Name: 絶縁型、ベンチレーテッド、および計装のマウス肺の特性評価は、拍動流を灌流 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-04-29T17:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 2 s
Description: 学ぶマウス肺の絶縁・換気・灌流法による拍動性肺血管圧力-血流関係の測定。右心室後負荷の定量化と肺血管生理学研究に有用な実験手法を解説します。

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この研究は、健康補助金R01HL086939（NCC）の国立研究所によってサポートされていました。

このプロトコルでは、以前に拍動性の肺血管圧 - 流量の関係（Tuchscherer、ウェブスター、＆チェスラー、2006肺塞栓症と慢性的な低酸素の影響を定量化するために使用されている隔離された、換気、灌流マウスの肺の準備を示しています。Tuchschererら、2007）。簡単に言うと、マウスの肺は、外科的に加熱されたチャンバー内に設置、周囲の組織から単離された（IL - 1、ハーバード装置、ホリストン、MA）されていると換気（換気制御モジュール（VCM）- Rタイマカウンタモジュール（TCM）と、ハーバード装置）。肺血管系は、定常流波形または高頻度振動ポンプ（ボーズエレクトロフォース、エデンを生成するためにシリンジポンプ（コール - パーマー、バーノンヒルズ、イリノイ州）を使用して、3.5％フィコールで加熱されたRPMI 1640細胞培養培地を灌流され拍動性の肺血流波形を作成するには、シリンジポンプと並列にプレーリー、ミネソタ州）。圧力変換器（P75、ハーバード大学の装置）は瞬時肺動脈圧（PAP）と左心房圧（LAP）を測定する。瞬時流量（Q）はインライン流量計（遷音速システムズ、（株）、イサカ、ニューヨーク州）で測定されます。脈動圧力流量の関係は、肺血管の生理学および病理学と右心室の後負荷への洞察を提供するこれらの測定値から導出されています。 1。設備： <ol><li>セットアップマウスの人工呼吸器を含む絶縁型肺</li><li> LabViewのプログラムとデータ収集システムとコンピュータ</li><li>灌流液の流れの2つの圧力変換器と流量計</li><li>気道のフロー用圧力トランスデューサーと流量計（pnemotachometer） </li><li>勝利のテストプログラムと、高頻度振動ポンプとコンピュータ</li><li>ブーム/ズーム顕微鏡、ランプ</li><li> IL - 1システム用高出力ポンプと熱浴</li></ol> 2。 IL - 1システムの準備<ol><li> ℃の加熱浴で37に加熱蒸留水は、IL - 1システムの内部に循環される。 </li><li>すべてのポンプ、トランスデューサ及びIL - 1カニューレは、清潔なチューブを介して接続されていると、すべてのチューブを37に加熱蒸留水℃でフラッシュされます肺と原因の浮腫に旅行ができる空気の気泡が、、削除する必要があります。振動流ポンプからの流量センサーへと流量センサからの肺動脈カニューレのチューブを1％PBSでフラッシュされます。 </li><li> P75圧力トランスデューサは、カニューレにバルブを閉じて大気にバルブを開き、[PLUGSYSアンプで自動ゼロボタンを押すことによってゼロにされます。その後、大気にバルブが閉じられ、カニューレにバルブが開かれる。 </li><li> IL - 1システムの換気経路のセラミック多孔質部分は湿気を提供するために湿らされています。 </li></ol> 3。ソリューション<ol><li>ボリュームはFicoll - RPMI液および滅菌フィルターメディアで3.5％を準備する。メディアをフィルタリングすると、誤って肺に塞栓可能性がない大きな粒子がないことを確認します。滅菌メディアを使用すると、肺に発展突然浮腫の可能性を減らすことができます。各実験試行のためのRPMIで手術一60mlのシリンジ用RPMIで1つの10 mlの注射器を埋める。 37℃の水浴中で灌流液を加熱する。 </li><li>マウスのヘパリン500IU/100g体重（おおよそ）の1mlを準備する。ヘパリン塩は158IU/mgている。 〜25 gのマウスの場合は、小さなマイクロ遠心チューブに1ミリリットルPBS溶液で1.25mg/kgのヘパリン塩を混ぜる。 </li></ol> 4。換気マウス<ol><li>マウスへのキログラム当たりの溶液中でのペントバルビタール150mgの腹腔内注射した後、足にハードピンチを実行することにより、深い麻酔を確認してください。何の反応がない場合は、安定性のためにコルクボードに、その前足を固定することによって、手術のためにマウスを準備する。注：実験麻酔の深さを通しては慎重に動物を観察することによって監視されます。前足と頻繁に切開のピンが侵害刺激として機能する、への応答の欠如は、動物が麻酔の外科的平面に残っていることを確認します。 </li><li>毛皮の下にウェットと首の皮膚をつかむためにまっすぐに鉗子を使用するために95％アルコールで胸にスプレーします。まっすぐはさみを使って皮膚に開いて1cmを切る。 </li><li>首の内側が露出されると、食道と気管を探して、すべての白腺組織と表面的な筋肉を取り除く。両側と後方での​​組織から食道と気管を分離します。 </li><li>気管の下に小さな曲がりの鉗子を挿入し、反対側の縫合糸の一部をつかむ。気管の下に縫合糸を引いて、緩やかな外科医の結び目を作る。縫合糸を締めたり、結び方をしないでください。 </li><li>小さなハサミと気管の小さな角度"v"をカット。気管を介してすべての道をカットしないでください。加熱されたIL - 1システムにコルクのボードとマウスを動かします。 two鈍鉗子を使用して、気管カニューレと"V"下気管をつかむ。その後、気管切開術を施すに気管カニューレをスライドさせ"V"開口部から個。気管周囲縫合と気管の内部にカニューレを確保するために気管カニューレを締めます。結び目を作る。 </li><li>部屋の空気を換気（50％のインスピレーション、深いインスピレーションと90呼吸/分に、）を開始。 </li></ol> 5。通気性のよいマウスを灌流 5.1。ヘパリンを注入するために右心室にアクセス<ol><li>再びアルコールスプレーは、マウスの胸の毛皮を再度湿らせる。ストレートピンセットストレートはさみを使用して肋骨上の胸の皮膚のすべてを削除します。胸骨に沿って上向きにカット。各側面の皮膚を持ち上げ、下部肋骨の行の次の皮膚をカット。 </li><li>ピンセットで胸骨の一番下にある剣状突起をつかみ、まっすぐにハサミを使って横隔膜に穴を開ける。ピンセットでダイアフラムを取得し、肋骨からそれを切り取る。 </li><li>肺を切らないように注意しながら、ピンセット（左手）で再び剣状突起を把握し、胸骨を切断するためにボールチップ、角度のハサミを使用し、リブを介して、心臓や血管は、（上でボールチップを使用してくださいあなたを導くた​​めにはさみ）。そこに血なりますが、限りハサミの刃先を胸骨に反しているとして、心臓や肺がカットされることはありません。 </li><li>左側の肋骨をつかみ、心を公開するなど、多くの肋骨の必要に応じてを切り取る。徐々に0.1mlのヘパリン溶液を用いて右心室に注入する。このステップでは、内皮細胞を損傷し、血流が低下する傾向があるから肺に血液凝固を防止することが重要です。心臓がまだ鼓動している間ヘパリンを注入する必要があります。 </li></ol> 5.2。主肺動脈をカニューレを挿入する<ol><li>静かに肋骨の壁から肺をプッシュするバック（丸い）鉗子の先端を使ってリブの残りの部分（左側と右側）を切り取る。肺グラブ自体は繊細な組織を損傷します。はさみのヒントと肺組織の間で偶発的な接触でもダメージの原因となります。 </li><li>肺上の所定の位置に顕微鏡を移動します。心臓の上に腺と脂肪組織を切り取る。動脈と静脈からそれを引き離し、組織が緊張している間その後、春のはさみでカットしてピンセットを使用してください。 </li><li>ピンセットの別の鈍セット、アトリウム/大動脈と肺動脈（PA）の下にピンセットの先端を得るために心室、左の下に心臓の上から右から左にスクープを使用する。慎重に - そこにこれを行うことがピンセットに抵抗すべきではない。鈍ピンセットを使用すると、誤って肺動脈や大動脈に穴を開けるの可能性を減らすことができます。 </li><li>ピンセットの先端が大動脈とPAの下になると、縫合糸の一部を取得し、乗り越える。緩やかな外科医の結び目を作る。縫合糸を締めたり、結び方をしないでください。 </li><li>オプション：ボディの下半分を削除するには、角度のハサミを使用する。肋骨と背骨を通して伐採​​、大動脈を切断し、下大静脈は流れに血液が大量に発生します - 忠実な流れにQ -ティップを使用する。廃棄用の袋に入れ。 </li><li> RPMIの10mlの注射器から4mlで首相PAカニューレ。すべてのチューブは、空気の泡がないことを再確認してください。蒸留水または泡と肺の血流は浮腫になります。 </li><li>右室自由壁に小さなノッチをカットし、PAカニューレを挿入し、ダウンを目指して右へ。カニューレの先端は、PAの透明な壁を透けて見えるはずです。あなたの場所を確認するために、RPMIの少量を吹き込む。カニューレ、大動脈およびPA周りの縫合糸を締めて、結び目を作る。左心房がカニューレを挿入されるまで、実際の灌流を開始する必要がないので、この時点では、大動脈もオフ結びついていることに注意してください。 </li></ol> 5.3。左心房のカニューレを挿入する<ol><li>左心室の下部にノッチをカットし、不活性、左心房（LA）カニューレ、上方を目指す。わずかな圧力がこの方向での僧帽弁を開くことが必要になる場合があります。正しい場所では、カニューレの先端はすり抜けるし、縫合することなく安全である。 </li></ol> 5.4。血流を始める<ol><li> RMPIが流出チューブ（クリアPBSとは対照的にピンクっぽい色）で明らかになるまで、手動で毎分0.3ミリリットルで10 mlのシリンジからRPMIを吹き込む。流出管、再位置LAカニューレ内に流れがない場合。は流出が再ポジショニングを得られない場合、肺動脈の漏れを確認してください。肺動脈の漏れや涙を修復できません、これは実験の中止の原因です。 </li><li> IL - 1システムを介してPAカニューレに60mlのシリンジを接続し、RPMIが肺に血液を交換していることを示している、漏れをチェックし、肺が白くなることを確認し、潅流液1ml/min注入を開始します。 2分間遅い流れで灌流。 </li></ol> 6。拍動と着実な肺動脈圧 - 流量の関係を測定<ol><li>拍動流の研究については、最初は振動ポンプのピストンの変位を設定する以前の実験に基づいて、ウインテストプログラム内の各周波数での希望のレベル。肺の構造と力学に起因する変動、変位は、それぞれのマウスに合わせて調整する必要があります。希望のレベルに定常流を設定します。振動ポンプへのバルブを開き、右側の振動流のプロファイル（ウインテストプログラム）を実行する前に、記録データを起動します。データファイルを開いて、Excelで実験的な流れ（Q）をプロットします。 Q maxとQ minは、必要に応じているように、各周波数で振動ポンプのピストンの変位を調整する（ウインテストプログラム）。 </li><li>定常流試験のために、振動ポンプのバルブを閉じてください。このバルブが開いたままになっている場合、振動ポンプは別の流量から変更を湿し、コンデンサとして機能します。各流量でまたはPAの圧力になるまで少なくとも10秒間データを収集するには、5％以上変化しません。 </li><li>拍動性または定常流の測定、データ収集前に一定の圧力で古い換気のいずれかの。すぐにデータ収集後に換気を再開する。 </li><li>気道チューブのRPMIを監視、これが浮腫の証拠であり、実験の中止の原因です。また、それはトランスデューサーが破損しますので、RPMIは気道内圧やフローセンサーに到達させてください。 </li></ol> 7。代表的な結果： 代表的な着実な成果： 孤立肺に実験を設定する独立だけでなく、肺血流量Qだけでなく、気道圧P 空気と左心房圧のLAPを制御する能力を持っています。 Q、P、空気とLAPは、肺血管系と、その結果肺動脈圧PAPに影響を与えるので、これは有利で ​​ある。もう一つの利点は、得られた結果は、交感神経系のトーン1、ボリュームのステータス、および麻酔2の独立であるということです。 固定Pの空気と、固定または可変LAPのためのQの階段状の変化によるPAPの変化を図1に示されています。分離された肺の準備に、LAPのカニューレは、通常、廃棄用容器に灌流液を導く配管に接続されていることに注意してください。代わりにこのチューブを使用すると、LAPは、ポアズイユ流に起因するQ上で直線的に依存しています。しかし、コンセントおよび廃棄物の容器の高さを手動で定数、非ゼロLAPまたはチューブを提供するように調整することができますQ.独立しているゼロLAPを許可するように削除することができます代表的な拍動の結果： 任意の拍動流の波形はこのシステムを使用して生成することができますが、我々は、通常はフォームの流れで、f = 1、2、5、10、15および20 Hzの周波数で、Q = 3 + 2罪（2 FπT）ml /分を生成する肺血管系（：上部パネル図2）の線形化インピーダンスを評価する。結果としてPAP、LAPとQの測定値から、肺血管インピーダンスの大きさ（Z）と位相（θ）は最初のシリーズの中にそれぞれ課された正弦波流量の周波数でΔP= PAP - LAPとQの1つの完全な正弦波サイクルを分解して計算されますフーリエ変換を用いて正弦波の高調波。圧の比は収量を変換肺vascualarインピーダンス、PVZ = FFT（ΔP）/大きさZと位相θを持つFFT（Q）を、流れるように変換。入力インピーダンスZ 0、特性インピーダンスZ、C、および波反射R Wのインデックスは、インピーダンスの大きさから計算されます。特に、Z 0はすべての周波数にわたって、Z、Cが最初に最小値（5 Hz）と20Hzの間にZの平均値として計算される平均、およびR Wが計算される0番目の高調波（F = 0 Hz）でZから計算されるとして（Z 0 - Z C）/（Z 0 + Z C）3。 <img src="/files/ftp_upload/2690/2690fig1.jpg" alt="図1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図1"> 図1定常流波形（上段）と、その結果圧力（2行目：PAP、P 空気 、LAP）。LAPとPの空気の異なる組み合わせと時間の関数として。流出管が所定の位置にあったので、一番下の行はPAP対Q.において（）と（B）、QとLAPの増加と減少を示しています。このチューブは、そのLAPには定数とQ.独 ​​立しているので、（C）（D）とLAPは高いが、Q. P 空気の独立になるように（E）アウトレットチューブの高さを手動で調整したが、いずれかであったため削除されました吸気終末（A、C、D）または呼気終末（B、E）圧力。 <img src="/files/ftp_upload/2690/2690fig2.jpg" alt="図2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図2"> 図2拍動流波形Q（上部パネル）と、その結果圧力（底部パネル：PAP、LAPおよびP 空気 ）。時間の関数として。これらの拍動性の肺動脈圧 - 流量の関係から、PVZは総右心室の後負荷を反映して、計算することができます。

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</ol>

利害の衝突は宣言されません。

手術の重要なステップそれは、肺から肋骨を切断するときには注意されていることが不可欠です。肺が完全に露出し、奔放インフレ時に周辺組織ではなく、分離の過程で損傷がないことをする必要があります。カットするはさみのための明確なパスが存在するように鉗子のバックエンドのような平らなオブジェクトの使用は、離れて胸壁から肺を保持するために使用することができます。別の重要なステップは、肺動脈と大動脈周囲縫合の配置です。平滑ストレートピンセットを使用すると、肺動脈を穿刺のリスクが軽減されます。手術中の最後の重要なステップは、カニューレの配置です。カニューレは、彼らが心を終了するなど、大血管の平面上に高すぎる場合、カニューレは、肺動脈や肺静脈のいずれかに引き出すことができます。左心房のカニューレが低すぎる場合、それは左肺に流れをブロックすることができます。結果として、より多くのフローは、PAPを増加させると、右肺の浮腫の開発を早め、右肺に行きます。 データ収集時の重要なステップ定常流データの収集は、高い流...

<table><tbody><tr><td>1 ml シリンジ</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-829-10F</td><td></td></tr><tr><td>10 ml シリンジ</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-823-2A</td><td></td></tr><tr><td>60 ml シリンジ</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-689-8</td><td></td></tr><tr><td>GLN 6/PK添加RPMI</td><td>Fisher Scientific</td><td>MT10040CV</td><td></td></tr><tr><td>ボトルトップフィルター</td><td>Fisher Scientific</td><td>09-761-57</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll PM 70</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F2878-100g</td><td></td></tr><tr><td>ヘパリン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Y27632</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Y0503</td><td></td></tr><tr><td>角度付きボールアイリス鋏</td><td>Fine Science Tools</td><td>14109-09</td><td></td></tr><tr><td>バナススプリング鋏 - 刃長4mm</td><td>Fine Science Tools</td><td>15018-10</td><td></td></tr><tr><td>精密アイリス剪刀 - 直形</td><td>Fine Science Tools</td><td>14106-09</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5/45 鉗子</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-35</td><td></td></tr><tr><td>Dumont 医学生物学用ピンセット</td><td>Fine Science Tools</td><td>11254-20</td><td></td></tr><tr><td>Lauda E100 ECO-line 003 </td><td>VWR international</td><td>Lauda-Brinkmann E-103 (62400-922) に相当品</td><td></td></tr><tr><td>IL-1 摘出灌流マウス肺システム </td><td>Harvard Apparatus</td><td>739904</td><td></td></tr><tr><td>PLUGSYSモジュール用血圧トランスデューサーP75</td><td>Harvard Apparatus</td><td>730020</td><td></td></tr><tr><td>TS410 フローモジュール</td><td>遷音速</td><td>TS410</td><td></td></tr><tr><td>ME 4 PXN Precision PXN インライン流量センサ</td><td>遷音速</td><td>ME 4 PXN</td><td></td></tr><tr><td>Cole-Parmer マルチシリンジポンプ</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-74900-20</td><td></td></tr><tr><td>Nembutal 50mg/mL 20mLバイアル</td><td>Amatheon</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

絶縁型、ベンチレーテッド、および計装のマウス肺の特性評価は、拍動流を灌流

Characterization of the Isolated, Ventilated, and Instrumented Mouse Lung Perfused with Pulsatile Flow

孤立は、換気と、インストルメントマウスの肺の準備は着実と拍動性の肺血管圧 - 流量の関係は肺動脈流速、流量波形、気道内圧と左心房圧を個別にコントロールして測定することができます。肺血管抵抗は、マルチポイント、安定した圧力 - 流量曲線に基づいて算出され、肺血管のインピーダンスは周波数の範囲で得られた脈動圧力 - 流量曲線から計算されます。現在臨床的に認識されるので、特に肺循環では、無視できない血管コンプライアンスの影響を、含んでいるので、インピーダンスは抵抗よりも右心室の後負荷の優れた指標です。インピーダンスの3つの重要なメトリクス-ゼロヘルツインピーダンスZ 0、特性インピーダンスZ、C、および波反射R Wの指数は-フロー、近位動脈の剛性と上下流インピーダンスで使用可能な遠位動脈の断面積への洞察を提供ミスマッチ、それぞれ。隔離された、換気と灌流肺で得られたすべての結果は、交感神経系のトーン、ボリュームの状態と麻酔の効果とは無関係です。私たちは、抵抗とインピーダンスに肺塞栓および慢性の低酸素の影響を定量化するためにこのテクニックを使用している、とZ、Cの圧力依存性を用いて血管作用剤と疾患の作用部位（すなわち、近位対遠位）を区別する。さらに、これらの技術は、マウスの遺伝子組み換え株の肺で使用されるときに、肺血管の構造と機能に関する分子レベルの欠陥の影響を決定することができます。

次のプロトコルは、換気を分離し、右心室の後負荷に対する血流、気流、気道の変化や血管の変化の影響を定量化するために着実または拍動肺血管圧 - 流量の関係を測定するためにマウスの肺をインストルメントのプロセスを概説します。

単離・人工換気・計装化されたマウス肺標本を用いることで、定常および拍動的な肺血管の圧力-血流関係を測定することが可能になります。

拍動性の肺血圧・血流関係を研究すること。本プロトコルでは、マウスの肺を摘出し、換気および灌流させる方法について説明します。換気のために気管を外科的に露出させます。次に、肺動脈と左心房にカニューレを挿入できるよう、心臓と肺を摘出します。その後、肺系に灌流を行います。肺動脈血流の流量、振幅、波形、または周波数を変化させることで実験を行います。得られた肺動脈および左心房の圧力波形を記録し、脈動性の肺血流圧関係を実証します。in vivo調製などの既存の手法と比較した本手法の主な利点は、体積状態、交感神経系の緊張、活動、および麻酔の影響による変化を排除した状態で、脈動性の圧力・血流関係を得ることができる点にあります。また、ほとんどの孤立肺標本では定常的な圧力-流量関係のみが測定されますが、本手法では拍動性の圧力-流量関係を決定することが可能です。この手法は、肺血管疾患が拍動性の肺血行動態にどのように影響するか、あるいは主肺動脈の硬化が右室後負荷にどのように影響するかといった、肺生理学分野における重要な疑問を解決するのに役立ちます。心臓と肺を露出させ、肺動脈にカニューレを固定する操作は習得が困難であるため、本手法を視覚的に提示することは極めて重要です。器具による過剰な圧は肺浮腫を引き起こす可能性があり、カニューレの不適切な留置は肺動脈を穿刺させる恐れがあります。実験を開始する前に、孤立肺の換気および灌流に使用するIL oneシステムの準備が必要です。チューブを圧力トランスデューサに接続してください。単一のポンプと流量計を用い、37°Cに加温した蒸留水でシステム全体を完全にフラッシュし、チューブ内の気泡を除去します。次に、Endur techポンプのチューブを1%PBSでプライミングします。その後、ゼロ点調整を行います。まず、IL 1システムへのバルブを閉じ、大気へのバルブを開いて、各P 75トランスデューサーの圧力を調整します。次に、プラグSISアンプを使用して圧力を自動的にゼロ合わせします。動物の準備として、セラミック多孔質片を蒸留水に浸し、IO 1セットアップを加湿します。マウスを麻酔後、前肢をコルクボードにピンで固定し、手術のためにマウスを安定させます。次に、胸部に95%アルコールをスプレーします。直鉗子で頸部の皮膚をつかみ、直剪刀で1 cmの切開を行います。頸部の内部が露出したら、食道と気管を探しながら、表在筋にある白い腺組織を切り取り除去します。食道と気管の周囲および後方の組織を剥離し、気管に緩い縫合糸をかけます。気管にカニューレを挿入するため、小鋏を用いて気管の片側に小さなV字状の切開を慎重に加えます。その後、鈍端鉗子を用いてマウスをIL oneシステムへ移動させます。気管カニューレを掴み、気管内に挿入します。縫合糸でカニューレを固定します。まず室気で換気を開始し、胸部をアルコールで消毒した後、直鉗子と直剪刀を用いて皮膚を除去します。胸骨に沿って皮膚を上方に向かって切開します。両側の皮膚を持ち上げ、下位肋骨のラインに沿って切開します。次に、ピンセットで剣状突起をつかみ、ボールチップシザーを用いて、胸骨の下端と接する横隔膜に穴を開けます。横隔膜をつかみ、肋骨から切り離します。丸先剪刀を用いて、再び剣状突起をつかみ、肺、心臓、または血管を損傷しないように注意しながら、肋骨を通して胸骨を上方へ慎重に切開します。心臓を露出させるため、左側の肋骨をつかみ、その先端を切除します。次に、右心室に0.1 millilitersのヘパリンをゆっくりと注入します。注入後、残りの肋骨を切り取り、顕微鏡下で肋骨をカットしながら、鉗子の背面または丸い端を用いて肺を肋骨から慎重に押し除けます。心臓上の脂肪にある腺組織を除去します。ピンセットを使用して組織をかき分け、切り取り除きます。スプリングシザーを用いて大動脈と肺動脈に縫合糸をかけ、鈍端ピンセットで心臓をそっと持ち上げます。この際、抵抗はほとんどないはずです。次に、ダブルスローで緩い結節 suture を結びます。続いて、下腹部を切り離します。角度付きの剪刀を用いて、肋骨と脊椎を切り進めてください。これにより、かなりの量の血液が流れます。綿棒を使用して止血してください。出血が止まったら、10 mLのRPMIを満たしたシリンジを用いて、4 mLのRPMIでILシステムをプライミングします。チューブ内に気泡がないことを再確認してください。次に、心尖部付近に小さな切り込みを入れてカニューレを挿入し、右心室をカニュレーションします。肺動脈に到達するように下方向に向けて挿入してください。肺動脈のほぼ透明な壁を通して、プローブの先端が見えるはずです。次に、左心室にカニューレを挿入するため、カニューレ、大動脈、および肺動脈の周囲で縫合糸を締め付けます。心尖部に切り込みを入れ、左心房に向けて上方にカニューレを挿入します。弁を見つけるためにわずかな圧力をかける必要があるかもしれませんが、一度見つかれば、カニューレは滑り込み、縫合糸なしで固定されます。流出チューブに流れが見えるまで、10 mLシリンジから0.3 mL/分でRPMIを手動で注入します。流出チューブに流れがない場合は、左心室カニューレの位置を調整してください。ただし、肺に流れがない場合は、肺動脈にリークがある可能性が高いため、実験を中止してください。心臓へのカニューレ挿入が完了したら、60 mLシリンジをIL 1システムに接続します。定流量ポンプを使用し、RPMI Perfuse 8を1 mL/minの速度で注入します。初期灌流時に漏れがないか確認してください。さらに2分間、徐々に肺に灌流させます。この間に肺は白色に変化します。拍動流の研究を行う場合は、まず単独ポンプのピストン変位量を目的のレベルに設定してください。次に、定常流速を設定します。osliポンプのバルブを開き、osliフロープロファイルの実行直前にデータの記録を開始してください。完了後、データ出力ファイルを開き、初期試行の実験流速に基づいて実験的なフローをプロットします。Q maxが希望の値になるように、各周波数における振動ポンプのピストン変位を調整します。定常流試験のデータ収集中は、換気を一定圧力に維持し、単独ポンプへのバルブを閉じて定常流量を希望のレベルに設定してください。データの記録を開始し、定常流プロトコルに従って手順を進めます。各試行間の流速において、少なくとも10秒間データを収集します。流速を0.5 milliliters per minuteにリセットしてください。データ収集中は、換気圧を一定に保持するようにしてください。左心房圧ゼロの試行を行う場合は、試行中に流出チューブを取り外してください。気道チューブ内にRPMIが流入していないか注意深く監視してください。RPMIが気道圧トランスデューサーに到達すると破損するため、絶対に到達させないでください。上段に流量 Q、2段目にそれに対応する肺動脈圧および左心房圧を示した、さまざまな条件下での定常流灌流の結果を以下に示します。最初の2つのパネルでは、流出チューブが装着されていたため、左心房圧は Q に伴って増減しました。1番目のパネルは呼気終末圧、2番目のパネルは吸気終末圧における空気圧を示しています。次に、チューブを取り除いたことで、左心房圧は一定となり Q に依存しなくなりました。その後、流出チューブの高さを手動で調整し、左心房圧を上昇させました。また、Qとは独立して、最初のパネルは呼気終末陽圧（PEEP）と吸気圧を、2番目のパネルは呼気終末陽圧を示しています。それぞれのケースにおける肺動脈圧と血流の定常的な関係は、圧力対流量をプロットすることで得られます。上段パネルには脈動流灌流の結果である流量 Q と、それによって生じた肺動脈圧、左心房圧、および空気圧が示されています。下段パネルをご覧ください。これらの脈動肺血圧と流量の関係から、右室後負荷の総和を反映する肺血管インピーダンスを算出することができます。この手技に習熟すれば、20〜30分で完了させることができます。この手順を行う際は、手を震わせないよう、時間をかけて心身をリラックスさせることが重要です。肺に十分な灌流が行われれば、困難な工程は終了となります。本手順に続き、肺組織を用いて組織学的検査や生化学的アッセイなどの他の手法を実施することができ、肺の脈動圧と流量の関係で観察された変化にどのような分子メカニズムが関与しているかといった追加の疑問を明らかにすることが可能です。この手法は、肺生理学分野の研究者が、遺伝子改変マウスを用いて肺血管疾患の発症および進行における特定の遺伝子やタンパク質の役割を探索するための道を開くものです。

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