初期段階のマウス胚を用いて組織特異的遺伝子のためのクロマチン免疫沈降アッセイ

この手順の目的は、クロマチン免疫沈降（ChIP）アッセイに使用するためのマウス胚（E 8.5）を単離することです。まず、マウス胚を単離して単一細胞懸濁液を調製します。次に、ゲノムDNAに結合しているタンパク質を化学的に架橋し、その後、超音波処理によってDNAを断片化します。

本手順の第3ステップは、タンパク質・クロマチン複合体を免疫共沈させ、精製DNAを単離することです。手順の最終ステップでは、免疫共沈により精製されたDNAを、従来のPCRまたは定量リアルタイムPCRを用いて解析します。最終的に、発生中の組織や器官において分化プログラムが開始される際、分化特異的遺伝子の調節配列とタンパク質との相互作用を示す結果を得ることができます。

本学期では、分化特異的遺伝子が転写能を獲得する際に、その調節配列と相互作用する調節因子の同定を通じて、胚発生中の分化プログラムの開始に関する重要な疑問への回答を得ることができます。この手順を開始するために、胚齢8.5日のマウスを犠牲にし、子宮角を摘出します。承認済みのプロトコルに従い、ハサミを用いて組織を新鮮な切片用培地を含むペトリ皿に移します。

過剰な出血を避けるため、各着床部位を個別に切り出し、新鮮な解剖用培地を入れたシャーレに入れます。ピンセットを用いて、各着床部位から子宮層を取り除き、脱落膜を露出させます。ピンセットを使って個々の胚を分離します。この発達段階において、胚は壁側卵黄嚢（脱落膜組織に接している）、内臓側卵黄嚢、および羊膜に囲まれています。

羊膜は胚に直接接している透明な膜です。卵黄嚢臓側葉は羊膜と卵黄嚢壁側葉の間に位置し、8.5日から9.5日の胚では、胚に栄養を供給する顕著な血管が存在するため、容易に識別できます。それぞれの胚を周囲の膜から取り出し、過剰な血液を除去するため、解剖用培地を入れた新しいプレートに個別に移します。

その後、各胚を200 µLの解剖用培地 containing 200 µLの解剖用培地を含む1.5 mLのエッペンチューブに移します。単離した胚のホモジナイズは、各胚が入ったエッペンチューブに200 µLのコラゲナーゼ type II 溶液を加えることから始めます。

サンプルを37 °Cのシェーカーで100 RPMで20分間、穏やかに振盪させます。次に、ピペッティングして細胞の凝集塊を分散させ、サンプルを再懸濁します。この細胞懸濁液を、1.5 mL エッペンドルフチューブの上に配置したメッシュサイズ 40 µm の滅菌済みセルストレーナーの上に適用します。

室温の1X DPBS 600 µLをセルストレーナーの上部に直ちに加えて分離を完了させます。懸濁液のろ過後、セルストレーナーを廃棄し、サンプルを4°C、4,000 Gで5分間遠心分離します。遠心分離後、上清を廃棄します。

各ペレットを室温の1X DPBS 1 mLに懸濁させます。次に、サンプルを室温で4,000 Gで1分間遠心分離します。2回目に上清を捨てた後、各ペレットを室温の解離培地200 µLで再懸濁し、200 µLのサンプルに37%ホルムアルデヒド5.6 µLを加えて、最終濃度が1%ホルムアルデヒドになるようにクロマチンを架橋します。

サンプルを室温で10分間インキュベートした後、4°Cで3分間、4,000 Gで遠心分離し、上清を捨てます。80 µL/mLのプロテアーゼ阻害剤カクテル（PIC）を含む冷えた1X DPBSで細胞を再懸濁します。その後、サンプルを4°Cで3分間、4,000 Gで遠心分離します。

上清を廃棄した後、サンプルを-80°Cで冷凍保存することができ、超音波処理を行うまで数ヶ月間安定して保存可能です。冷凍した細胞ペレットを氷上で解凍するか、前ステップのペレットを氷上に置きます。細胞ペレットを室温のSDS溶解バッファー100 µLで再懸濁させます。さらに室温のSDS溶解バッファー100 µLを加え、ピペッティングと転倒混和によってサンプルを再懸濁させます。

細胞懸濁液を氷上で10分間インキュベートします。インキュベーション後、アパレーターを設定し、架橋DNAを200から500塩基対の範囲でせん断します。本デモンストレーションでは、Diogenomics社製Rupture UCD 200を使用しています。

氷泥で囲んだ状態でサンプルをソニケーションします。温度が4 °C以上に上昇したり、凍結したりしないように注意してください。ソニケーション後のサンプルを、4 °Cで14,000 Gにて10分間遠心分離します。

上清を、氷上で予冷した新しいeend DPHチューブに移します。超音波処理したサンプルを最大5つの分注分に分けます。1つの分注分は、架橋解除用の入力サンプルとして保存するため、−20°Cで保存します。

次に、バッファー800 µLあたり1 µLのPICを直前に追加したチップ希釈バッファーを用いて、他の分注サンプルを10倍に希釈します。まず、チップアッセイタンパク質に使用する抗体に基づき、プレクリーニングに使用するAero速度を決定してください。ここでは、チップに使用する抗体がラビット抗体であるため、Aビーズを使用しています。

50%サモン精子DNAおよびタンパク質を75 µL加え、希釈した上清をプレクリアします。4°Cで1時間、回転させながらインキュベートします。インキュベーション後、サンプルを4°Cで2,500 Gで1分間遠心分離します。上清を新しい冷却済みのEPチューブに移します。

サンプルあたり4 µgの抗体をプレクリア済みのEloquaに加え、4 °Cで回転させながら一晩インキュベートします。まず、各サンプルに60 µLのサケ精子DNAタンパク質Aerosビーズ懸濁液を加え、4 °Cで回転させながら1時間インキュベートします。その後、サンプルを4 °C、1000 ×gで1分間遠心分離します。

遠心分離後、上清を注意深く取り除いて廃棄し、DNA-タンパク質ビーズ複合体を氷上に保持します。書面でのプロトコルに従い、バッファー1から4を用いてペレットを再懸濁および洗浄します。

各洗浄は、回転させた状態で5分間のインキュベーションを行い、続いて1000 Gで1分間遠心分離し、洗浄後の上清を除去することで構成されます。洗浄後のクロマチンタンパク質ビーズ複合体を、新しく調製した溶出バッファー250 µLに再懸濁させて、クロマチン抗体複合体を溶出させます。各サンプルを5秒間激しくボルテックスし、その後、回転させた状態で室温で15分間インキュベートし、続いて2,500 Gで1分間遠心分離します。室温で、各溶出液を新しいEPチューブに移します。

溶出操作を繰り返し、各サンプルの溶出液を同じエッペンドルフチューブに回収します。架橋を切断するため、500 µLの溶出液あたり20 µLの5 M 塩化ナトリウムを添加します。あらかじめ確保しておいたインプットコントロールには、1 mLあたり40 µLの5 M 塩化ナトリウムを添加します。

EITを65 °Cの水槽で4時間加熱します。DNA断片のサイズを確認するため、各サンプル10 µLを、0.1から1 kbをカバーするサイズマーカーと共に2%アガロースゲル上のインプットコントロールに負荷し、一晩泳動します。DNAはシャープなバンドではなく、スマアとして現れます。

Kaya Quick Gel Extraction Kitを用いて、各500 µLのサンプルからDNAを回収します。まず、Kaya Quick Spin Column内のシリカメンブレンへのDNA吸着を最適化するために、600 µLのQGバッファーを加えます。次に、カラムにロードする前に200 µLのイソプロパノールを加えます。混合物を確認し、SDSの沈殿が生じていないか判断してください。

SDSの沈殿が生じた場合は、沈殿物が消失するまでサンプルを42 °Cのウォーターバスで加温してください。その後、サンプルをカラムに適用し、メーカーの指示に従ってDNAを溶出させます。SDSはPCRTポリメラーゼの活性を阻害する可能性があるため、PCRを行う前に完全に除去する必要があります。

各DNAサンプルを氷上でインキュベートして残留SDSを沈殿させ、4°Cで14,000 Gにて1分間遠心分離します。SANEを新しいエッペンドルフチューブに移します。DNA EITは、従来のPCRまたは、解析する各配列に特異的なプライマーを用いた定量リアルタイムPCR（QPCR）によって検出可能です。1回のPCRまたはQPCR反応につき、全DNA IITから5～10 µLを使用してください。PCRおよびQPCRの条件は異なります。

ただし、出発物質の量が限られているため、従来のPCR検出では追加のPCRサイクルが必要となります。まずは40サイクルから開始し、必要に応じて調整してください。本プロトコルを用いて、E 8.5およびE 9.5の両方の胚からチップ処理が行われました。チップで精製されたDNAは、従来のPCRおよび定量リアルタイムPCRによって分析されました。

結果から、E 8.5およびE 9.5胚の筋分化およびプロモーターにおいて、筋分化および調節因子が存在することが示されました。対照的に、筋分化が発現していないoak sacでは、筋分化および筋分化プロモーターへの結合は認められませんでした。筋分化結合部位に一致する配列を含むインターフェロンガンマプロモーターを陰性配列コントロールとして使用したところ、予想通り、テストしたどの組織サンプルにおいても、筋分化はインターフェロンガンマプロモーターに結合していませんでした。

これらの結果は、myo Geninがこれらの段階の体節で特異的に発現していることから、MyogenicがE 8.5およびE 9.5胚の体節におけるMyogenicプロモーターに結合していることを示しています。このビデオを視聴することで、発生中の組織における組織特異的遺伝子に見出される調節因子を同定するための、E 8.5マウス胚の分離およびクロマチン沈降アッセイに向けた調製方法について十分に理解できるはずです。