廃棄されたヒト胎児脳組織から神経幹細胞の生成

本手順の全体的な目的は、廃棄された前頭皮質組織からヒト神経幹細胞を単離することです。まず、ヒト胎児脳を解剖する前に、溶液と材料を事前に準備します。その後、単離した神経幹細胞の維持を行い、さらに増殖、特性評価、および実験を実施します。

長期保存が可能であり、前駆細胞を神経細胞およびグリア細胞へと分化させるためのサブカルチャーの確立も可能です。最終的に、正常なCNS由来細胞の分化を特徴づけ、既知の神経疾患を持つCNS由来細胞の分化と比較することができます。本手法の意義は、あらゆるヒトCNS疾患の治療または診断への応用にまで及びます。

この手法は、病理学的なSを評価し、特定の疾患に対する新薬の薬理学的有効性を判定するための、シンプルで信頼性の高いプラットフォームを提供します。多能性細胞は極めて価値が高いため、プロトコルを開始する前にすべての材料を準備しておく必要があります。サンプルの品質低下のリスクを最小限に抑えるため、冷却した解剖セット、37 °Cに温めた培養液、および長期保存用の冷却した細胞凍結保存液を準備しておいてください。

解剖用の凍結保存について、細胞解離のために滅菌オートクレーブ済みのピンセットと、ハンドル付きのメス刃を用意します。ピペットガン、10 mL転送ピペット、および40 µmセルストレーナーを用意してください。準備が整ったら、解剖用に10 cm培養ディッシュを数枚取り分けておきます。

解離用の50 milliliter遠心チューブ。組織保存用の1.5 milliliter遠心チューブおよび細胞凍結用の凍結バイアル。成功させるためには、18〜22週齢の生存組織を、採取可能となってから2時間以内に回収する必要があります。

理想的には、計画的な処置後の回収をあらかじめ手配しておくことで、胎児組織が利用可能となってから数分以内に回収することができます。組織は断片化していることが多いですが、脳の大部分は無傷のまま残っています。氷冷した解剖用培地を満たした10 mLのペトリ皿に脳を回収してください。

解剖学的な指標を用いて、皮質の異なる部位を特定します。前頭葉、頭頂葉、後頭葉の境界は、中心溝とシルビウス裂の推定交点によって方向付けられます。外科用メスを用いて、中心溝より前方かつシルビウス裂の境界に沿った前頭葉から組織を切り出します。

脳室が損傷せず、完全な状態で保持されていることを確認してください。次に、切り出した前頭前皮質のブロックから、残血と髄膜を取り除きます。サンプルが細分化されすぎておらず、十分に大きい場合は、一部を組織学的解析およびタンパク質またはmRNAアッセイに使用できるよう、ブロックをいくつかの小さなサンプルに分節してください。

次に、脳ブロックを50 milliliter遠心チューブに移し、組織体積の3倍量の氷冷解剖用培地を加えます。ピペットを用いて、すべての組織が断片化するまで優しく分散させます。細胞を完全に懸濁させるため、40 micromolarセルストレーナーでろ過します。

次に、細胞懸濁液を遠心分離し、細胞ペレットを10 millilitersの新鮮で温めた培地で再懸濁します。ヘモサイトメーターを用いて細胞数をカウントし、2 million cellsに相当する容量を算出します。その後、2 million cells分ずつの容量を25 centimeter四方の培養フラスコに移します。

5 mLの加温した培養液を用いて調製します。細胞を37 °C、5% CO2条件下で1週間維持してください。長期培養の場合は、週に1回、培地の半分を交換します。培養して1〜2週間経つと、通常、直径200〜400 µmのNSCからなるニューロスフィアが形成されます。

ニューロスフィアを単一細胞に解離させます。Hank's溶液中のEDTAで細胞を15分間インキュベートします。懸濁した細胞を継代準備するため、遠心分離して回収し、Hank's溶液で洗浄した後、温めた培地で細胞を再懸濁します。

分化を開始するために、解離させた細胞をポリリジンおよびラミニン1でコーティングしたカバーガラスに、1枚あたり100,000個の密度で播種し、30分間インキュベートします。これらの細胞は、オリゴデンドロサイト、ニューロン、またはアストロサイトへと容易に分化させることができます。

神経分化については、B 27を含む培地で細胞を7日間維持します。アストロサイト分化培養については、FBSを含む培地で細胞を7日間維持します。オリゴデンドロサイト分化については、増殖因子を含む修飾培地で細胞を2日間維持し、その後、同じ修飾培地から増殖因子を除いた状態でさらに5日間維持して幹細胞を保存します。

解離させた細胞懸濁液を遠心分離した後、1バイアルあたり1,000万個/mLの濃度になるように凍結保存液で再懸濁します。細胞を-20°Cで徐々に凍結させた後、長期保存のために-80°Cで凍結させます。その後、液体窒素に移行してください。

その後、細胞を37 °Cの水浴で急速解凍し、再懸濁させます。洗浄のため、10%血清を添加した加温D-M-E-M-F 12を用います。加温した細胞を遠心分離し、上清を吸引した後、加温した培地に再懸濁させます。

正常な胎児由来の中間神経幹細胞（妊娠18週）を、ニューロスフィアを形成させるために培養し、GFPをトランスフェクションしました。このニューロスフィアを分化させ、数種類の細胞型を形成させた後、細胞マーカーおよびルミンで固定・染色しました。

ニューロン、アストロサイト、およびオリゴデンドロサイトを示すマーカーの発現により、多能性が観察されます。このビデオを視聴することで、廃棄された前頭皮質組織からヒト神経幹細胞を単離、拡大、および操作する方法について十分な理解が得られるはずです。これらの領域は、ヒト皮質環境の疾患メカニズムを研究し、薬物治療剤の潜在的な有効性を検証するためのユニークな機会を提供します。