Name: 単一細胞のトランスクリプトーム解析 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-04-25T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 27 s
Description: 学ぶ ラット初代神経細胞培養から単一細胞を採取し、aRNA増幅を用いたトランスクリプトーム解析を行う方法。マイクロピペット技術と倒立顕微鏡を使用し、個々の細胞の遺伝子発現変動を詳細に研究できます。

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この文書に含まれている映像のために細胞培養を提供するための博士テリーSchochetに、細胞培養をめっきし、維持するためにケビン宮代に感謝。さらに、aRNAの手順で入力するためのケビン宮代、ピーターバックリー、およびティーナPertizにありがとう。この作業のための資金は国立老化研究所、精神保健及びペンシルベニア州の連邦からの人事ファクトファインダーファンドの国立研究所からだった。

<ol><li>Davis, J. E., Eberwine, J. H., Hinkle, D. A., Marciano, P. G., Meaney, D. F., McIntonsh, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methodological+considerations+regarding+single-cell+gene+expression+profiling+for+brain+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Neurochemical+Research%22%5BJournal%5D)">Methodological considerations regarding single-cell gene expression profiling for brain injury.</a> Neurochemical Research. 29, 1113-1121 (2004).</li>
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<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22MinElute+Handbook+For+MinElute+Reaction+Cleanup+Kit%22">MinElute Handbook For MinElute Reaction Cleanup Kit</a>. , Qiagen. 28-29 (2004).</li>
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<li>Miyashiro, K., Dichter, M., Eberwine, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+nature+and+differential+distribution+of+mRNAs+in+hippocampal+neuritis%3A+Implications+for+neuronal+functioning%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">On the nature and differential distribution of mRNAs in hippocampal neuritis: Implications for neuronal functioning.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 91, 10800-10804 (1994).</li>
<li>Sul, J., Wo, C. K., Zeng, F., Jochems, J., Lee, M. T., Kim, T. K., Peritz, T., Buckley, P., Cappelleri, D. J., Maronski, M., Kim, M., Kumar, V., Meaney, D., Kim, J., Eberwine, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+transfer+produces+a+predictable+cellular+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Transcriptional transfer produces a predictable cellular phenotype.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 106, 7624-7629 (2009).</li>
<li>Sow, F. B., Gallup, J. M., Sacco, R. E., Ackerman, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+capture+microdissection+revisited+as+a+tool+for+transcriptomic+analysis%3A+Application+of+an+excel-based+qPCR+preparation+software+%28PREXCEL-Q%29%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Biomed.+Sci%22%5BJournal%5D)">Laser capture microdissection revisited as a tool for transcriptomic analysis: Application of an excel-based qPCR preparation software (PREXCEL-Q).</a> Int. J. Biomed. Sci. 5, (2010).</li>
<li>Vandewoestyne, M., Deforce, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+capture+microdissection+in+forensic+research%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Legal+Med%22%5BJournal%5D)">Laser capture microdissection in forensic research: a review.</a> Int J Legal Med. 124, (2010).</li>
<li>Eberwine, J., Bartfai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+cell+transcriptomics+of+hypothalamic+warm+sensitive+neurons+that+control+core+body+temperature+and+fever+response+Signaling+asymmetry+and+an+extension+of+chemical+neuroanatomy%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacol.+Ther%22%5BJournal%5D)">Single cell transcriptomics of hypothalamic warm sensitive neurons that control core body temperature and fever response Signaling asymmetry and an extension of chemical neuroanatomy.</a> Pharmacol. Ther. , (2010).</li>
</ol>

博士はEberwineは博士Eberwineが、株主であるLBS技術にライセンスされているaRNAの特許の発明者です。

注意事項とトラブルシューティング<ul><li>あなたは前と後に標的細胞が単離されたことを示す画像と、残りの半影はそのまま残されたものになるとよいでしょう。 </li><li>あなたが収穫されるためあまり解決策は、ピペットを入力している場合は、3ウェイルアーロックフィッティングとチューブに正圧を保持するシリンジ用プランジャーを使用することができます。任意のボリュームは、処理の種類によって異なりますが、最大5μlのは、ほとんどのアプリケーションで問題ないはずです。 </li></ul>分子生物学的手法の一般的なヒント<ul><li>渦すべての株式のチューブを、反応に添加する前に、それらをスピンダウン。 NEVER渦酵素。 </li><li>徹底的にバッファが適切な濃度であることを保証するために酵素を加える前に反応を混ぜる。 </li><li>可能であればstratacoolerを使用して-20℃で酵素の在庫を保管してください。そうでない場合は、、右使用前に取り外して氷上に保持し、-20℃にすぐに戻ります</li><li>常にピペッティングエラーを減らすために複数の反応を準備する時、マスターミックスのこと。サンプル数に基づいて必要な量を計算すると10-20％を追加。 </li><li>店舗RNA -80 ° Cを遅らせる劣化へ。 RNAは酸性条件下で発生するRNAのa​​purinationを遅らせるためにバッファに格納されている最も安定しています。 </li></ul> aRNAの手順の一般的な概要図4Aは、aRNAの手順の最初のラウンドを示しています。第一鎖の反応では、T7 - oligo（dT）プライマーのポリ- T部分は、ポリA尾部に結合することによってmRNA種（長い白い長方形）のために選択されます。いくつかのマイクロRNAは、ポリアデニル化されると、このプロシージャによって取得されます。さらに重要なことは、しかし、細胞の中で最も豊富なRNAは、リボソームRNAは、しません。このオリゴは、テンプレートとしてmRNAを用いたcDNA（長い灰色の長方形）の相補鎖を合成する逆転写酵素のためのプライマーとして機能します。 T7 -オリゴ（dT）プライマーのT7の部分は、開始mRNAに配列をアンチセンスでフレーム内のT7 RNAポリメラーゼプロモーターが組み込まれています。これは、in vitroでの転写反応の後半で使用されています。 次に、前の手順で作成した発現/ DNAハイブリッド中のmRNAは、ラギング鎖のDNA合成で作成された岡崎フラグメントと同様のRNA&quot;プライマー&quot;を（小さな白い長方形）を作成RNアーゼHによって部分的に加水分解される。 DNAポリメラーゼは、私がテンプレートとしてmRNAに相補的なDNAを使用してプライムDNA合成にRNA断片を使用しています。それは次のRNA断片に到達すると、その5&#39;から3&#39;ヌクレアーゼ活性は、リボヌクレオチドを​​除去し、デオキシリボヌクレオチドに置き換えます。 DNAリガーゼは、リーディング鎖の交換が​​完了していない任意の鎖を連結するために追加されます。 RNA断片は、DNAポリメラーゼIが作成するための最初のプライマーとして役立ったところ、T4 DNAポリメラーゼは、エリアを埋めるために追加されて平滑末端に二重次にIVT反応を実行する前に精製される二本鎖cDNAを。 IVT反応では、T7 RNAポリメラーゼは、鋳型としてセンス鎖を使って二重鎖cDNAと合成するアンチセンスRNA分子（長い黒い長方形）に組み込まれたT7プロモータに結合する。これは、アンチセンスRNA分子の数千が各二本鎖cDNA分子（図4A）から生成される増幅のステップとして機能します。 図4Bに示すように第二ラウンドは、、出発RNAはアンチセンス（黒く塗りつぶした矩形）であるとT7 -オリゴの標的にされたポリアデニル化した尾部を欠いているので、最初のラウンドのそれとは若干異なる逆転写反応から始まり、最初のラウンドで（dT）プライマー。したがって、この反応は、ランダムプライマー（小さなグレーの長方形）と続いて変性RNAを発揮する。第二鎖の反応は、前述の逆転写反応で作成したセンスRNAの3&#39;末端にポリA配列に結合するT7 -オリゴ（dT）プライマーでプライミングされています。別のIVT反応は、最初のラウンドと同様に実行されます。この第二ラウンドは、通常、単一の細胞から増幅3回を達成するには、少なくとも一回繰り返されます。 アプリケーション我々はこの記事で紹介されていることの技術は多数のアプリケーションに変換することができます。単一細胞の単離のプロトコールは、急性スライスで使用するために変更することができます。14技術的に困難なものの、同じ原則が、この代替の準備に適用されます。ピペットのサイズが若干調整されている場合はさらに、細胞の生理機能の録音は、収穫が生理的な出力の背後にある分子メカニズムの十分に制御された調査を許可する前に行うことができます。別の若干の修正は15が 、このアプリケーションでは。細胞体からプロセスを分離することになってピペットで細胞体を収集し、新鮮なピペットで戻って、100から300に識別dendritを収集するESまたはコレクションチューブあたり軸索。。16 一度細胞が収穫されて、mRNAの存在量と組成の比較は、同一の細胞集団内でも異なるとの間で行うことができます。第三ラウンドにビオチン- UTPを組み込んだaRNAのは、これらの相対的なmRNAの存在量を決定するためにマイクロアレイ解析が可能になります。オリジナルのmRNAの人口の組成物はまた、次世代シーケンシングを使用してaRNAの手順の後に決定することができます。増幅されたaRNAを、前者のように後者の細胞型の表現型の変化を誘導するために、ひとつの細胞型からのmRNAの完全なセットが異なる細胞型にトランスフェクトされた細胞の表現型の変換の研究を確認するためにも使用できます。手順ラボが開発し、TIPeRとして知られている。17これらの研究は、病気の状態や細胞の表現型とそのような研究を研究するために特に有用であるが、ラボで現在進行中です。 RT - PCRや定量PCRは、細胞特異的遺伝子の発現を確認するために増幅された材料で行うことができます。さらに、トランスフェクションまたは形質導入の効率性の評価は、単一細胞レベルで行うことができます。 利点と制限事項抽象的に記載されているように、分析のための単一細胞の単離は、異種細胞集団の解析で見られる平均化の効果がなくなります。これらの平均化の効果は、豊富な転写を過剰表現して平均化し、多くの発現量の低い転写産物の検出を防止することにより、単一細胞内のmRNAの存在量を偽る。フローサイトメトリーは、個々のセルを並べ替えるために使用されますが、この方法は、細胞特異的マーカーと高価な機器の知識が必要です。18レーザーキャプチャーマイクロダイセクションはどちらUVやIRレーザーキャプチャーマイクロダイセクションシステムと単一のセル、さらには細胞内取り込みを可能にするだけの目的の細胞を必要とすることができます非常に薄い切片の表面に位置する。19はフローサイトメトリーと同様に、レーザーキャプチャーマイクロダイセクションはまた、高価な機器が必要です。 上記の電極ベースのコレクションの技術の主な利点の1つは、その貴重な電気生理学的データが同じセルで実行される機能性とトランスクリプトーム解析を可能にする、収穫の前に目的の細胞から得ることができるからである。私たちの技術の20の欠点があるそれは、マニピュレーターを使用して経験を必要としないこと。マイクロマニピュレータに精通して研究者らは、このテクニックは非常に直感的にわかりますが、そのような経験を持つ個人が必要な細かい動きに慣れる必要があります。 任意の増幅技術に内在するには、サイズと塩基組成に基づいて特定の転写産物の選択的増幅です。4,6,7ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）などの逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（RT - PCR）、cDNAの迅速増幅のようなベースのテクニックは線形増幅のaRNAの増幅法の結果、一方の端（RACE）の転写産物の指数関数的増幅の結果、。このように、aRNAの手順の主要な利点の一つは、より指数関数的に増幅するのではなく、唯一の直線的に増幅過程で発生したエラーやバイアスを増幅することによってmRNAの転写産物の相対的存在量を維持する能力にあるエラーやバイアスは言った。 マイクロアレイ解析と相まってaRNAの手順は、処理または未処理同様のまたは別の形態の単セル間のmRNAの存在量の比較ができます。さらに、増幅された材料は、次世代シーケンシングのために提出することができます。5,8がしかし、、手続きのためのランダムプライマーを使用することとは対照的に、オリゴ- dTプライミング手順はの偏見の増幅上記以来、このような分析には注意が必要mRNAおよび各ラウンドで、その後の増幅された物質のわずかな短縮で、一般的に、結果の3&#39;末端。ケアは、いくつかの偽の不在コールが若干短縮増幅された物質から発生することができるように標準的な方法とマイクロアレイの結果を分析することに注意してください。さらに、シーケンシングの結果は確かに全5提供する間、&quot;オリジナルのmRNAのほとんどのシーケンスを、5&#39;いくつかのmRNAのシーケンスが見逃される可能性があります。これらの理由により、増幅のラウンド数を制限する必要があります。

A correction was made to <a href="http://http://www.jove.com/video/2634/transcriptome-analysis-of-single-cells">Transcriptome Analysis of Single Cells</a>. There were errors in the volumes used in the aRNA Amplification section.

Erratum: Transcriptome Analysis of Single Cells

<table><tbody><tr><td>Spiegelgas カバーグラス</td><td>Carolina Biological</td><td>63-3029</td><td></td></tr><tr><td>Nunc 35x10 mm 培養皿</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-565-90</td><td></td></tr><tr><td>細胞培養用精製水</td><td>Lonza Inc.</td><td>17-724Q</td><td>細胞培養に使用する溶液の調製およびカバーグラスの洗浄用</td></tr><tr><td>Poly-D-Lysine MW70-150K</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>6407</td><td></td></tr><tr><td>ラミニン（超純品）</td><td>BD Biosciences</td><td>354239</td><td></td></tr><tr><td>ホウ酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B0252</td><td></td></tr><tr><td>Earle&amp;rsquo;s salts および glutamax 含有 MEM</td><td>Invitrogen</td><td>41090-101</td><td>細胞播種用</td></tr><tr><td>D-グルコース</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8769</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン-ストレプトマイシン</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>ウマ血清</td><td>Invitrogen</td><td>16050</td><td></td></tr><tr><td>シトシン-β-D-アラビノフルノシド</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1768</td><td></td></tr><tr><td>Earle&amp;rsquo;s salts および L-グルタミン 含有 MEM</td><td>Invitrogen</td><td>11095-098</td><td>細胞増殖用</td></tr><tr><td>ピルビン酸ナトリウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2256</td><td></td></tr><tr><td>B27 無血清サプリメント</td><td>Invitrogen</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>ホウケイ酸ガラスキャピラリー管 (外径 1.5mm, 長さ 100mm)</td><td>Kimble Chase</td><td>34500 99</td><td>適切なボアサイズが得られるのであれば、あらゆるホウケイ酸ガラスピペットが使用可能です。</td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Invitrogen</td><td>14175</td><td>後の工程を妨げない成分（すなわち Ca&amp;rsquo;t interfere with any future processing (i.e. no Ca&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt; または Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt; を含まないもの）であれば、どのような溶液でも使用可能です</td></tr><tr><td>1ml シリンジ</td><td>BD Biosciences</td><td>309628</td><td></td></tr><tr><td>針</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>ゲージはピペットの直径によって異なります</td></tr><tr><td>dNTP ミックス</td><td>Amersham</td><td>28-4065-51</td><td></td></tr><tr><td>dt-T7 オリゴ</td><td>カスタム</td><td>Midland Certified</td><td></td></tr><tr><td>第2鎖合成用バッファー (5x)</td><td>Invitrogen</td><td>Y01129</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td></td><td></td><td>第2鎖合成用バッファーに付属</td></tr><tr><td>E.coli DNA リガーゼ</td><td>Invitrogen</td><td>100002324</td><td></td></tr><tr><td>DNA ポリメラーゼ I</td><td>Invitrogen</td><td>100004926</td><td></td></tr><tr><td>RNase H</td><td>Invitrogen</td><td>18021-071</td><td></td></tr><tr><td>Megascript T7 キット</td><td>Ambion</td><td>AM1334</td><td></td></tr><tr><td>ランダムプライマー</td><td>BMB</td><td>11034731001</td><td></td></tr><tr><td>Superscript III 逆転写酵素</td><td>Invitrogen</td><td>56575</td><td>キット(18080-044)に含まれる。第1鎖合成用バッファー(Y02321)およびDTTが付属</td></tr><tr><td>MEGAclear キット</td><td>Ambion</td><td>1908</td><td></td></tr><tr><td>MinElute Reaction Cleanup キット</td><td>Qiagen</td><td>28206</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA ポリメラーゼ</td><td>Invitrogen</td><td>100004994</td><td></td></tr><tr><td>RNasin</td><td>Promega Corp.</td><td>N251B</td><td></td></tr><tr><td>Illumina TotalPrep RNA Amplification キット</td><td>Ambion</td><td>AMIL1791</td><td></td></tr><tr><td>火炎/ブラウン式 マイクロピペットプラー</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>P-87</td><td>Sutter社には他にも多くのモデルがあり、その多くがクックブックで解説されています</td></tr><tr><td>マイクロマニピュレーター</td><td>オリンパス株式会社</td><td></td><td>最新のエッペンドルフ製モデルなど、他の多くのマイクロマニピュレーターも使用可能です</td></tr><tr><td>ピペットホルダー</td><td>Warner Instruments</td><td>MP-S15A</td><td>マイクロマニピュレーターおよびピペットの外径によって異なります</td></tr><tr><td>Bioanalyzer RNA 6000 Nano キット</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-1511</td><td></td></tr></tbody></table>

単一細胞のトランスクリプトーム解析

Transcriptome Analysis of Single Cells

多くの遺伝子発現解析の技術は文化の組織ホモジネートまたは細胞からの細胞の不均一な集団から分離された材料に依存している。1,2,3の脳の場合には、このような海馬などの領域はそれぞれに、異なる細胞型の複雑な配置が含まれています異なるmRNAプロファイル。単一の細胞を回収する能力は、細胞集団間および内の分子の違いに綿密な調査で、より可能になります。我々は、さらなる処理のために細胞を採取するための簡便かつ迅速な方法を説明します。多くの場合、電気生理学で使用されているピペットは（誤嚥を使用して）目的の細胞を分離し、便利な分子生物学的手法の任意の数のさらなる処理のためのエッペンドルフチュー​​ブに、それを堆積させるために利用されています。我々のプロトコルは、細胞培養または急性スライスからさらには個々の細胞からの樹状突起の収穫に変更することができます。 我々はまた、単一のセルのアイソレーションの主要な下流のアプリケーションとしてaRNAの増幅法を説明します。このメソッドは、逆転写反応またはリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（PCR）などの他の遺伝子発現解析の手法に代わるものとして私たちの研究室で以前に開発されました。4,5,6,7,8この手法ではのリニア増幅を提供するポリアデニル化RNAは、材料の唯一のフェムトグラムから始まり、アンチセンスRNAのマイクログラム量で生じる。直線的に増幅された材料は、単離細胞のトランスクリプトームの成分の相対量のPCRの指数増幅よりも正確な推定を提供します。基本的な手順は、増幅の二回で構成されています。簡単に言うと、T7 RNAポリメラーゼプロモーターのサイトは、mRNA転写物から作成された二本鎖cDNAに組み込まれています。 in vitro転写一晩（IVT）反応は、T7 RNAポリメラーゼは、二本鎖cDNAから多くのアンチセンス転写産物を生成する実行されます。第二ラウンドでは、このプロセスを繰り返しますが、出発原料からいくつかの技術的な違いがアンチセンスRNAである。それは、増幅の3つのラウンドで、その結果、第二ラウンドを繰り返すことが標準です。多くの場合、in vitro転写反応の第三ラウンドは、生成されたアンチセンスRNAをハイブリダイズし、マイクロアレイで検出することができるようにビオチン化ヌクレオシド三リン酸を使用して実行されます。7,8

この記事では、ラット初代ニューロン培養とaRNAの増幅を使用して、その後のトランスクリプトーム解析から単一細胞の収穫のための簡単​​な方法を説明します。このアプローチは、任意の細胞型への一般化です。

多くの遺伝子発現解析手法は、組織ホモジネートから単離した不均一な細胞集団、または……にある細胞から単離した材料に依存しています。

この手順の全体的な目的は、トランスクリプトーム解析のために単一細胞からサンプルを調製することです。まず、単離に適した細胞を特定することでこれを達成します。次に、単離対象の細胞の隣にマイクロピペットを配置します。次に、細胞がマイクロピペットのチップ内に吸い込まれるまで、シリンジで吸引します。手順の最後の手順は、マイクロピペットのチップを回収チューブ内で破断し、マイクロピペットに残っている内容物をチューブ内に排出することです。最終的に、本プロトコルでも説明されているarna増幅法を用いて増幅した材料のマイクロアレイ解析や、PCR、次世代シーケンシングなどの他のアプリケーションを通じて、細胞間のmRNA集団の違いを示す結果を得ることができます。この手法は、単一細胞間の洞察や差異を明らかにできるだけでなく、樹状突起や特定の種類の樹状突起などの細胞内コンパートメントにも適用でき、樹状突起の機能に関する重要な情報を提供できます。本手順のデモンストレーションを行うのは、私の研究室のポストドクであるJennifer Singhです。このプロトコルの開始前に、ラットの胎生18日目（embryonic day 18）の海馬から採取した初代ニューロンを、35 mmディッシュ内の12 mmカバースリップ上に播種し、書面によるプロトコルに従って維持しました。回収用のピペットを準備するには、マイクロピペットプラーを用いて、オートクレーブ済みのガラスピペットを電気生理学に適した直径まで引き伸ばしてください。メーカーのプリセットプログラムを使用するため、チップは細胞回収前に切断されるため、ボアサイズは重要ではありません。細胞回収の準備が整った際にチップが破損していないよう、マイクロピペット保管容器などのホコリのない環境にピペットを注意深く保管してください。回収した試料を保存するため、1.7 mLのエプンドーチューブに必要な数だけ用意し、2 µLのPBSを加えておきます。組織培養フード内で、インキュベーターからカバーガラスが入った35 mmディッシュを1つ取り出します。このディッシュからカバーガラス1枚を、HBSSを入れた新しい35 mmディッシュの蓋の上に素早く移動させます。細胞の状態が悪くなるため、操作していないカバーガラスは速やかにインキュベーターに戻すことが極めて重要です。長期間放置しないでください。細胞の回収には、マイクロマニピュレーターを備えた40倍対物レンズ付きの倒立光顕微鏡が必要です。ピペットホルダーには柔軟なチューブを取り付け、回収中のピペットの不要な動きを防ぐため、チューブを安定した面に固定して使用してください。チューブの端にニードルを挿入し、ルアーロック接続の1 mLシリンジを取り付け、ユーザー間で交換できるようにします。マイクロピペットの準備として、片手の指でキムワイプをピンと張り、ピペットのチップを紙の上で1〜2回非常にゆっくりと撫でることで、コントロールされた方法でチップ先端を破損させます。開口部は、標的細胞サイズの約75〜100%にする必要があります。マイクロピペットをマイクロピペットホルダーに固定し、マイクロピペットホルダーをマイクロマニピュレーターのインサートに取り付けます。最後に、40倍の対物レンズを設定します。ディッシュを顕微鏡ステージに置き、回収に適した細胞領域を探します。初代ニューロン培養の場合、細胞は周囲の細胞から比較的孤立している必要があります。周囲の細胞や突起の採取を防ぐため、採取対象の細胞を視野の中心に配置してください。マイクロマニピュレーターを使用して、マイクロピペットをディッシュ内の溶液中、光学経路へと進めます。ピペットチップを溶液の中に浸します。接眼レンズを通して観察すると、視野内にピペットが影として現れます。ここから、細胞の平面より十分上の位置でシリンジを軽く吹くことで、陽圧をかけます。ピペットチップが視野に入るまで位置を調整し、粗動ミクロメータを用いてピペットチップに焦点を合わせます。この時点で、ピペットの内径が大きすぎないか、または小さすぎないかを確認してください。内径が不適切な場合は、回収領域でのピペットの破損を防ぐため、適切な内径のマイクロピペットが見つかるまで別のものに交換してください。マイクロマニピュレーターを用いてピペットチップを細胞に近づける前に、コースフォーカスを使用して焦点面を移動させます。細胞が近づいたら、細胞とピペットチップの両方にピントが合うまで微動フォーカスを使用します。細胞をカバーガラスから吹き飛ばさないように、標的細胞に到達する前に正圧の印加を停止してください。マイクロマニピュレーターを用いてピペットチップを配置し、回収する細胞体（soma）に接触させます。シリンジを使用し、細胞がピペットチップ内に入るまで口で緩やかに吸引します。細胞がピペットに入らない場合は、チップをゆっくりと細胞に近づけ、カバーガラスから浮き上がるまで下方に動かしてください。マイクロマニピュレーターを使用して、ピペットを直ちに上に動かし、溶液から出します。ホルダーからピペットを取り出します。準備した1.7 milliliterのエッペンドルフチューブを片手に持ち、チューブの底部側でピペットの先端を慎重に折ります。折れたチップの先端がチューブの中央に来るようにし、0.1 milliliterの目盛りを狙って、1 milliliterシリンジに取り付けた針をピペットの上部開口部から挿入します。プランジャーを急速に押し下げ、ピペット内の溶液をチューブ内に噴射させます。このとき、チップがチューブ壁面の液体に触れないように注意してください。毛細管現象によって液体がピペット内に戻るため、細胞はピペットの最先端にとどまり、これにより細胞を適切に排出することが可能になります。卓上マイクロ遠心分離機を用いてチューブの内容物を速やかにスピンダウンさせ、ドライアイスで凍結するか、あるいは氷上に置いて、以降の処理やPCR、次世代シーケンシングなどの他のアプリケーションに使用してください。ここでは、単離されたニューロンの回収に成功した例を示しています。まず、細胞密度の比較的低い領域を選択しました。次に、目的の細胞に向かってピペットチップを進めました。ここでは、細胞を回収した後の視野を示しています。周囲のプロセスはカバーガラス上に残ることに留意してください。対照的に、この図はピペットチップの2つの画像を示していますが、これらは効果的な回収に適したサイズではありません。こちらのチップでは回収が不完全になり、こちらに示されているチップでは周囲の環境まで回収されてしまいます。回収およびRNA増幅後、バイオアナライザーを用いて増幅RNAの分布と量を検討することが推奨されます。単一細胞材料からの増幅が成功すると、総量は数µg程度となり、分布はなだらかで幅広くなります。この手法に習熟すれば、適切に実施することで数分で完了させることができます。本手順を遂行する際は、RNAフリーの手法を用いることが重要です。

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単一細胞のトランスクリプトーム解析

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