Name: 初期段階のマウス胚を用いて組織特異的遺伝子のためのクロマチン免疫沈降アッセイ (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-04-29T16:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 2 s
Description: 学ぶクロマチン免疫沈降法を用いたマウスE8.5胚における組織特異的遺伝子のタンパク質-DNA相互作用解析。この手法は発生生物学における分化プログラムの理解に貢献します。

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1。胚の単離 注 ：マウスを含むすべての操作が適切な動物のケアと使用ポリシーとプロトコルに従い実施すること<ol><li>雌マウスの交配のプラグインの存在交配後の朝にチェックして、別のケージに入れて、スタッドの男性から交尾の雌を分離。嵌合プラグが観測された日の正午は、開発の胎生0.5（E0.5）とみなされます。 </li><li> E8.5で、（または必要な段階、異なる場合）、承認されたプロトコルを使用して、マウスを犠牲にする。 </li><li> 70％エタノールで安楽死させた動物の腹を濡らし、腹腔を開く。胚の存在を示す着床部位が各子宮角（図1A）の長さに沿って配置"糸に通したビーズ"として見られている。はさみを使用すると、両方の子宮角を取り除く分離するために個別に各移植部位を切断（図1B）と室温（RT）を含む100mMペトリ皿の中に置いてください解剖の培地（DMEM、10％ウシ胎児血清、20mMのHEPES、pH7.4、中、60μg/ mlのペニシリン、2mMのストレプトマイシン）。 </li><li>鉗子を使用して、子宮組織（図1C）から各胚および周囲の膜を除去し、新鮮な解剖の培地の中に置いてください。 </li><li>鉗子を用いて解剖顕微鏡下で個々の胚を隔離する。開発のこの段階で、胚はコンタクトdeciduum組織、内臓卵黄嚢と羊膜頭頂卵黄嚢に囲まれています。羊膜は胎児と直接接触している透明な膜です。内臓卵黄嚢は、羊膜と頭頂卵黄嚢の間に位置しており、容易に胚を育てる著名な血管の存在によってE8.5 - E9.5の胚で区別される。その周囲の膜からそれぞれの胚を取り出して、余分な血液を除去するために解剖のメディアを含む新しいプレートに個別に転送する。発達段階は胚から胚へと同腹の間で異なることがあります。代表E8.5胚及び代表E9.5の胚は、図1Dに示されています。 </li><li>解剖のメディア（上記のステップ4で説明）の200μlを含む1.5mlのエッペンドルフチュー​​ブにそれぞれの胚を移す。 </li></ol> 2。隔離された胚の均質化<ol><li>各エッペンドルフチュー​​ブに、200μlの量（DPBS 1X Dubbeccoのリン酸で希釈緩衝生理食塩水）にコラゲナーゼII型の20台を追加。 </li><li>ゆっくりと20分間100rpmで37℃のシェーカーにサンプルを振る。 </li><li>細胞の塊を破壊するためにピペッティングしてよく懸濁します。 </li><li> 1.5mlのエッペンドルフチュー​​ブの上に配置滅菌セルストレーナー（40μmのメッシュの大きさ）の上に細胞懸濁液を適用します。 </li><li>すぐに分離を完了するために、セルストレーナーの上に室温1X DPBS 600μlを適用する。ストレーナーを捨てる。 </li><li> 4で試料を遠心° Cを5分で4000 × gで。 </li><li>上清を捨てる。 </li><li> RT 1XのDPBS 1ml中にペレットを再懸濁する。 </li><li>室温で1分間4000 × gで試料を遠心分離します。 </li><li>上清を捨てる。 </li><li> RT郭清のメディアを200μlにペレットを再懸濁します。 </li><li>胚細胞を数える。平均3〜5 × 10 6 cells/E8.5胚があります。 </li></ol> 3。クロスリンクしたクロマチン<ol><li> 1％のホルムアルデヒドの最終濃度の200μlをサンプルに37％ホルムアルデヒドの5.6μlを添加する。 </li><li>室温で10分間サンプルをインキュベートする。 </li><li> 4℃で3分間4000 × gで試料を遠心分離します。 </li><li>上清を捨てる。 </li><li> 80μlの/ mlのプロテ​​アーゼ阻害剤カクテル（PIC）を含む冷1X DPBSで細胞を再懸濁します。 </li><li> 4で試料を遠心℃で3分間4000 × gで。 </li><li>上清を捨てる。このステップでは、サンプルは-80℃で凍結することができます冷凍、架橋試料は数ヶ月間安定です。 </li></ol> 4。超音波処理<ol><li> RT SDS溶解緩衝液（1μlのPIC/800液総量で新鮮な付加PICと50mMのトリス- HCl（pH 8.1）、10mMのEDTA及び1％SDS）100μlに細胞ペレットを再懸濁します。再懸ときは、再懸濁を促進するためのRT SDS溶解バッファーの追加の100 ulを加える。ピペッティングし、反転によってよく混ぜる。 </li><li>氷上で10分間細胞懸濁液をインキュベートする。 </li><li> 200〜DiagenodeのBioruptorを使用して500塩基対にせん断DN​​Aに溶解した細胞を超音波洗浄™UCD200（5分× 8回：高（320ワット）電源オン30秒on/30秒の振幅の設定はオフ）。サンプルは、氷スラリーで囲む必要があります。サンプルは4 ° Cを超える温めたり、フリーズしたりしないでください。利用可能なsonicatorsの多くの種類があります。超音波処理の条件は、約500 bpの長さに架橋DNAが切断されるため、各ソニケーターのために最適化する必要があります。 </li><li> 4で超音波処理試料を遠心℃で10分間、14000 × gで。 </li><li> T新鮮なエッペンドルフチュー​​ブを氷上で冷却した上清をケース温度。 </li><li> 5アリコートの最大に超音波処理サンプルを分ける。我々は経験的にone E8.5胚は5アリコートに分割できることを決定した。小規模または大規模なサンプルサイズは、それに応じて拡大縮小することができます。このステップでは、サンプルは-80℃で保存することができます℃でさらに使用するまで。 </li><li>クロスリンクが逆になるステップ6まで-20℃での入力や店舗として使用するための準備one分量。 1μl/800で新鮮な付加PICを含むチップ希釈バッファー（16.7 mMのトリス- HCl（pH 8.1）、1.2 mMのEDTA、1.1％トリトンX - 100、167 mMのNaClおよび0.01％SDS）で10倍、他のアリコートを希釈するμlのBuffer。 </li></ol> 5。事前にクリアし、免疫沈降<ol><li>サーモン、精子のDNA /タンパク質4時またはGアガロース- 50％のスラリー° C、回転と、1時間の75μlの事前クリア希釈上清。またはプロテインGビーズをチップに使用する抗体によって決定されるべきどちらタンパク質の使用。プロテインGビーズがヤギの抗体またはマウスIgG 1抗体のために推奨されているのに対し、例えば、タンパク質ビーズを、ウサギの抗体をお勧めします。詳細については、ビーズの製造業者の推奨事項を参照してください。 </li><li> 1分間2500 × gで4℃で遠心する。 </li><li>新しい、事前に冷却エッペンドルフチュー​​ブに上清を移す。 </li><li>事前にクリアアリコートに抗体（4μgの/サンプル）を追加し、4℃で一晩インキュベート° Cを回転した。 </li></ol> 6。クロマチンタンパク - ビーズ複合体を洗う<ol><li> 4時に各バイアルとインキュベートにサケ精子DNA /プロテインAまたはGアガローススラリーの60μlを加え、℃で1時間の回転とC。上記の手順3で事前にクリアするのに使用されるのと同じビーズの種類を使用してください。 </li><li> 1分間1,000 × gで4℃で遠心する。 </li><li>注意深く上清を除去して捨てる。氷の上にDNA -タンパク質 - ビーズ複合体をしてください。 </li><li>としての洗浄バッファー1、2、3、4で以下の指示ペレットを再懸濁し、洗浄する。 1〜3 ° Cとこれらのバッファで洗浄を4で実行する必要がある4に冷やしすべきバッファ℃を洗うバッファ4は、このバッファーで室温と洗浄にあるはず洗浄は室温で行ってください。各洗浄は適切な温度で回転で5分間です。 4℃（洗浄バッファー4回洗浄し、室温）1分間1000 × gでの各洗浄、遠心分離に続いて、その後、慎重に吸引したり、上清を取り除く。 </li></ol> バッファ1：低塩の洗浄緩衝液（20mMトリス- HCl（pH 8.1）、2mMのEDTA、1％トリトンX - 100、 150mMのNaCl及び0.1％SDS）、1ミリリットル× 2回洗浄。 バッファ2：高塩の洗浄緩衝液（20mMトリス- HCl（pH 8.1）、2mMのEDTA、1％トリトンX - 100、 500mMのNaCl及び0.1％SDS）、1ミリリットル× 2回洗浄。 バッファ3：塩化リチウム（LiCl）の洗浄緩衝液（10mMのトリス- HCl（pH 8.1）、1mMのEDTA、1％IGEPAL - CA630、 0.25 M塩化リチウム、1％デオキシコール酸（ナトリウム塩））、1ミリリットル× 1洗浄。 バッファ4：TE緩衝液（10mMトリス- HCl（pH 8.1）、1mMのEDTA）、1ミリリットル× 2回洗浄。 7。クロマチン - 抗体複合体の溶出<ol><li>新しく調製した溶出バッファー（1％SDS、0.1 M 炭酸水素ナトリウム）を250μlで洗浄したクロマチンタンパク-ビーズ複合体を再懸濁します。その後、回転で15分間室温でインキュベートする5秒間激しくボルテックスサンプル、。 </li><li>室温で1分間2500 × gで遠心し、新しいエッペンドルフチュー​​ブに溶出液を移す。 </li><li>ステップ1と2を繰り返し、同じエッペンドルフチュー​​ブに溶出液を組み合わせる。溶出液を室温で維持する必要があります。このステップの完了時に、溶出液をさらに使用するまで-20℃で保存することができます。 </li></ol> 8。クロスリンクを逆にしてDNAを回収する<ol><li> 500μlの溶出液（入力制御のための40μL/ mL）について、20μlの5 M NaClを追加します。 </li><li> ℃で一晩に4時間、水浴で65℃溶出液を加熱する。 </li><li>各サンプル（入力制御を含む）10μlのDNA断片のサイズをチェックするために0.1から1 kbpの範囲をまたがるサイズマーカーの隣の2％アガロースゲル上で実行することができます。 DNAがスメアではなく鋭いバンドとして表示されます。ゲルの実行中にサンプルの残りは65 ° Cで残すことができます。 </li><li> QIAquickゲル抽出キット（キアゲン）を用いて各サンプルからDNAを回収する。 QIAクイックスピンカラムと500μlのサンプルにイソプロパノール200μlのシリカメンブレンにDNAを吸着を最適化するために、600μlのQGのバッファを（キットに付属）を追加します。 QGのバッファは、サンプルのpHを簡単に測定が可能pH指示薬が含まれていることに注意してください。サンプルの色が紫に黄色から判明した場合（pH値&gt; 7.5）を混合した後、試料と混合するための3 M酢酸ナトリウム10μlの液（pH 5.2）に追加します。これは、列のビーズへのDNA結合を最大化するために混合物のpHを減らすことができます。 </li><li>列をロードする前に、任意のSDSの沈澱物が存在するかどうかを判断するために混合物を確認してください。 SDS沈殿が発生した場合、サンプルはで暖めすべき42℃の水浴沈殿が消えるまで。 </li><li> QIAクイックスピンカラム（キットに含まれる紫色の列）に混合物を700μlをロードし、1分間14000 × gで室温で遠心。先に進む前に、カラムからのフロースルーを捨て、残りのサンプルでこの手順を繰り返します。 </li><li>カラムを洗浄するために500μlのQGのバッファを追加。 2分間14000 × gで室温で遠心する。次に進む前に、カラムからのフロースルーを捨てる。 </li><li>メーカーの指示に従ってエタノール追加されているPE洗浄緩衝液（キットに付属）の700μlを持つカラムを洗浄します。 1分間14000 × gで室温で遠心する。次に進む前に、カラムからのフロースルーを捨てる。 </li><li>完全にカラムからPEのバッファの残りを除去するために遠心分離のステップを繰り返します。フロースルーとコレクションチューブを捨てる。 </li><li> 60μlのEBのバッファー（キットに付属の溶出バッファー）を加えることで新鮮なエッペンドルフチュー​​ブにカラムからDNAを溶出する。 </li><li> 1分間14000 × gで室温で遠心する。溶出したDNAを検出するまで-20℃で保存することができます。回収された物質260の測定値は通常、一定分量あたり〜6月7日UGの合計回復のために、90〜120 ngの/ ULの濃度を示している。しかし、これらのサンプルの280分の260比はRNAがサンプル中に存在することを示唆し、通常は&gt; 1.8です。こうして回収されたDNAの正確​​な量が少なくなることがあります。 </li></ol> 9。回収したDNAの解析<ol><li> SDSはPCR Taqポリメラーゼの活性を妨害することができます。 SDSはPCRを実行する前に完全に削除する必要があります。 1分間14000 × gで4℃、残存SDSと遠心° Cを沈殿させるために氷の上にDNAをインキュベートする。新しいエッペンドルフtube.Thisのステップに上清を移すことを強くお勧めします。 </li><li> DNAの溶出液は、従来のPCR法によって、または、解析を行うそれぞれの配列に特異的なプライマーを用いた定量的リアルタイムPCR（Q - PCR）のいずれかによって検出することができます。全DNAの溶出液から5〜10μlのは、1つのPCRまたはQ - PCR反応に用いることができる。入力制御を用いたPCRは、他の試料の量と比較してDNAの5〜10倍希釈で行うことができます。 PCRおよびQ - PCRの条件は、しかし、出発原料の限られた量は、追加のPCRサイクルを必要とする、変化します。従来のPCR検出のために、我々は40サイクルから始め、必要に応じて調整することをお勧めします。 </li></ol> 10。代表的な結果我々は、E8.5とE9.5の胚（図2）の両方からChIPを行うためにこのプロトコルを使用している。結果はmyogeninがE8.5とE9.5の胚におけるmyogeninプロモーター上に存在していることを示している。沈降精製DNAは、従来のPCR（図2A）および定量的リアルタイムPCR（図2B）によって分析した。これとは対照的に、myogeninが発現していない卵黄嚢、のmyogeninプロモーターへの結合myogeninの兆候はなかった。インターフェロン-γ（IFNγ）myogenin結合部位に一致するシーケンスが含まれているプロモーターは、負のシーケンス制御として使用された。予想通り、myogeninは、テストされた組織サンプルの任意のIFNγプロモーターに結合されていませんでした。骨格筋の前駆体である、、E8.5および9.5胚では、myogeninは、特に体節（6,10図3）で表されます。したがって、結果はmyogeninがE8.5とE9.5での体節にmyogeninプロモーターに結合していることを示している。 <img src="/files/ftp_upload/2677/2677fig1.jpg" alt="図1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図1"> 図1。E8.5胚の解剖。 （）絶縁子宮角（上部パネル、下部のパネルに示すように高い倍率）。 （B）子宮角は、個々の胚を含む個々の着床部位を分離するためにはさみで切る。 （C）胚は、解剖時の子宮組織から突出。矢印は、まだ余分な胚組織で覆われた胚をマーク。同じごみから（D）二E8.5胚。左の胚は回転のプロセスを開始していません。右側の胚は回転を受けています。右端 - 代表E9.5の胚。 <img src="/files/ftp_upload/2677/2677fig2.jpg" alt="図2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図2"> 図2。ChIPアッセイがE8.5とE9.5の胚におけるmyogeninプロモーターへの結合myogeninを示す。 myogenin抗体や非特異的IgGは転写の開始部位に-79から69の相対的にmyogeninプロモーターの部分を増幅するプライマーを使用して実行されたを使用してChIPの実験から精製したDNA5μlの中（上）従来のPCR解析その-12転写開始部位の〜1075塩基対上流に位置するmyogenin結合部位に一致するシーケンスが含まれているIFNγプロモーターの部分を増幅するプライマーに位置するmyogenin結合部位が含まれています。使用されるIFNγのプライマー配列は、5' - GCT GAC TCA AGA CCC CGA GGC - 3'および5' - TGA GGA TGG GGC AGG AGG CC - 3'であった。 （）で使用したのと同じサンプルの（下）定量的リアルタイムPCR解析。市販標準偏差 - データが入力+ /の％としてプロットされます。 <img src="/files/ftp_upload/2677/2677fig3.jpg" alt="図3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図3"> 図3。Myogeninが特にE8.5及びE9.5の胚の体節に発現している。 myogeninのin situハイブリダイゼーション全体のマウントは、体節内の特定のmRNAの発現を示しています。 200μm程度 - E8.5画像のサイズのバー。 E9.5画像のサイズのバー - 500μmの。

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<li>Braun, T., Arnold, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+four+human+muscle+regulatory+helix-loop-helix+proteins+Myf3-Myf6+exhibit+similar+hetero-dimerization+and+DNA+binding+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">The four human muscle regulatory helix-loop-helix proteins Myf3-Myf6 exhibit similar hetero-dimerization and DNA binding properties.</a> Nucleic Acids Res. 19, 5645-5651 (1991).</li>
<li>Serna, dela, L, I., Ohkawa, Y., Berkes, C. A., Bergstrom, D. A., Dacwag, C. S., Tapscott, S. J., Imbalzano, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MyoD+targets+chromatin+remodeling+complexes+to+the+myogenin+locus+prior+to+forming+a+stable+DNA-bound+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">MyoD targets chromatin remodeling complexes to the myogenin locus prior to forming a stable DNA-bound complex.</a> Mol Cell Biol. 25, 3997-4009 (2005).</li>
<li>Blais, A., Tsikitis, M., Acosta-Alvear, D., Sharan, R., Kluger, Y., Dynlacht, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+initial+blueprint+for+myogenic+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">An initial blueprint for myogenic differentiation.</a> Genes Dev. 19, 553-569 (2005).</li>
<li>Cao, Y., Kumar, R. M., Penn, B. H., Berkes, C. A., Kooperberg, C., Boyer, L. A., Young, R. A., Tapscott, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+and+gene-specific+analyses+show+distinct+roles+for+Myod+and+Myog+at+a+common+set+of+promoters%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Global and gene-specific analyses show distinct roles for Myod and Myog at a common set of promoters.</a> EMBO J. 25, 502-511 (2006).</li>
<li>Ohkawa, Y., Yoshimura, S., Higashi, C., Marfella, C. G., Dacwag, C. S., Tachibana, T., Imbalzano, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myogenin+and+the+SWI%2FSNF+ATPase+Brg1+maintain+myogenic+gene+expression+at+different+stages+of+skeletal+myogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Myogenin and the SWI/SNF ATPase Brg1 maintain myogenic gene expression at different stages of skeletal myogenesis.</a> J Biol Chem. 282, 6564-6570 (2007).</li>
<li>Davie, J. K., Cho, J. H., Meadows, E., Flynn, J. M., Knapp, J. R., Klein, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Target+gene+selectivity+of+the+myogenic+basic+helix-loop-helix+transcription+factor+myogenin+in+embryonic+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Target gene selectivity of the myogenic basic helix-loop-helix transcription factor myogenin in embryonic muscle.</a> Dev Biol. 311, 650-664 (2007).</li>
<li>Metivier, R., Penot, G., Hubner, M. R., Reid, G., Brand, H., Kos, M., Gannon, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estrogen+receptor-alpha+directs+ordered%2C+cyclical%2C+and+combinatorial+recruitment+of+cofactors+on+a+natural+target+promoter%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Estrogen receptor-alpha directs ordered, cyclical, and combinatorial recruitment of cofactors on a natural target promoter.</a> Cell. 115, 751-763 (2003).</li>
<li>Ausubel, F. M., Brent, R., Kingston, R. E., Moore, D. D., Seidman, J. G., Smith, J. A., Struhl, K. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAusubel%2C+FM+%22Current+Protocols+in+Molecular+Biology%22">Current Protocols in Molecular Biology</a>. , John Wiley & Sons, Inc. (2010).</li>
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動物実験は、マサチューセッツ医科IACUCの大学が定めるガイドラインおよび規則に従って行った。

説明したChIPのプロトコールでは、我々は、筋原性レギュレータmyogeninが単一のE8.5及びE9.5の胚に存在する骨格筋の前駆体の組織におけるmyogeninプロモーターに関連付けられていることを示している。先行研究では、広範囲にin vitroでのゲルシフト実験の初期にはin vitroで翻訳や細菌生産myogeninと11月20日標的遺伝子の調節配列の該当する部分をコードする放射性標識DNAを利用し始めて、配列を含むEボックスへの結合myogeninを特徴付けている。従来のチップの研究では、筋形成21から24のための組織培養モデルにおけるmyogeninプロモーターへの結合myogeninを実証している。しかし、一myogeninからE15.5舌の組織で観察さmyogenin発現のダウンレギュレーションに基づいて、後胚発生のケースのように、これを予測する可能性がありますが、そのmyogeninは、胚骨格筋の開発中にmyogeninプロモーターに結合を示す証拠はない欠損マウス25。したがって、データはmyoge...

<table><tbody><tr><td>ChIPアッセイキット</td><td>Upstate, Millipore</td><td>17-295</td><td></td></tr><tr><td>コラゲナーゼ Type II</td><td>Invitrogen</td><td>17101015</td><td>1 x PBSで希釈</td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s modified eagle medium (DMEM) </td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>12100-061</td><td>高グルコース含有</td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s phosphate buffered saline 1X (DPBS)</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>14190-144</td><td>塩化カルシウムフリー、塩化マグネシウムフリー</td></tr><tr><td>ウシ胎児血清 (FBS)</td><td>Mediatech, Inc.</td><td>35-010-CV</td><td></td></tr><tr><td>ゲル抽出キット</td><td>QIAquick</td><td>28704</td><td>50反応キット</td></tr><tr><td>ペニシリン/ストレプトマイシンストック溶液</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td></td><td>5000 &amp;#x03BC;g/ml 濃度</td></tr><tr><td>プロテアーゼ阻害剤カクテル</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8340</td><td></td></tr><tr><td>鮭精子DNA / プロテインAアガロース</td><td>EMD Millipore</td><td>16-157</td><td></td></tr><tr><td>myogenin 抗体</td><td>Santa Cruz Biotechnology, Inc.</td><td>sc-576</td><td></td></tr><tr><td>正常ウサギIgG</td><td>EMD Millipore</td><td>12-370</td><td></td></tr><tr><td>Platinum PCR Supermix</td><td>Invitrogen</td><td>11306-016</td><td></td></tr><tr><td>GoTaq Q-PCR マスターミックス</td><td>Promega Corp.</td><td>A6001</td><td></td></tr></tbody></table>

初期段階のマウス胚を用いて組織特異的遺伝子のためのクロマチン免疫沈降アッセイ

Chromatin Immunoprecipitation Assay for Tissue-specific Genes using Early-stage Mouse Embryos

クロマチン免疫沈降（ChIP）はタンパク質を識別するための強力なツールです：1-3生きた細胞のコンテキストで発生するクロマチンの相互作用。この手法は、広く一次組織で、組織培養細胞の中で利用し、より少ない程度にされています。特に開発の早い時間にげっ歯胚組織、チップのアプリケーションは、組織の限られた量と胚の細胞と組織型の不均一性によって複雑になる。ここでは、解離胎生8.5（E8.5）の胚を用いてChIPを行うための方法を提示する。クロマチンの相互作用：単一のE8.5胚からの断片化クロマチンは、コントロールおよび特定の蛋白質の調査のための調査員に十分な材料を可能にするfiveアリコート、するに分けることができます。 組織特異的遺伝子発現プログラムの仕様中にクロマチンの相互作用：我々は、タンパク質を文書化し始めるためにこのテクニックを利用してきた。すべての相互作用が発生するかどうかといった区別なく、クロマチンの相互作用、のサブセット、または単セルのタイプ（S）：結果は、タンパク質の検出であるため、胚の細胞型の不均一性は、必ずしもこの手法の適用を制限する。しかし、組織特異的遺伝子発現の開始時または、以下の組織特異的遺伝子の検査は、2つの理由で実現可能です。最初に、組織特異的因子の免疫沈降は、必ずしも要因が発現する細胞の種類からクロマチンを分離します。遺伝子の活性化に関連付けられている第二に、コアクチベーターとヒストンの免疫沈降を含む翻訳後修飾は、遺伝子と遺伝子がされているか、アクティブ化された細胞のタイプの遺伝子調節配列で発見されるべきである。テクニックは、ほとんどの組織特異的遺伝子の活性化のイベントの調査に適用可能であるべきである。 後述の例では、我々は、骨格筋特異的遺伝子のプロモーターにおける結合因子を調べるためにE8.5及びE9.5のマウス胚を利用した。体幹と四肢の骨格筋が形成する元となる前駆組織である体節は、、E8.5 - 9.5 4,5で存在している。 Myogeninは、骨格筋の分化6月9日に必要な調節因子である。データはmyogeninがE8.5とE9.5の胚においてそれ自身のプロモーターに関連付けられていることを示しています。 myogeninが唯一の開発6,10のこの段階で体節で表されているため、データはそれ自身のプロモーターとmyogeninの相互作用は既にE8.5胚における骨格筋の前駆細胞で発生したことを示している。

我々はマウス胚組織における組織特異的遺伝子発現の開始中または後に組織特異的遺伝子に要因の相互作用を識別するために、クロマチン免疫沈降（ChIP）法を示しています。それは正常な胚発生時に発生するとして、このプロトコルは、組織特異的遺伝子の活性化の研究に広く適用可能であるべきである。

クロマチン免疫沈降法（ChIP）は、生細胞内で起こるタンパク質とクロマチンの相互作用を同定するための強力なツールである1-3。

この手順の目的は、クロマチン免疫沈降（ChIP）アッセイに使用するためのマウス胚（E 8.5）を単離することです。まず、マウス胚を単離して単一細胞懸濁液を調製します。次に、ゲノムDNAに結合しているタンパク質を化学的に架橋し、その後、超音波処理によってDNAを断片化します。本手順の第3ステップは、タンパク質・クロマチン複合体を免疫共沈させ、精製DNAを単離することです。手順の最終ステップでは、免疫共沈により精製されたDNAを、従来のPCRまたは定量リアルタイムPCRを用いて解析します。最終的に、発生中の組織や器官において分化プログラムが開始される際、分化特異的遺伝子の調節配列とタンパク質との相互作用を示す結果を得ることができます。本学期では、分化特異的遺伝子が転写能を獲得する際に、その調節配列と相互作用する調節因子の同定を通じて、胚発生中の分化プログラムの開始に関する重要な疑問への回答を得ることができます。この手順を開始するために、胚齢8.5日のマウスを犠牲にし、子宮角を摘出します。承認済みのプロトコルに従い、ハサミを用いて組織を新鮮な切片用培地を含むペトリ皿に移します。過剰な出血を避けるため、各着床部位を個別に切り出し、新鮮な解剖用培地を入れたシャーレに入れます。ピンセットを用いて、各着床部位から子宮層を取り除き、脱落膜を露出させます。ピンセットを使って個々の胚を分離します。この発達段階において、胚は壁側卵黄嚢（脱落膜組織に接している）、内臓側卵黄嚢、および羊膜に囲まれています。羊膜は胚に直接接している透明な膜です。卵黄嚢臓側葉は羊膜と卵黄嚢壁側葉の間に位置し、8.5日から9.5日の胚では、胚に栄養を供給する顕著な血管が存在するため、容易に識別できます。それぞれの胚を周囲の膜から取り出し、過剰な血液を除去するため、解剖用培地を入れた新しいプレートに個別に移します。その後、各胚を200 µLの解剖用培地 containing 200 µLの解剖用培地を含む1.5 mLのエッペンチューブに移します。単離した胚のホモジナイズは、各胚が入ったエッペンチューブに200 µLのコラゲナーゼ type II 溶液を加えることから始めます。サンプルを37 °Cのシェーカーで100 RPMで20分間、穏やかに振盪させます。次に、ピペッティングして細胞の凝集塊を分散させ、サンプルを再懸濁します。この細胞懸濁液を、1.5 mL エッペンドルフチューブの上に配置したメッシュサイズ 40 µm の滅菌済みセルストレーナーの上に適用します。室温の1X DPBS 600 µLをセルストレーナーの上部に直ちに加えて分離を完了させます。懸濁液のろ過後、セルストレーナーを廃棄し、サンプルを4°C、4,000 Gで5分間遠心分離します。遠心分離後、上清を廃棄します。各ペレットを室温の1X DPBS 1 mLに懸濁させます。次に、サンプルを室温で4,000 Gで1分間遠心分離します。2回目に上清を捨てた後、各ペレットを室温の解離培地200 µLで再懸濁し、200 µLのサンプルに37%ホルムアルデヒド5.6 µLを加えて、最終濃度が1%ホルムアルデヒドになるようにクロマチンを架橋します。サンプルを室温で10分間インキュベートした後、4°Cで3分間、4,000 Gで遠心分離し、上清を捨てます。80 µL/mLのプロテアーゼ阻害剤カクテル（PIC）を含む冷えた1X DPBSで細胞を再懸濁します。その後、サンプルを4°Cで3分間、4,000 Gで遠心分離します。上清を廃棄した後、サンプルを-80°Cで冷凍保存することができ、超音波処理を行うまで数ヶ月間安定して保存可能です。冷凍した細胞ペレットを氷上で解凍するか、前ステップのペレットを氷上に置きます。細胞ペレットを室温のSDS溶解バッファー100 µLで再懸濁させます。さらに室温のSDS溶解バッファー100 µLを加え、ピペッティングと転倒混和によってサンプルを再懸濁させます。細胞懸濁液を氷上で10分間インキュベートします。インキュベーション後、アパレーターを設定し、架橋DNAを200から500塩基対の範囲でせん断します。本デモンストレーションでは、Diogenomics社製Rupture UCD 200を使用しています。氷泥で囲んだ状態でサンプルをソニケーションします。温度が4 °C以上に上昇したり、凍結したりしないように注意してください。ソニケーション後のサンプルを、4 °Cで14,000 Gにて10分間遠心分離します。上清を、氷上で予冷した新しいeend DPHチューブに移します。超音波処理したサンプルを最大5つの分注分に分けます。1つの分注分は、架橋解除用の入力サンプルとして保存するため、−20°Cで保存します。次に、バッファー800 µLあたり1 µLのPICを直前に追加したチップ希釈バッファーを用いて、他の分注サンプルを10倍に希釈します。まず、チップアッセイタンパク質に使用する抗体に基づき、プレクリーニングに使用するAero速度を決定してください。ここでは、チップに使用する抗体がラビット抗体であるため、Aビーズを使用しています。50%サモン精子DNAおよびタンパク質を75 µL加え、希釈した上清をプレクリアします。4°Cで1時間、回転させながらインキュベートします。インキュベーション後、サンプルを4°Cで2,500 Gで1分間遠心分離します。上清を新しい冷却済みのEPチューブに移します。サンプルあたり4 µgの抗体をプレクリア済みのEloquaに加え、4 °Cで回転させながら一晩インキュベートします。まず、各サンプルに60 µLのサケ精子DNAタンパク質Aerosビーズ懸濁液を加え、4 °Cで回転させながら1時間インキュベートします。その後、サンプルを4 °C、1000 ×gで1分間遠心分離します。遠心分離後、上清を注意深く取り除いて廃棄し、DNA-タンパク質ビーズ複合体を氷上に保持します。書面でのプロトコルに従い、バッファー1から4を用いてペレットを再懸濁および洗浄します。各洗浄は、回転させた状態で5分間のインキュベーションを行い、続いて1000 Gで1分間遠心分離し、洗浄後の上清を除去することで構成されます。洗浄後のクロマチンタンパク質ビーズ複合体を、新しく調製した溶出バッファー250 µLに再懸濁させて、クロマチン抗体複合体を溶出させます。各サンプルを5秒間激しくボルテックスし、その後、回転させた状態で室温で15分間インキュベートし、続いて2,500 Gで1分間遠心分離します。室温で、各溶出液を新しいEPチューブに移します。溶出操作を繰り返し、各サンプルの溶出液を同じエッペンドルフチューブに回収します。架橋を切断するため、500 µLの溶出液あたり20 µLの5 M 塩化ナトリウムを添加します。あらかじめ確保しておいたインプットコントロールには、1 mLあたり40 µLの5 M 塩化ナトリウムを添加します。EITを65 °Cの水槽で4時間加熱します。DNA断片のサイズを確認するため、各サンプル10 µLを、0.1から1 kbをカバーするサイズマーカーと共に2%アガロースゲル上のインプットコントロールに負荷し、一晩泳動します。DNAはシャープなバンドではなく、スマアとして現れます。Kaya Quick Gel Extraction Kitを用いて、各500 µLのサンプルからDNAを回収します。まず、Kaya Quick Spin Column内のシリカメンブレンへのDNA吸着を最適化するために、600 µLのQGバッファーを加えます。次に、カラムにロードする前に200 µLのイソプロパノールを加えます。混合物を確認し、SDSの沈殿が生じていないか判断してください。SDSの沈殿が生じた場合は、沈殿物が消失するまでサンプルを42 °Cのウォーターバスで加温してください。その後、サンプルをカラムに適用し、メーカーの指示に従ってDNAを溶出させます。SDSはPCRTポリメラーゼの活性を阻害する可能性があるため、PCRを行う前に完全に除去する必要があります。各DNAサンプルを氷上でインキュベートして残留SDSを沈殿させ、4°Cで14,000 Gにて1分間遠心分離します。SANEを新しいエッペンドルフチューブに移します。DNA EITは、従来のPCRまたは、解析する各配列に特異的なプライマーを用いた定量リアルタイムPCR（QPCR）によって検出可能です。1回のPCRまたはQPCR反応につき、全DNA IITから5～10 µLを使用してください。PCRおよびQPCRの条件は異なります。ただし、出発物質の量が限られているため、従来のPCR検出では追加のPCRサイクルが必要となります。まずは40サイクルから開始し、必要に応じて調整してください。本プロトコルを用いて、E 8.5およびE 9.5の両方の胚からチップ処理が行われました。チップで精製されたDNAは、従来のPCRおよび定量リアルタイムPCRによって分析されました。結果から、E 8.5およびE 9.5胚の筋分化およびプロモーターにおいて、筋分化および調節因子が存在することが示されました。対照的に、筋分化が発現していないoak sacでは、筋分化および筋分化プロモーターへの結合は認められませんでした。筋分化結合部位に一致する配列を含むインターフェロンガンマプロモーターを陰性配列コントロールとして使用したところ、予想通り、テストしたどの組織サンプルにおいても、筋分化はインターフェロンガンマプロモーターに結合していませんでした。これらの結果は、myo Geninがこれらの段階の体節で特異的に発現していることから、MyogenicがE 8.5およびE 9.5胚の体節におけるMyogenicプロモーターに結合していることを示しています。このビデオを視聴することで、発生中の組織における組織特異的遺伝子に見出される調節因子を同定するための、E 8.5マウス胚の分離およびクロマチン沈降アッセイに向けた調製方法について十分に理解できるはずです。

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Research

JoVE Journal

Biology

生物学

ESCの分化は、細胞型特異的構造の変化とクロマチンの構成と一致している。これらの変更の検出はstemcellnessと細胞分化を定義するメカニズムが貴重な洞察を提供します。クロマチン免疫沈降（ChIP）は、幹細胞の分化の分子メカニズムを解明する貴重な方法を表します。...

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ここで、我々は、効率的な高スループットを記述...

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ここでは、遺伝子操作マウスの開発における感覚軸索成長表現型を評価する効果的な方法として、全動物の末梢侵害受容器軸索突起のイメージングのために胎児マウスを遺伝子型決定し、染色し、準備するための最適化されたプロトコルを提示します。...

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loss-が及び着床前マウス胚の初期の細胞運命決定要因を調査するための機能獲得型のアプローチ

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初期マウス胚におけるマイクロRNAのプロファイリング手法について述べます。このプロトコルは、低細胞入力と小さなRNA濃縮の課題を克服します。このアッセイは、初期マウス胚の異なる細胞系統におけるmiRNA発現の経時変化を分析するために使用することができる。...

初期マウス胚からのシーケンシングのための小型RNAライブラリーの調製

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学ぶクロマチン免疫沈降法を用いたマウスE8.5胚における組織特異的遺伝子のタンパク質-DNA相互作用解析。この手法は発生生物学における分化プログラムの理解に貢献します。

初期段階のマウス胚を用いて組織特異的遺伝子のためのクロマチン免疫沈降アッセイ

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