インフルエンザのためのDNAマイクロアレイ上ampliPHOX比色検出

次の実験の全体的な目標は、新しい迅速なシグナル増幅法を利用して、インフルエンザチップの低密度マイクロアレイプラットフォーム上のインフルエンザウイルスサブタイプを検出し、特性評価することです。これは、ビオチン化DTPを組み込み、5つのプライムホスポール末端を持つプライマーを使用して、インフルエンザRNA抽出物のマトリックス遺伝子セグメントと非構造遺伝子セグメントを増幅することで達成されます。PCRに続いて酵素消化と断片化を行い、短い一本鎖ビオチン化および増幅ウイルス産物を生成し、ハイブリダイゼーション後にアレイにハイブリダイズします。

Fox検出は、光重合を使用してハイブリダイゼーションが発生する大きなポリマースポットを成長させ、差動ハイブリダイゼーションパターンを使用してインフルエンザウイルスサブタイプを検出します。この手法が標準的な蛍光検出などの既存の方法と比較した場合の主な利点は、かなり安価で、蛍光と同様の分析感度で肉眼で見える迅速な結果が得られることです。ただし、この方法は普遍的な検出方法であるため、インフルエンザチップを使用したインフルエンザウイルスの特性評価に関する洞察を得ることができます。

Ampl Foxは、他のDNAやタンパク質ベースの低密度マイクロアレイなど、他のさまざまなシステムにも適用できます。理論的には、ビオチン化製品はamoxを使用して検出できるはずです。この手順を実演するのは、アソシエイトサイエンティストのAmber Taylor氏と、ここEndeavorの研究助手であるKevin Moulton氏で、どちらも過去数年間、Fox装置の開発と検出化学の中心的役割を果たしてきました。

ウイルスRNA抽出キットとメーカーのプロトコールを使用して、200マイクロリットルのウイルス分離物からウイルスRNAを抽出します。最終容量の60マイクロリットルを溶出し、抽出物をマイナス70°C以下で保存して後で使用します。次に、メーカーのプロトコルに従って、ICE上でR-T-P-C-Rマスターミックスを調製します。

ビオチン化DNTP混合物を使用して、マスターミックスに示されている濃度を含むインフルエンザチッププライマーミックスを添加します。各セットから1つのプライマーには、酵素消化を促進するために5つのプライムホスポール基が含まれている必要があります。インフルエンザAプライマーセットは1032塩基対の製品を生成し、インフルエンザBプライマーセットは811塩基ペアの製品を生成します。

18マイクロリットルのマスターミックスを短時間ボルテックスし、薄肉のPCRチューブに分配します。次に、各反応チューブに2マイクロリットルのRNAテンプレートを追加します。PCRチューブをサーマルサイクラーに移し、適切な膝立ち温度のサイクリングプロファイルを使用します。

このアッセイで使用したサイクリングプロファイルを以下に示します。PCR 反応ごとに 2.2 マイクロリットルの酵素反応バッファー、0.8 マイクロリットルのヌクレアーゼ遊離水、および 1.0 マイクロリットルのラムダ エキソヌクレアーゼ酵素を組み合わせて、酵素消化ミックスを調製します。サーマルサイクラーからサンプルを取り出し、各PCRチューブに4マイクロリットルを追加します。

サンプルをサーマルサイクラーに戻し、図のようにサーマルサイクラーを摂氏37度に15分間、続いて摂氏95度に10分間プログラムします。次に、ハイブリダイズするマイクロアレイの周囲にシングルユースハイブリダイゼーションウェルを適用します。次に、スライドを110ミリリットルの精製水でオービタルシェーカーで5分間洗います。

ティッシュペーパーをウェルの端にそっと触れてスライドを乾かします。22マイクロリットルの2×ハイブリダイゼーションバッファーを、断片化された一本鎖DNA産物のそれぞれと短時間混合し、40マイクロリットルをマイクロアレイウェルにピペットで移します。ハイブリダイゼーション後、スライドを湿度チャンバー内で1時間ハイブリダイズさせ、スライドを湿度チャンバーから取り出し、各スライドを2ミリリットルの洗浄バッファーで短時間すすぎます。

次に、オービタルシェーカーを使用して、110ミリリットルの洗浄バッファーAとBを別々の容器に加えます。スライドラックをバッファーAで60〜90RPMで洗浄します。これは、その後のすべての洗浄に使用される速度で1分間です。次に、スライドラックを洗浄バッファーAから取り外し、洗浄バッファーDで短時間すすぎます。

洗浄後、各スライドのアレイをティッシュワイプで静かに乾かし、乾燥させたスライドを湿度チャンバーに入れます。キツネカラーメトリック検出ステップの準備として、10マイクロリットルの振幅、20、2×振幅緩衝液のマイクロリットル、および10マイクロリットルの精製水を処理対象の各アレイに組み合わせ、40マイクロリットルのラベル混合物を各アレイに移し、標識反応を密閉された湿度チャンバー内で進行させる5分間、ハイブリダイゼーション中に、 容器に110ミリリットルの洗浄緩衝剤Cを準備します。標識後、直ちに各アレイを洗浄バッファーD.各スライドをスライドラックに置き、バッファー海洗浄後5分間オービタルシェーカー上でバッファーCを洗浄および洗浄し、精製水の容器にスライドラックを3回短時間浸した。

塩の残留物を取り除くには、前に示したようにアレイを乾燥させます。アレイは、写真のアクティベーションとイメージングが完了するまで暗いスライドボックスに保存しますが、これは24時間以内に完了する必要があります。次に、Amli Foxリーダーの電源を入れ、アレイサンプルを検出する前に、Amli viewソフトウェアが写真のアクティブ化の準備ができていることを確認します。

まず、簡単なキャリブレーション手順に従って、すべてのサンプルに最適な光活性化時間を決定します。1日の使用につき1回、その後、増幅液を室温に温め、短時間渦巻きさせてピペット3マイクロリットルの増幅エンハンサーを増幅バイアルに混合し、完全に渦巻きます。10秒間、40マイクロリットルのAmplify溶液を一度に1枚のスライドだけに均一に塗布し、気泡が存在しないことを確認します。

マイクロアレイスライドをのフォトアクティベーションベイに挿入します Amplifyリーダー。を選択して写真のアクティベーションを開始し、キャリブレーションプロセスで決定された写真のアクティベーション時間を使用してPLで開始しますview ソフトウェア。完了したら、マイクロアレイを2ミリリットルの精製水ですすいで、過剰な増幅を取り除き、透明なポリマー形成がターゲットDNAを含むスポットで発生しましたが、よりよく視覚化されます。

染色後、ポリマースポットを2分間乾燥させます。次に、アレイに2滴の赤を十分に分配し、染色を2分間進行させます 染色後、スライドを精製水で素早くすすぎ、前に示したように乾燥させた後、スライドをAmli Foxリーダーのイメージングベイに挿入し、Amliソフトウェアを使用して画像を収集し、結果を処理します。左の画像は、Amli Foxによる2009年の小説H one N one標本の検出を示しています。

右の画像は、共焦点蛍光マイクロアレイスキャナーによって生成された従来の蛍光を使用していますが、どちらの方法でも同じ全体的な検出パターンを簡単に確認できます。ただし、Amli Foxの結果は肉眼で見ることができます。これらの画像は、ヒト起源、H 3 N 2ヒト起源、H 1 N 1、ブタ起源、H 1 N 1、および検出可能なインフルエンザを欠く陰性のキツネアレイからのインフルエンザチップの結果を示しています。

青色で囲まれた配列2と3は、すべてのインフルエンザの信号を発します。Aサブタイプが示されていますが、右下の赤で囲まれた配列は、ブタの起源であるH1N1標本のシグナルのみを生成します。ネガティブな試料は、緑色で囲まれた内部制御シーケンス上のシグナルを示しており、R-T-P-C-R反応の阻害または失敗がないことを示しています。

バイアル抽出からAMOX検出、最終結果の解釈までの全プロセスを習得すれば、約6時間で完了します。Ampl Foxの検出部分(機器のキャリブレーションを含む)は、この手順に続いて約30分で完了します。パーシャルゲノムシーケンシングやフルゲノムシーケンシングなどの他の方法も、追加の疑問に答えるために行うことができます。

このインフルエンザアッセイは、特にユニークなハイブリダイゼーションパターンをもたらすサンプルの初期スクリーニングとして意図されています。検出は一般的なアッセイであるため、研究者が検出に付加価値を与える可能性のある新しく興味深い低密度マイクロアレイアプリケーションを見つけることを願っています。