単一細胞のトランスクリプトーム解析
April 25th, 2011
この記事では、ラット初代ニューロン培養とaRNAの増幅を使用して、その後のトランスクリプトーム解析から単一細胞の収穫のための簡単な方法を説明します。このアプローチは、任意の細胞型への一般化です。
この手順の全体的な目標は、トランスクリプトーム解析のために単一細胞からサンプルを調製することです。これは、まず単離に適した細胞を見つけることによって達成されます。次に、マイクロピペットを単離する細胞の隣に配置します。
次に、細胞がマイクロピペットの先端に引き込まれるまで、シリンジに吸引を加えます。手順の最後のステップは、マイクロピペットの先端を収集チューブに割って入り、マイクロピペットの残りの内容物をチューブに排出することです。最終的には、プロトコルに記載されているアルナ増幅法を使用して増幅された材料のマイクロアレイ分析を通じて、またはPCRや次世代シーケンシングなどの他のアプリケーションについても説明することにより、細胞間のmRNA集団の違いを示す結果を得ることができます。
この方法は、洞察と単一細胞間の違いを提供することができますが、樹状突起や樹状突起のクラスなどの細胞内コンパートメントにも適用でき、樹状突起の機能に重要な情報を提供します。この手順を実証するのは、私の研究室のポスドクであるJennifer Singhです このプロトコルの開始前に、胚の18日目の初代ニューロンであるラットのカバカンピを35ミリメートルの皿の12ミリメートルカバースリップにメッキし、書面によるプロトコルに記載されているように維持しました。収穫用のピペットを準備するには、マイクロピペットプーラーを使用して、オートクレーブガラスピペットを電気生理学に適した直径に引っ張ります。
メーカーのプリセットプログラムを使用すると、セル収集前に先端が壊れるため、ボアサイズは重要ではありません。ピペットは、マイクロピペット保存ジャーなどのほこりのない環境で慎重に保管し、細胞を採取する準備ができたときに先端が無傷のままになります。収穫した材料を保管するために、2マイクロリットルのPBSを追加して、必要な数の1.7ミリリットルのエイノアチューブを準備します。
35mm皿のカバースリップを組織培養フード内のインキュベーターから取り出します。このディッシュのカバースリップ1枚を、HBSSが入った新しい35mmディッシュの蓋にすばやく移します。操作されていないカバースリップは、細胞が不健康になったため、インキュベーターに戻すことが重要です。
長期間放置した場合。細胞採取には、マイクロマニピュレーターが取り付けられた40倍対物レンズを備えた倒立型光学顕微鏡が必要です。ホルダーから離れる方向に伸びるフレキシブルチューブ付きのピペットホルダーを使用し、チューブを安定した表面に固定して、収集中のピペットの不要な動きを防ぎます。
チューブの端に針を差し込むと、ルアーロック接続の1ミリリットルシリンジをユーザー間で取り付けて交換できます。片方の手の指の間にキムワイプをぴんと張った状態で持ち、ピペットの先端を紙の上を1〜2回非常に優しくブラッシングすることにより、制御された方法で先端を壊してマイクロピペットを準備します。開口部は、ターゲットセルサイズの約75〜100%である必要があります。
マイクロピペットをマイクロピペットホルダーに固定し、マイクロピペットホルダーをマイクロマニピュレーターのインサートに取り付けます。最後に、40 x 対物レンズを設定します。皿を顕微鏡ステージに置き、収穫に適した細胞の領域を見つけます。
初代ニューロン培養の場合、細胞は隣接する細胞から比較的分離されている必要があります。周囲の細胞やプロセスの採取を防ぐために、採取する細胞を視野の中央に配置します。マイクロマニピュレーターを使用して、マイクロピペットをディッシュ内の溶液に向かって光路に進めます。
ピペットチップを溶液に下げます。接眼レンズを通して見ると、ピペットは視野に影として見えるはずです。この点から、細胞面のかなり上にあるシリンジに軽く息を吹き込むことにより、陽圧を加えます。
ピペットチップの位置を視野内に収まるまで調整し、コースフォーカシングノブを使用してピペットチップに焦点を合わせます。この時点で、ピペットのボアサイズが大きすぎるか小さすぎるかを評価します。ボアサイズが正しくない場合は、正しいボアサイズが見つかるまで別のマイクロピペットと交換して、収集領域でのピペットの破損を防ぎます。
コースフォーカスを使用して焦点面を進めてから、マイクロメートルマニピュレータを使用してピペットチップを細胞に向かって進めます。細胞が近づくにつれて、細胞とピペットチップの両方に焦点が合うまでファインフォーカスを使用します。原告の細胞がカバースリップから吹き飛ばされないように、原告の細胞に到達する前に陽圧の適用を停止します。
マイクロマニピュレーターでピペットチップを位置決めし、採取する細胞体に接触するようにします。シリンジを使用して、細胞がピペットの先端に入るまで口から穏やかに吸引します。細胞がピペットに入らない場合は、先端を細胞にゆっくりと近づけ、カバースリップから持ち上がるまで下向きに動かします。
マイクロマニピュレーターを使用して、ピペットをすぐに上に動かし、溶液から取り出します。ピペットをホルダーから取り外します。用意した1.7ミリリットルのアイノアチューブを片手で持ち、チューブの側面にあるピペットの先端を底に向かってそっと折ります。
折れた先端がチューブの内側の中央に0.1ミリリットルのマークを狙い、1ミリリットルのシリンジに取り付けた針をピペットの上部開口部に差し込む。プランジャーを急速に押し下げ、ピペット内の溶液をチューブ内に噴霧します。チューブの側面にある液体に先端が触れないように注意してください。
毛細管現象により液体がピペットに戻るため、細胞はピペットの先端に留まり、細胞を適切に排出するのに十分であるべきです。デスクトップマイクロフュージを使用してチューブの内容物をすばやくスピンダウンし、ドライアイスで凍結するか、氷の上に置いてさらに処理したり、PCRや次世代シーケンシングなどの他のアプリケーションのために使用したりできます。ここに示されているのは、単離されたニューロンの成功した収穫の例です。
まず、比較的密度の低い細胞領域を選択しました。次いで、ピペットチップを所望のセルに向かって前進させた。ここでは、セルが採取された後の視野が示されています。
周囲のプロセスはカバースリップに残っていることに注意してください。逆に、この図はピペットチップの2つの画像を示していますが、これらは効果的な収穫には不適切なサイズです。このチップは不完全な収穫につながりますが、ここに示されているチップは周囲の環境の収穫につながります。
収穫後、およびA RNA増幅分析後、増幅されたRNAの分布と量を調べるために、バイオアナライザーを使用することをお勧めします。シングルセル材料からの増幅が成功すると、低マイクログラムで総量が得られ、滑らかで広い分布が得られます 一度習得すると、この手順を実行しながら適切に実行すれば、この技術は数分で完了することができます、それはRNAフリー技術を使用することが重要です。
概要
この記事では、ラットの一次神経細胞培養から単一細胞を収集し、aRNA増幅を使用したトランスクリプトーム分析を行う方法を紹介しています。この技術は様々な細胞タイプに適応可能で、単一細胞レベルでの遺伝子発現の詳細な研究を可能にします。
主要な研究構成要素
科学の分野
- 神経科学
- 細胞生物学
- トランスクリプトーム学
背景
- 単一細胞分析は細胞の多様性に関する洞察を提供します。
- 遺伝子発現の違いを理解することは神経科学研究にとって重要です。
- 一次神経細胞培養は神経機能の研究に不可欠です。
- 収集技術は正確なトランスクリプトーム分析にとって重要です。
研究の目的
- 単一の神経細胞を分離する信頼性の高い方法を開発すること。
- 個々の細胞のトランスクリプトーム分析を容易にすること。
- 神経細胞における遺伝子発現の変動性を理解を深めること。
使用された方法
- マイクロピペット技術を用いた単一細胞の分離。
- トランスクリプトーム分析のためのaRNA増幅の適用。
- 細胞の可視化のための倒立型光学顕微鏡の使用。
- 精密なピペット位置決めのためのマイクロマニピュレーター。
主要な結果
- 一次培養からの単一神経細胞の成功した分離。
- 分離された細胞間のmRNA集団の違いの証明。
- PCRと次世代シーケンシングへの潜在的な応用。
- 標的収集を通じた樹状突起機能への洞察。
結論
- この方法により、単一細胞レベルでの詳細なトランスクリプトーム分析が可能になります。
- 神経細胞を超えて様々な細胞タイプに適応可能です。
- このアプローチは神経組織における細胞の多様性についての理解を深めます。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Single-cell transcriptome analysis enables biopharma teams to resolve cellular heterogeneity and uncover gene expression differences that are masked in bulk tissue assays. This capability is critical for target validation, mechanistic de-risking, and prioritizing disease-relevant cell populations in early discovery. Integrating robust single-cell workflows strengthens predictive confidence and informs portfolio triage decisions.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of gene expression at the resolution of individual cells, clarifying pathway activity and target engagement.
- Supports biological de-risking by distinguishing molecular signatures between cell types and subcellular compartments.
- Improves predictive confidence for target selection by revealing heterogeneity within disease-relevant tissues.
Screening & Assay Development
- Facilitates preparation of validated single-cell samples for downstream transcriptomic assays.
- Enables reproducible isolation and amplification of RNA from individual cells, supporting quantitative assay development.
- Provides scalable input material for microarray, PCR, or next-generation sequencing platforms.
Translational & Preclinical Research
- Aligns molecular profiling with disease-relevant neuronal subtypes or compartments, supporting translational biomarker discovery.
- Maintains continuity from early discovery through preclinical validation by enabling single-cell resolution analyses.
- Reduces risk of advancing non-representative targets by confirming expression in relevant cell populations.
Pipeline & Workflow Integration
This single-cell isolation and aRNA amplification workflow bridges early discovery and preclinical research, providing high-resolution transcriptomic data for target validation and lead identification.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by enabling gene expression analysis at the single-cell level.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative RNA outputs suitable for downstream high-throughput assays.
- Analytics: Generates amplified RNA for microarray or sequencing, enabling robust comparison of gene expression across conditions.
- Translational Research: Connects molecular findings to disease-relevant neuronal subtypes or compartments.
- Enterprise Reuse: Provides a standardized, adaptable workflow for diverse cell types and experimental models.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Standardizes single-cell isolation and amplification, improving reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions and reduces late-stage biological risk.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of targets with validated cellular relevance.
Implementation Considerations
- Requires expertise in single-cell handling and RNA-free technique to prevent contamination.
- Needs access to micro-manipulation instrumentation and analytical platforms for RNA quantification and analysis.
- Demands cross-team standardization of isolation and amplification protocols for reproducibility.
- Adaptable to various cell types and subcellular compartments with protocol modifications.
- Sample integrity and RNA yield are sensitive to handling and timing, requiring careful workflow management.
