Name: 廃棄されたヒト胎児脳組織から神経幹細胞の生成 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-05-25T12:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 29 s
Description: 学ぶ 廃棄されたヒト胎児前頭皮質組織から神経幹細胞を分離・培養する方法。神経球の形成、増殖、分化を通じて神経疾患の病態や薬理学的有効性を評価する研究プラットフォームを構築できます。

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HD054347とVLSへNS063997 - 01：この作品は、国立衛生研究所によって部分的にサポートされていました。この作品はまた、保健契約＃C024324 VLSへのニューヨーク国務省を通じて、エンパイアステート幹細胞の基金によって部分的にサポートされていました。ご意見は、ここに表明し、執筆者の個人的な見解であり、必ずしもエンパイアステート幹細胞委員会、ニューヨーク州保健局、または、ニューヨーク州の見解を反映するものではありません。 VLSはドリスデューク臨床科学発達受賞者です。我々はまた、抗O1、抗O4抗体の彼の贈り物のために教授ティモシーVartanianに感謝。

1。解剖および神経幹細胞培養の維持のためのソリューションと材料の準備<ol><li>事前に100mlの解剖媒体（KNOCKOUT DMEM/F12、Invitogen）を準備して冷蔵庫に。 </li><li> Prepare100 mlの培地（ステムプロNSC SFM、Invitrogen社）と37℃保管℃の水浴でC。 </li><li>細胞の長期凍結保存のための細胞凍結培地を（KNOCKOUT DMEM/F12 +10％FBS + 5％DMSO）の準備。 </li><li>必要に応じて、組織固定のために4％パラホルムアルデヒド（PFA）を準備する。 </li><li>ハンドル付き滅菌、高圧蒸気滅菌ピンセットとメスのブレードは、解剖のために使用されます。 </li><li>ピペットの銃を脇に置いて、10 mlの転送ピペット、および解離は40μMのセルストレーナー（BDファルコン352340）。 </li><li>組織のストレージおよび凍結細胞のための凍結バイアル（BD）のために解剖のためのいくつかの10cmの培養皿（BD）、解離の50 ml遠心チューブ（BD）、1.5 mlの遠心チューブを脇に置きます。 </li></ol> 2。人間の胎児の脳からヒト神経幹細胞を単離する<ol><li>すぐに胎児の終了後に実行可能な組織の収穫は、手続きの成功に不可欠です。選択科目の手順については、サンプルを取得するタイミングは、胎児の死亡の後の時間を最小化するように事前に配置することができます。受胎産物は、2時間後にプロシージャ内で収穫されますが、理想的には数分以内に選択科目の手続きに達成することができます。胎児組織は、しばしば断片化されています。しかし、一般的には脳のかなりの部分は、視覚的に識別するためそのまま残ります。在胎週数（GA）の制限事項が制定法によって決定されますが、18〜22週GAの間にこのプロトコルを使用して行われている。 </li><li>胎児の脳を氷冷KNOCKOUT DMEM/F12ソリューションを含む10mlのペトリ皿に配置されます。解剖学的ランドマークが皮質の異なる部分を識別します。前頭葉と頭頂後頭野は中心溝とシルビウス裂の外挿した交点が配向している。ための境界心室はそのままと破損していないように注意しながら、中心溝の前部前頭葉皮質からと外科ブレードでシルビウス裂の境界に沿って組織を細かく分析。 </li><li>前頭皮質の区切られたブロックからの残留血液および髄膜を取り外します。サンプルの品質が十分であれば、それは様々な目的のためにいくつかの小さなサンプルにブロックを分析するのに最適です。セクション（PFA、4％パラホルムアルデヒドで固定）とタンパク質/ mRNAのアッセイ（高速-80℃で凍結）。 </li><li> 50 ml遠心チューブに、選択された脳のブロックを転送し、組織の体積の約3倍で、氷冷KNOCKOUT DMEM/F12ソリューションを追加します。すべての組織が（一般的に20〜30倍）断片化し、単一または近くに、単一のセルを取得するために40μmのセルストレーナー（BDファルコン352340）を介して細胞をフィルタリングするようになるまでゆっくりと10 mlの転送ピペットで機械的なピペッティングにより組織を解離するサスペンション。 </li><li> 5分間2000rpmで細胞懸濁液と室温を遠心、10 mlの新鮮な暖かい培地（ステムプロNSC SFM）に細胞ペレットを再懸濁し、そして血球計算盤で細胞数を数える。 </li><li>それぞれ25cm 2の培養フラスコに5ミリリットル暖かい培地を追加し、各フラスコに2X10 6細胞を移す。培養物は、分析前に1週間、37℃/ 5％CO 2インキュベーター中で維持されます。さらに文化や実験のために週に一度half培養液を交換する。 </li></ol> 3。さらなる特徴またはexperimentationsのための神経幹細胞のManipulaton <ol><li>ニューロスフェアは、通常200〜400μmの間の範囲のNSCの直径推奨培養条件下で1〜2週間で形成する。この段階でニューロスフェアは単一細胞を得るために15分間37℃で、カルシウムとマグネシウムを含まないハンクス培地（ハンクス）に0.2 g / LのEDTA ° Cで解離させることができる。細胞懸濁液を新鮮なハンクスにすすぎ、2000回転、で紡糸、とサブカルチャーのための暖かい培地中で白い色を保ちされています。 </li><li>分化を開始するには、解離細胞はカバースリップ当たり1X10 5細胞（24mmX24mm）の密度でpoly-D-lysine/laminin 1コーティングカバーガラス上に播種されています。オリゴデンドロサイト分化がためにKNOCKOUT DMEM/F12（Invitrogen社、メイン、MD）2パーセントB27（50X、Invitrogen社、メイン、MD）+10 ng / mlのbFGFを100 ng / mlのSHH + 10ng/ml PDGF - AAで細胞を維持することによって達成され2日は、その後、別の5日間増殖因子なしで同じ培地に切り替え。神経分化は7日のノックアウトでDMEM/F12 2パーセントB27を（50X）細胞を維持することによって達成される。アストロサイト分化が週にKNOCKOUT DMEM/F12 1パーセントFBSで細胞を培養することによって行われます。 </li><li>遺伝子による神経幹細胞のトランスフェクションは、予め形成されたニューロスフェアから解離細胞で行うことができます。ここで、我々は、電気穿孔法によりEGFP - C1をトランスフェクトした神経幹細胞を示した。 EGFP - C1構造のエレクトロポレーションは、マウス神経幹細胞（VPG -用AMAXA Nucleofectorキットを使用して行われました会社の命令に続くAMAXA Nucleofectorデバイス（ロンザAAD - 1001）と1004）、。一言で言えば、1 X 10 6細胞を5μgのDNAを100μlのトランスフェクション培地と混合し、パルスのエレクトロポレーション後、細胞はさらに培養用培地を維持する神経幹細胞に再懸濁した。トランスフェクションされた細胞の分化は、ステップ3.2で説明した同じ手順に従って、エレクトロポレーション後、ニューロスフェア3-4日の解離で処理した。 </li></ol> 4。凍結神経幹細胞とサブカルチャー<ol><li>解離細胞懸濁液は1X10 7細胞/バイアル/ mlの濃度で遠心分離し、凍結培地に再懸濁する。徐々に-20℃、-80で細胞を凍結° C、長い時間の貯蔵のために液体窒素に移す。 </li><li>細胞は、高速37℃の水浴で解凍し、中に再懸濁した凍結培地を除去するため遠心分離洗浄のための血清DMEM/F12 +10％を、加温し、温めておいた培地に再懸濁する。 </li></ol> 5。代表的な結果： 18週で正常胎児から神経幹細胞は在胎週数が記載される方法およびニューロスフェアが丸い、滑らかな境界線とはかなり均一なサイズ（Fig.2A）と一週間後に見られる以下の培養した。これらのニューロスフェアは、EGFP - C1または他の構築物でトランスフェクトし、蛍光顕微鏡（図2b、）で追跡することができる。確立されたニューロスフェアは、EDTAとの解離とコーティングされたカバースリップ上に分散した細胞として播種した。それぞれのプロトコルの下で分化した細胞を4％parafamaldehydeで固定し、異なる細胞タイプ特異的なマーカーで染色した。多能は、ニューロン（Fig2C、D、ローダミン）アストロサイトを示すマーカーの発現（Fig2E、F、ローダミン）、オリゴデンドロサイト（Fig2G、H、ローダミン）で観察される。 EGFPのエレクトロポレーションを受けていない細胞はまた、異なる細胞型に分化して異なる細胞特異的なマーカーで染色した。多能は（Fig3C、ローダミン及びFig3D、フルオレセイン）アストロサイト（Fig3A、B、フルオレセイン）ニューロンを示すマーカーとオリゴデンドロサイト（Fig3E、F、ローダミン）の発現が観察される。 <img src="/files/ftp_upload/2681/2681fig1.jpg" alt="図1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図1"> 図1。破棄されたヒト胎児脳から神経幹細胞を分離する実験手順の概略図<img src="/files/ftp_upload/2681/2681fig2.jpg" alt="図2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図2"> 図2。 試験管内で propogated未分化および分化したヒト神経細胞。 （A）ニューロスフェアは、滑らかな、円形の境界線を示し、1週間以上の培養後の急速な成長を位相差顕微鏡の下に表示されます。 （B）、様々なプラスミド及び構造の導入はトランスフェクションによって達成することができます。 EGFP - C1トランスフェクション後3日には、複数のセルはフルオレセインの免疫染色と蛍光顕微鏡下で見られるように緑色蛍光タンパク質の発現を示す。 EGFP - C1トランスフェクションしたニューロスフェアは、ニューロン（C、D）、アストロサイト（E、F）、オリゴデンドロサイト（G、H）に異なる条件下で解離し、分化しており、ローダミンの蛍光下で見る。同時に、トランスフェクトされたEGFP陽性細胞はフルオレセイン蛍光の下に表示されます。トランスフェクトした細胞（白矢印の頭）はトランスフェクトされていない細胞（白矢印）と区別がつかない。細胞核をHoechst33342で染色されています。スケールバーは用は200μm、BとCHの場合は25ミクロンでは100μmです。 <img src="/files/ftp_upload/2681/2681fig3.jpg" alt="図3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図3"> 図3。トランスフェクションなしのニューロスフェアは神経細胞（A、B、フルオレセイン）、アストロサイト（C、ローダミン、D、フルオレセイン）およびオリゴデンドロサイト（E、F、ローダミン）への異なる条件下で解離と区別されています。細胞核をHoechst33342で染色されています。スケールバーは、AFは25μmです。

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</ol>

利害の衝突は宣言されません。

文化新鮮な組織と生ヒト細胞株に向けたさまざまなアプローチがある。歴史的に、新鮮な組織を採取され、中枢神経系における種々の細胞型を生成するために直ちに培養。このアプローチは、しかしはっきりと得られたヒトサンプルの場合には、通常非常に小さいことができるサンプルの数によって制限されます。操作の最小限の度合いを考えると、新鮮な培養神経細胞では、拡張培養から潜在的なアーティファクトを制限することにより、最も信頼性の高い実験系を提供しています。限られた供給は、様々な癌遺伝子12、13の挿入することによって不死化したヒト細胞株を生成する第二のアプローチにつながった。このアプローチに対する懸念は、これらの細胞の発癌性操作は、セルのプロパティを変更することを可能に横たわっていた。また、ヒト細胞株を生成するための根拠の一部は、様々なヒト疾患の移植治療の可能性だった。不死化細胞株は癌の成長の危険の素因となる可能性があります。これらの細胞株への利点は、線の均一性、脳の領域に内在する様々な神経細胞およびグリア表現型を採用する能力、そして文化を大量に生成するのが容易であることです。潜在的な発癌性の限界を克服するために、様々なアプローチは、培養...

<table border="1"><tbody><tr><th>試薬の名前</th><th>会社</th><th>カタログ番号</th><th>コメント（省略可能） </th></tr><tr><td> KNOCKOUT DMEM/F12 </td><td>インビトロジェン</td><td> 12660-012 </td><td>解離培地</td></tr><tr><td>幹プロNSC SFM </td><td>インビトロジェン</td><td> A10509 - 01 </td><td>培地</td></tr><tr><td>ウシ胎仔血清</td><td>インビトロジェン</td><td> 10091-148 </td><td>凍結媒体</td></tr><tr><td>ハンクス溶液（-のCa 2 +、 -のMg 2 +） </td><td>インビトロジェン</td><td> 14175-095 </td><td>解離培地</td></tr><tr><td> DMSO </td><td>シグマアルドリッチ</td><td> D2650 </td><td>凍結媒体</td></tr><tr><td> EDTA </td><td>シグマアルドリッチ</td><td> 431788 </td><td>解離培地</td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> 158127 </td><td>固定液</td></tr><tr><td> bFGFの</td><td> R＆D </td><td> 234 - FSE </td><td>分化培地</td></tr><tr><td> SHH </td><td> R＆D </td><td> 1845 - SH </td><td>分化培地</td></tr><tr><td> PDGF - AA </td><td> R＆D </td><td> 221 - AA </td><td>分化培地</td></tr><tr><td> B27 </td><td>インビトロジェン</td><td> 17504-044 </td><td>分化培地</td></tr><tr><td>マウス抗MAP2 </td><td>シグマアルドリッチ</td><td> M2320 </td><td> 1:200 </td></tr><tr><td>ウサギ抗DCX </td><td>細胞シグナリング</td><td> 4604s </td><td> 1:200 </td></tr><tr><td>ウサギ抗GFAP </td><td> DAKO </td><td> Z0334 </td><td> 1:200 </td></tr><tr><td>ウサギ抗- S100B </td><td> DAKO </td><td> Z0311 </td><td> 1:200 </td></tr><tr><td>ウサギ抗- O1 </td><td>教授ティモシーVartanianの贈り物* </td><td></td><td>午前1時50分</td></tr><tr><td>ウサギ抗O4 </td><td>教授ティモシーVartanianのギフト* </td><td></td><td>午前1時50分</td></tr><tr><td> 40μmのセルストレーナー</td><td> BDファルコン</td><td> 352340 </td><td></td></tr></tbody></table> *ティモシーVartanian、MD、PhDは、神経と神経科、ワイルコーネル医科大学、ニューヨーク、アメリカ合衆国

廃棄されたヒト胎児脳組織から神経幹細胞の生成

Generation of Neural Stem Cells from Discarded Human Fetal Cortical Tissue

神経幹細胞（NSC）は、皮質板の開発中に脳室帯の神経上皮に沿って存在する。これらの初期の前駆細胞は、最終的に、中間前駆細胞を生じさせると後で、大脳皮質を形成する様々な神経細胞およびグリア細胞のサブタイプ。廃棄された正常な胎児組織からヒトNSCを（そのニューロスフェアと呼ばれる）を生成し、拡大する能力は、直接ヒトの正常なNSC開発1-5の機能的側面 ​​を研究するために使用する手段を提供します。このアプローチはまた、それによって前駆細胞増殖、遊走および分化6-9を変更する病気のプロセスを識別する機会を得た、既知の神経疾患からのNSCの世代に向けて送ることができます。我々は、高速化、アルツハイマー病の表現型10,11に貢献するかもしれない人間のダウン症候群のNSCでの病理学的メカニズムを識別するに焦点を当てている。 生体内でも、in vitroでのマウスモデルのどちらのヒト21番染色体上に位置する遺伝子の同一のレパートリーを複製することができます。 ここでは、中止された人間の胎児皮質から症候群のNSCをダウン分離し、文化の中で、それらを成長させる、シンプルで信頼性の高いメソッドを使用します。方法論は、ヒトNSCのめっき及び継代、限られた解剖学的ランドマーク、細胞ソーティングと解剖、組織の収穫の特定の側面を提供します。また、より選択的な細胞のサブタイプにヒトNSCの分化を誘導するためのいくつかの基本的なプロトコルを提供します。

捨てられた人間の胎児皮質組織から神経幹細胞の単離および培養上シンプルで信頼性の高い方法が記載されている。既知のヒト神経疾患から派生した培養物は、病理学、細胞及び分子過程の特性だけでなく、薬理学的有効性を評価するためのプラットフォームを提供するために使用することができます。

神経幹細胞（NSC）は、皮質板の発達過程において、脳室帯神経上皮に沿って存在しています。これらの初期前駆細胞は...

本手順の全体的な目的は、廃棄された前頭皮質組織からヒト神経幹細胞を単離することです。まず、ヒト胎児脳を解剖する前に、溶液と材料を事前に準備します。その後、単離した神経幹細胞の維持を行い、さらに増殖、特性評価、および実験を実施します。長期保存が可能であり、前駆細胞を神経細胞およびグリア細胞へと分化させるためのサブカルチャーの確立も可能です。最終的に、正常なCNS由来細胞の分化を特徴づけ、既知の神経疾患を持つCNS由来細胞の分化と比較することができます。本手法の意義は、あらゆるヒトCNS疾患の治療または診断への応用にまで及びます。この手法は、病理学的なSを評価し、特定の疾患に対する新薬の薬理学的有効性を判定するための、シンプルで信頼性の高いプラットフォームを提供します。多能性細胞は極めて価値が高いため、プロトコルを開始する前にすべての材料を準備しておく必要があります。サンプルの品質低下のリスクを最小限に抑えるため、冷却した解剖セット、37 °Cに温めた培養液、および長期保存用の冷却した細胞凍結保存液を準備しておいてください。解剖用の凍結保存について、細胞解離のために滅菌オートクレーブ済みのピンセットと、ハンドル付きのメス刃を用意します。ピペットガン、10 mL転送ピペット、および40 µmセルストレーナーを用意してください。準備が整ったら、解剖用に10 cm培養ディッシュを数枚取り分けておきます。解離用の50 milliliter遠心チューブ。組織保存用の1.5 milliliter遠心チューブおよび細胞凍結用の凍結バイアル。成功させるためには、18〜22週齢の生存組織を、採取可能となってから2時間以内に回収する必要があります。理想的には、計画的な処置後の回収をあらかじめ手配しておくことで、胎児組織が利用可能となってから数分以内に回収することができます。組織は断片化していることが多いですが、脳の大部分は無傷のまま残っています。氷冷した解剖用培地を満たした10 mLのペトリ皿に脳を回収してください。解剖学的な指標を用いて、皮質の異なる部位を特定します。前頭葉、頭頂葉、後頭葉の境界は、中心溝とシルビウス裂の推定交点によって方向付けられます。外科用メスを用いて、中心溝より前方かつシルビウス裂の境界に沿った前頭葉から組織を切り出します。脳室が損傷せず、完全な状態で保持されていることを確認してください。次に、切り出した前頭前皮質のブロックから、残血と髄膜を取り除きます。サンプルが細分化されすぎておらず、十分に大きい場合は、一部を組織学的解析およびタンパク質またはmRNAアッセイに使用できるよう、ブロックをいくつかの小さなサンプルに分節してください。次に、脳ブロックを50 milliliter遠心チューブに移し、組織体積の3倍量の氷冷解剖用培地を加えます。ピペットを用いて、

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

私たちは、人間の神経前駆細胞の大量供給と神経修復のための開発CNSにおける神経細胞の種類の導出を可能にする低分子化合物、と定義された条件の下で維持さ多能性ヒト胚性幹細胞から直接、神経芽細胞の誘導のためのプロトコルを確立している。...

小分子の誘導と多能性ヒト胚性幹細胞からヒト神経前駆細胞と神経細胞の効率的な導出

この動画では、ヒトの神経幹細胞をニューロスフェアから神経およびアストロサイト前駆細胞に分化させる方法を酵素処理と成長因子が豊富な培地で培養し、最終的に特殊な前駆細胞に成熟させる方法を示しています。...

ヒト神経幹細胞の神経前駆細胞とアストロサイト前駆細胞への分化

このビデオでは、神経幹細胞の接着と成長を促進するために、ポリオルニチンとラミニンでコーティングされたガラスカバースリップを準備する方法を説明しています。この手法には、シーケンシャルインキュベーションと洗浄が含まれ、ニューロンに見られる構造を模倣して、ニューロン細胞の成長と分化を促進する支持マトリックスの形成を促進します。...

ヒト神経幹細胞からの皮質錐体ニューロンの生成

成人脳から採取した神経幹細胞は神経系の発達の基礎研究から再生医療の潜在的な臨床応用を探索範囲の用途に利用が増加している。これは実験的な成果を鳴らす重要なこれらの細胞を成長させるために使用される分離と培養条件に厳密な制御を行う。...

大人の齧歯類の脳の従来の従来にない地域から神経幹細胞を増殖させる

このプロトコルは、単一の細胞懸濁液に解離することなく、球状の神経幹細胞および前駆細胞集合体の拡大を可能にする新たな機械的なチョッピング方法が記載されている。細胞/細胞接触を維持することは、40以上の継代するための迅速かつ安定的な成長を可能にします。...

ヒト神経の集合体のためのcGMP適用可能な展開法は、幹細胞および前駆細胞は、多能性幹細胞や胎児の脳組織由来

この方法は、直接末梢血細胞から濃縮造血前駆細胞からのヒト神経幹細胞を誘導するために開発された。...

末梢血造血前駆細胞からヒト神経幹細胞の直接誘導

成体の哺乳類の脊髄には、培養で単離および増殖可能な神経幹/前駆細胞(NSPC)が含まれています。このプロトコルは、ラットおよびヒト臓器移植ドナーからの成体脊髄の脳室周囲領域から生成されたNSPCの採取、単離、培養、および継代について説明しています。...

成体ラットおよびヒト脊髄の脳室周囲領域から神経幹/前駆細胞の単離

人工多能性幹細胞の生成は、自家移植の導出のための魅力的な展望を提供しています。しかし、多能性状態と面倒な再分化の進行はまだ臨床の翻訳を妨げます。ここでは、成人のヒト線維芽細胞の誘導および誘導神経前駆細胞への直接変換と神経系統へその後の分化を説明します。...

成人ヒト線維芽細胞の導出と拡張神経前駆細胞へのそれらの直接変換

E13マウス胚神経節隆起から顕微鏡下神経幹細胞の分離法を紹介します。...

マウス萌芽期の神経幹細胞の分離と培養

このプロトコルは、仙台ウイルス感染による神経幹細胞を誘導する末梢血単核細胞のリプログラミング、ドーパミン作動性ニューロンへのiNSCの分化、DA前駆体の一方的な病変への移植を提示するパーキンソン病マウスモデル、およびPD治療のためのiNSC由来DA前駆体の安全性および有効性の評価。...

末梢単核細胞からの誘導神経幹細胞の生成と移植研究におけるドーパミン作動性ニューロン前駆体への分化

我々は、再プログラム化された末梢血細胞から神経表現型を有する細胞を得るための遺伝子組換え非遺伝子組換え(GMフリー)法を提示する。新規ヒトGPI結合タンパク質にリンクされたシグナル伝達経路の活性化は、ヒト多能性幹細胞を得るための効率的なGMフリーの方法を明らかにする。...

血液由来神経細胞のGMフリー生成

学ぶ 廃棄されたヒト胎児前頭皮質組織から神経幹細胞を分離・培養する方法。神経球の形成、増殖、分化を通じて神経疾患の病態や薬理学的有効性を評価する研究プラットフォームを構築できます。

廃棄されたヒト胎児脳組織から神経幹細胞の生成

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