラスから吹き飛ばさないように、標的細胞に到達する前に正圧の印加を停止してください。

マイクロマニピュレーターを用いてピペットチップを配置し、回収する細胞体（soma）に接触させます。シリンジを使用し、細胞がピペットチップ内に入るまで口で緩やかに吸引します。細胞がピペットに入らない場合は、チップをゆっくりと細胞に近づけ、カバーガラスから浮き上がるまで下方に動かしてください。

マイクロマニピュレーターを使用して、ピペットを直ちに上に動かし、溶液から出します。ホルダーからピペットを取り出します。準備した1.7 milliliterのエッペンドルフチューブを片手に持ち、チューブの底部側でピペットの先端を慎重に折ります。

折れたチップの先端がチューブの中央に来るようにし、0.1 milliliterの目盛りを狙って、1 milliliterシリンジに取り付けた針をピペットの上部開口部から挿入します。プランジャーを急速に押し下げ、ピペット内の溶液をチューブ内に噴射させます。このとき、チップがチューブ壁面の液体に触れないように注意してください。

毛細管現象によって液体がピペット内に戻るため、細胞はピペットの最先端にとどまり、これにより細胞を適切に排出することが可能になります。卓上マイクロ遠心分離機を用いてチューブの内容物を速やかにスピンダウンさせ、ドライアイスで凍結するか、あるいは氷上に置いて、以降の処理やPCR、次世代シーケンシングなどの他のアプリケーションに使用してください。ここでは、単離されたニューロンの回収に成功した例を示しています。

まず、細胞密度の比較的低い領域を選択しました。次に、目的の細胞に向かってピペットチップを進めました。ここでは、細胞を回収した後の視野を示しています。

周囲のプロセスはカバーガラス上に残ることに留意してください。対照的に、この図はピペットチップの2つの画像を示していますが、これらは効果的な回収に適したサイズではありません。こちらのチップでは回収が不完全になり、こちらに示されているチップでは周囲の環境まで回収されてしまいます。

回収およびRNA増幅後、バイオアナライザーを用いて増幅RNAの分布と量を検討することが推奨されます。単一細胞材料からの増幅が成功すると、総量は数µg程度となり、分布はなだらかで幅広くなります。この手法に習熟すれば、適切に実施することで数分で完了させることができます。本手順を遂行する際は、RNAフリーの手法を用いることが重要です。