絶縁型、ベンチレーテッド、および計装のマウス肺の特性評価は、拍動流を灌流

拍動性肺圧流の関係を研究する。このプロトコルは、マウスの肺を分離、換気、および灌流する方法を説明しています。気管は換気のために外科的に露出します。

その後、心臓と肺を分離し、肺動脈と左心房をカニューレで挿入できるようにします。その後、肺系が灌流されます。実験は、肺動脈の流れ、大きさ、波形、または周波数を変更することによって行われます。

結果として生じる肺動脈と左心房圧の波形が記録され、拍動性肺圧の流れの関係が実証されます。この手法がin vivo調製物などの既存の方法と比較した場合の主な利点は、圧力流の関係が変化することです。脈動性圧力流の関係は、容積状態、交感神経系の緊張、活動、および麻酔の影響の変化がない場合に取得できます。

また、ほとんどの孤立した肺製剤は、安定した圧力流の関係のみを測定しますが、私たちの技術では、拍動性の圧力流の関係を決定することができます。この方法は、肺血管疾患が拍動性肺血行動態にどのように影響するか、または大きな肺動脈硬化が右心室の後負荷にどのように影響するかなど、肺生理学の分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。心臓と肺を露出させ、カニューレを肺動脈に固定することは習得が難しいため、この方法を視覚的にデモンストレーションすることは非常に重要です。

器具からの過剰な圧力は肺に浮腫を引き起こす可能性があり、不適切なカニューレの配置は肺動脈を穿刺する可能性があります。実験を開始する前に、孤立した肺の換気と灌流に使用されるIL Oneシステムを準備する必要があります。チューブは圧力トランスデューサに接続する必要があります。

O 孤独なポンプと流量計 摂氏37度に温められた蒸留水でシステムを洗い流し、チューブ内の気泡を取り除きます。次に、Endur techポンプチューブに1%PBSをプライミングします。今はゼロです。

各P 75トランスデューサの圧力は、最初にバルブをIL Oneシステムに対して閉じ、そのバルブを大気に対して開くことによって行われます。次に、プラグSISアンプを使用して、動物を準備する前に圧力を自動的にゼロにし、セラミック多孔質ピースを蒸留水に浸してIO1セットアップを加湿します。マウスに麻酔をかけた後、前足をコルクボードに固定して手術のためにマウスを安定させます。

次に、胸に95%アルコールをスプレーします。ストレート鉗子で首の皮膚をつかみ、ストレートハサミで1センチの開口部を切ります。首の内側が露出したら、食道と気管を探しながら表在筋の白い腺組織を切り取ります。

食道と気管を両側と後方の組織から分離し、気管の周りに緩い縫合糸を結びます。気管をカニューレにするには、小さなハサミで小さなV字を慎重に片側に切ります。次に、鈍い鉗子を使用してマウスをIL oneシステムに持っていきます。

気管カニューレをつかみ、気管に滑り込ませます。カニューレを縫合糸で固定します。まず室内の空気で換気を開始し、胸部にアルコールをスプレーし、ストレート鉗子とストレートハサミを使用して皮膚を取り除きます。

胸骨に沿って皮膚を上向きに切ります。両側の皮膚を持ち上げ、下部の肋骨の線に沿って切ります。次に、ピンセットで剣状突起をつかみ、ボールチップはさみを使用して、胸骨の底に接する横隔膜に穴を開けます。

横隔膜をつかみ、リブから切り取ります。ボールチップハサミを使用して、剣状突起を再度把握し、ボールチップハサミを使用して、肺、心臓、または血管に損傷を与えることなく、肋骨を介して胸骨を慎重に切断します。心臓を露出させるには、左の肋骨をつかんで先端を切り落とします。

次に、右心室に0.1ミリリットルのヘパリンをゆっくりと注入します注射後、残りの肋骨を切り取ります。鉗子の背面または丸みを帯びた端を使用して、顕微鏡で肋骨を切断しながら、肺を肋骨からそっと押し離します。心臓の上の脂肪の腺組織を取り除きます。

ピンセットを使用してティッシュを引き離し、トリミングします。スプリングハサミで大動脈と肺動脈の周りに縫合糸を留置し、鈍いピンセットで心臓を優しくスプーンでスプーンで弄びます。抵抗はほとんどないはずです。

次に、緩い縫合糸をダブルスローで結びます。次に、下腹部を切り取ります。角度のついたハサミを使って、肋骨と背骨を切り落とします。

これにより、かなりの量の血液が流れます。Qチップを使用して流れを止めます。血流が停止したら、10 ミリリットルの RPMI で満たされたシリンジから 4 ミリリットルの RPMI で IL システムをプライミングします。

チューブに気泡が含まれていないことを再確認することをお勧めします。次に、頂点付近に小さなノッチを切って右心室をカニューレ状にし、カニューレエイムを右に挿入して肺動脈に到達します。プローブの先端は、肺動脈のほぼ透明な壁を通して見える必要があります。

次に、カニューレ、大動脈、肺動脈の周りの縫合糸を締めて、左心室にカニューレを挿入します。頂点に切り込みを入れ、カニューレを上に向けて左心房に挿入します。弁を見つけるにはわずかな圧力が必要な場合がありますが、一度見つかると、カニューレはすり抜けて縫合糸なしで固定されます。

10ミリリットルのシリンジからRPMIを毎分0.3ミリリットルで手動で注入し、流出チューブに流れを確認します。アウトフローチューブに流れがない場合は、左心室カニューレの位置を変えます。ただし、肺に流れがない場合は、肺動脈に漏れがある可能性が高いため、実験を中止します。

心臓が完全にカニューレ挿入されたので、60ミリリットルのシリンジをIL Oneシステムに接続します。定常流量ポンプを使用して、RPMI Perfuse 8を1分あたり1ミリリットルの速度で注入します。初期灌流中に漏れがないか確認してください。

さらに2分間肺を徐々に灌流すると、その間に肺が白くなります。脈動流スタディ用。まず、単独ポンプのピストン排気量を希望のレベルに設定します。

次に、定常流量を設定します。次に、オスリポンプのバルブを開き、オスリフロープロファイルを実行する直前にデータの記録を開始します。完了したら、データ出力ファイルを開き、最初の試行からの実験フローに基づいて実験フローをプロットします。

各周波数で振動ポンプのピストン変位を調整して、Q maxが希望どおりになるようにします。換気を一定の圧力で保持する 定常流量試験のデータ収集中は、バルブを単独ポンプに閉じ、定常流量を希望のレベルに設定します。データの記録を開始し、定常フロープロトコルをステップ実行します。

試行間の各流量で少なくとも10秒間のデータ収集。流量を0.5ミリリットル/分にリセットします。データ収集中は、換気を一定の圧力に保ってください。

左心房圧試験をゼロにしたい場合は、試験中に流出チューブを取り外します。気道チューブ内のRPMIに注意してください。RPMIは気道圧力トランスデューサーに到達させてはなりません。そうしないと、気道圧力トランスデューサーが損傷します。

これは、上段にフローQがあり、さまざまな条件下で2行目に肺動脈と左心房圧が生じる定常流灌流の結果です。最初の 2 つのパネルでは、アウトフロー チューブが所定の位置にあったため、Q とともに左心房圧が増減し、最初のパネルは終末の空気圧、吸気圧、2 番目のパネルは呼気終末圧の空気圧を示しています。次に、左心房圧が一定でQに依存しないようにチューブを取り外し、次に、左心房圧が高くなるように出口チューブの高さを手動で調整しました。

しかし、再びQとは無関係に、最初のパネルは端の空気圧、吸気圧を示し、2番目のパネルは端の空気圧を示しています。呼気圧。結果として得られる、各ケースの安定した肺動脈圧力流量の関係は、圧力対流量をプロットすることで取得できます。

これは、トップパネルにフローQを使用した拍動流灌流の結果と、その結果として生じる肺動脈、左心房、および空気圧の結果です。下部パネルにあります。これらの拍動性肺圧流の関係から、右心室の総後負荷を反映する肺血管インピーダンスを計算できます。

一度習得すると、このテクニックは20〜30分で完了します。この手順を試みるときは、手が安定するように時間をかけてリラックスすることが重要です。肺が十分に灌流されたら、難しい部分は終わりです。

この手順に続いて、肺組織に対する組織学や生化学的アッセイなどの他の手法を実行して、肺の拍動圧力フロー関係で観察された変化の原因となる分子メカニズムなどの追加の質問に答えることができます。この技術は、肺生理学の分野の研究者が、遺伝子組み換えマウスを使用して肺血管疾患の発症と進行における特定の遺伝子とタンパク質の役割を探求する道を開きます。