Name: 胚性幹細胞を生体内でクロマチン蛋白質のダイナミクスを測定するアッセイ（FRAP＆FLIP）を光退色 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-06-29T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 18 s
Description: 学ぶFRAP・FLIP法による胚性幹細胞のクロマチン蛋白質ダイナミクス測定。GFP融合蛋白質を用いた光退色技術で、生細胞内の蛋白質動態と可動・不動割合を定量解析する方法です。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

私たちは、批判的なコメントのためにと日常的にトラブルシューティング退色実験のため、特にMeshorer研究室のメンバーは、シャイMelcer、アディAlajem、Edupugantiラグーラム、バディスリランカSailaja、アンナMattoutとアルバBiranに感謝。 EMは、ジョセフH.とベルR.ブラウンライフサイエンスの上級講師であり、イスラエル科学財団（ISF 943/09）、保健イスラエル省（6007）欧州連合（IRG - 206872および238176）でサポートされていますイスラエル癌研究財団、ヘブライ大学、イスラエルの精神生物学研究所の内部実用的な医療補助。

1。 ES細胞をめっき T = 0時間 MEFのメッキ<ol><li>コー​​トライブイメージングμ-スライド8ウェル（ibidi、ミュンヘン、ドイツ）ゼラチンまたはチャンバーカバーガラスで（ラボ- Tek社、ロチェスター、ニューヨーク州）とやガラス底培養皿で（マテック、アッシュランド、マサチューセッツ州）。 5〜30分放置し、遊離ゼラチンを離れて吸引除去する。 </li><li>シード22000 MEFを/ウェルのDMEMを250μlの総容量で[10％ウシ胎児血清（FBS）を添加した]。細胞は組織培養インキュベーター（37℃、5％CO2）で成長することができます。 </li></ol> T = 6時間 ES細胞のメッキ<ol start="3"><li> DMEMを吸引除去する。 </li><li> ES細胞の培地250μlの総体積で15,000 R1細胞/ウェルでうまく被覆種子各MEFの[10％ESC -グレードウシ胎児血清（FBS）、1mMピルビン酸ナトリウム、0.1mMの非必​​須アミノ酸、0.1mMのβ-を添加したメルカプトエタノール、および1000 U / mlの白血病抑制因子（LIF）]、翌日30％〜50％コンフルエントに取得する。 </li></ol> 2。 ES細胞のトランスフェクション T = 24時間 一過性トランスフェクション<ol><li> 250μL/ウェル、新鮮なES細胞のメディアのES細胞の培地を交換してください。 </li><li> 1.5 mlの滅菌試験管に、100μlの無血清培地[のOpti - MEM（Gibco社）]、その後、直接無血清培地に10μlのトランジット- LT1トランスフェクション試薬（Mirus）を追加を追加。穏やかなピペッティングにより混和し、5〜20分間室温でインキュベートする。 </li><li>希薄化後のトランジット- LT1試薬に1.5μgのGFP融合プラスミドDNA（H1E、H1oまたはHP1）を追加します。穏やかなピペッティングにより混和し、15〜30分間室温でインキュベートする。 </li><li>トランスフェクション混合物の13.5μl/ウェルを追加。さらに分散性を確保するためにμ-スライド8ウェル渦巻き。 24時間後には、新鮮なES細胞の培地を250μlと古いのES細胞培地を交換してください。 </li></ol> 3。 FRAPやFLIPの実行 T = 48〜72時間<ol><li>実験は、任意の共焦点レーザー走査顕微鏡（CLSM）で実行することができますが、通常のFRAP / FLIP実験で以来、多くの連続した​​画像が取得され、それが買収の速度を可能にしないし、その何を確実に​​回転するディスク共焦点顕微鏡を、使用することをお勧めします。漂白望ましくないサンプルは、最初の意図的な白化現象は、次の発生します。ここで、我々は、横河電機CSU - X回転するディスクのヘッドを、ディスク共焦点システム（www.Andor.comを）回転革命を使用することをお勧めします。このシステムは、ポイントスキャンシステムで特殊なFRAPPAモジュールを使用して、そして急速に回転するディスクを使用して画像を収集するためにバックライトを切り替えるには光退色に二重の能力を持っています。実験の光退色に使用する3最も一般的な蛍光タンパク質はGFP、YFPとチェリーです。 GFPまたはYFPが使用されている場合は、〜488 nmのレーザーが必要です。チェリーの場合は、〜560nmのレーザーを使用してください。すべてのケースでは、我々は固体レーザを使用することをお勧めします。自動ステージを持つことは有用ですが、必須ではありません。生きた細胞が撮像されているので、それは酸素、湿度、CO 2と温度を制御する、（私たちはLIS、スイスからいずれかを使用）環境室を使用することが不可欠です。 FRAPは、イメージングが（通常10％の面積で、蛍光レベルが十分なとき）に必要な最小限のレーザーパワーで行われている間、最大レーザー強度を使用して実行されます。 適切な波長の蛍光灯の光で細胞を観察し、60X油浸レンズを用いてGFPを発現する細胞を選択する。正しい細胞内分布を確認してください。時折、発現レベルが高すぎるときに、タンパク質の局在化は、核小体などの他の区画に"スピル"があります。このような細胞が選択されるべきではない。 </li><li>今イメージングプロトコルを設定します：ユークロマチンまたはヘテロクロマチン（要約GFP巣として表示）にし、退色前に退色3から5フレームを収集し、250から1000ミリ秒の間隔で、光退色後の90から120フレームを収集してください。H1E - GFP、1000 MS、H1oとHP1 - GFP、250ミリ秒（非常に動的な蛋白質は、短い間隔の時間を必要とする蛋白質のダイナミクスに応じてインターバル時間の変更、）。我々は通常、20〜40μseconds（1-2の繰り返し）のレーザーパルスで光退色に対して80〜100％のレーザー強度を使用しますが、これらの数値は、分析タンパク質と発現レベルに応じて変更することができます。退色が適切な場合、あなたはGFPの蛍光で"ブラックホール"を観察する必要があります。ブラックホールは徐々に蛍光次の回復と再充填されている。回転するディスクは1秒間に60前後の画像（良い蛍光強度を持つとする場合、単一のセルにズームイン）まで得ることができますが、我々は低画質と潜在的な増加光毒性に起因するような高速でシステムを使用することはお勧めしません。 </li><li> FLIP実験では、別の撮像プロトコルを設定する：画像を収集中に同じ場所に漂白を繰り返し開始し、漂白の前に3から5フレームを収集する。 H1o - GFP、漂白のためのH1E - GFP、漂白剤ごとに5秒、毎2秒のため、とHP1 - GFP漂白剤毎に1秒のため。漂白剤D実験全体を通して何度も画像を収集する。 </li><li>どちらの手法の場合、20〜30細胞にプロセスを繰り返します。統計上の目的のために、できれば別の日に、実験を3回以上繰り返す。均質な集団と正しい設定では、標準偏差は通常低い（&lt;5％）。 FRAPやFLIPの両方に対して、漂白領域の大きさや形状は、回復のダイナミクスに影響を与え、実験内で一定でなければなりません。また、つのセルを比較する場合、同一のプロトコルを使用する必要がありますし、細胞をパワーレーザーと他の条件は変動することがありますし、実験の結果に影響を及ぼす可能性があるため、同じ日に連続して分析する必要があります。 </li></ol> 4。 FRAPやFLIPデータ解析<ol><li>すべてのFRAPフレームが収集さで、ROI（投資収益率B =漂白エリア）、背景領域（ROI BG）で蛍光強度を測定し、前と漂白後の時間の関数としての無漂白の核領域（ROI NB）。漂白地域はごくわずかであるときに全体の核は、正規化の目的のために選択することができます。 </li><li> /（ROI NB - ROI BG） - （ROI BG ROI B）/（pbROI B - pbROI BG）/（pbROI NB - pbROI BG）、鉛は、事前に漂白意味：すべての時間ポイントの場合は、公式にしたがってデータを正規化する。事前に漂白剤の画像の場合は約1の値を取得する必要があります。漂白剤の後の最初のイメージは、ブリーチの深さが示されます。実際のブリーチ深さ値1から値を引く。すべてのセルと各実験から平均20から30のセルに対して繰り返します。 </li><li>収集されたすべてのFLIPのフレームで、（ROI NB =無漂白面積、ROI BG =バックグラウンド）無漂白核領域での蛍光強度、および背景領域を測定する。 FLIPデータの計算は、FRAPの曲線に似てのみ分析したROI（投資収益率nbは ）計算に使用されていない実際の漂白地域、異なっている必要があります：（ROI NB - ROI BG）/（pbROI NB - pbROI BG） 。それは正規化の目的のために隣接セル（ROI N =隣接セル）を使用することも可能です：（ROI NB - ROI BG）/（ROI N - ROI BG）/（pbROI NB - pbROI BG）/（pbROI N - pbROI BG ）。 データの収集に続いて、それはコンピュータシミュレーションに実験データをフィットすることが可能です。これは良い近接、モバイル分数、不動小数と半値で、計算することができます。ここでは、FRAP解析の数学的および統計的側面 ​​を議論し、他の優れた出版物4-9を参照されたいことはありません。漂白剤の深さが事前に漂白剤（100％）信号と漂白剤の後の最初のイメージとの間の距離（y軸上）を指し、モバイル割合は、漂白剤の深さとの間の距離（y軸上）を指し反応速度がプラトーに達する、と不動小数が復元された信号とプリ漂白剤（100％）の信号の間の距離（y軸上）（図1Bおよび2Bを参照）を参照している。復元された信号この分析を超えて、データに合わせて適切な数学モデルがあります。単一指数、方程式のための <img src="/files/ftp_upload/2696/eq0.jpg" alt="方程式" width="80" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="方程式"> tは時間であるときは、1モバイル割合であり不動割合であり、kはオフ解離定数であり、データに合わせて使用することができ、結合のオフ率の直接推定値（K オフ ）することができます得だけでなく、会合速度を計算するために使用できるパラメータ、のために。 </li></ol> 5。代表的な結果： <img src="/files/ftp_upload/2696/2696fig1.jpg" alt="図1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図1"> 図1及びBは、R1 ES細胞では、HP1（左）の代表的なFRAP曲線を示すH1o（真ん中）とH1E（右）。簡単でわかりやすく図の場合は1Aは、いかなる正規化し、計算の前に単セルの生データを示しています。黄色の曲線は、漂白の領域に対応する、紫の曲線は、無漂白の核領域に相当する（漂白地域は核全体が正規化の目的のために選択することができる無視できる場合）、および赤の線は、バックグラウンドの蛍光に対応し、されているこの場合の最小限の。垂直方向の矢印は、漂白時間を表します。正規化と平均化されたデータは、図1Bに示されています。 HP1（赤）と比較してH1（青）の遅い回復に注意してください。また、H1Eバリアント（ダークブルー）はH1oバリアント（ライトブルー）よりも遅くなります。モバイルと不動の分画とブリーチの深さは、HP1のために示されている。 <img src="/files/ftp_upload/2696/2696fig2.jpg" alt="図2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図2"> 図2及びBは、ユークロマチンを比較する代表的なFRAP曲線を示す（R1 ES細胞におけるHP1のヘテロクロマチン（右）と）左。同様に図1を、図2Aは、単一セルの生データを示し、黄色の曲線は、漂白の領域に対応する、紫の曲線は、無漂白の核領域に相当し、赤の線は、バックグラウンドの蛍光に対応しています。垂直方向の矢印は、漂白時間を表します。正規化と平均化されたデータは、図2Bに示されています。ユークロマチン（明るい赤）と比較してヘテロクロマチン（暗赤色）の遅い回復に注意してください。モバイルと不動の分画とブリーチの深さは、ユークロマチンのために示されている。 <img src="/files/ftp_upload/2696/2696fig3.jpg" alt="図3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図3"> 図3。。 H1o R1 ES細胞の典型的なFLIPの実験は、図3A（生、非正規化データ）とB（正規化と平均化されたデータ）に示されています。この実験では紫色の曲線は、無漂白の核領域に対応する、緑色の線は隣接する細胞核に相当し、赤線は、バックグラウンドの蛍光に対応しています。

<ol><li>Phair, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+nature+of+dynamic+protein-chromatin+interactions+in+vivo%3A+three-dimensional+genome+scanning+and+dynamic+interaction+networks+of+chromatin+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Global nature of dynamic protein-chromatin interactions in vivo: three-dimensional genome scanning and dynamic interaction networks of chromatin proteins.</a> Mol Cell Biol. 24, 6393-6402 (2004).</li>
<li>Meshorer, E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMeshorer%2C+E+%22Imaging+chromatin+in+embyonic+stem+cells+in+StemBook%22">Imaging chromatin in embyonic stem cells in StemBook</a>. Girard, L. , Harvard Stem Cell Institute. Cambridge. (2008).</li>
<li>Meshorer, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyperdynamic+plasticity+of+chromatin+proteins+in+pluripotent+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Hyperdynamic plasticity of chromatin proteins in pluripotent embryonic stem cells.</a> Dev Cell. 10, 105-116 (2006).</li>
<li>Bancaud, A., Huet, S., Rabut, G., Ellenberg, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBancaud%2C+A+%22Fluorescence+perturbation+techniques+to+study+mobility+and+molecular+dynamics+of+proteins+in+live+cells%3A+FRAP%2C+photoactivation%2C+photo+conversion%2C+and+FLIP%22">Fluorescence perturbation techniques to study mobility and molecular dynamics of proteins in live cells: FRAP, photoactivation, photo conversion, and FLIP</a>. , Cold Spring Harbor Press. (2009).</li>
<li>Dundr, M., Misteli, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+dynamics+of+nuclear+proteins+by+photobleaching%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Measuring dynamics of nuclear proteins by photobleaching.</a> Curr Protoc Cell Biol. Chapter 13, Unit 13-Unit 13 (2003).</li>
<li>Ellenberg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+membrane+dynamics+and+reassembly+in+living+cells%3A+targeting+of+an+inner+nuclear+membrane+protein+in+interphase+and+mitosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Nuclear membrane dynamics and reassembly in living cells: targeting of an inner nuclear membrane protein in interphase and mitosis.</a> J Cell Biol. 138, 1193-1206 (1997).</li>
<li>Lenser, T., Weisshart, K., Ulbricht, T., Klement, K., Hemmerich, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+fluctuation+microscopy+to+reveal+3D+architecture+and+function+in+the+cell+nucleus%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Fluorescence fluctuation microscopy to reveal 3D architecture and function in the cell nucleus.</a> Methods Cell Biol. 98, 2-33 (2010).</li>
<li>Mueller, F., Mazza, D., Stasevich, T. J., McNally, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FRAP+and+kinetic+modeling+in+the+analysis+of+nuclear+protein+dynamics%3A+what+do+we+really+know%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">FRAP and kinetic modeling in the analysis of nuclear protein dynamics: what do we really know.</a> Curr Opin Cell Biol. 22, 403-411 (2010).</li>
<li>Phair, R. D., Misteli, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetic+modelling+approaches+to+in+vivo+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Kinetic modelling approaches to in vivo imaging.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 2, 898-907 (2001).</li>
<li>Poser, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BAC+TransgeneOmics%3A+a+high-throughput+method+for+exploration+of+protein+function+in+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">BAC TransgeneOmics: a high-throughput method for exploration of protein function in mammals.</a> Nat Methods. 5, 409-415 (2008).</li>
<li>Sigal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+a+fluorescently+labeled+endogenous+protein+library+in+living+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Generation of a fluorescently labeled endogenous protein library in living human cells.</a> Nat Protoc. 2, 1515-1527 (2007).</li>
<li>Cohen, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+proteomics+of+individual+cancer+cells+in+response+to+a+drug%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Dynamic proteomics of individual cancer cells in response to a drug.</a> Science. 322, 1511-1516 (2008).</li>
</ol>

利害の衝突は宣言されません。

細胞集団または固定化細胞、FRAP実験から精製されたクロマチンを含むほとんどの利用できる技術とは異なり、生きた細胞のクロマチン蛋白質のダイナミクスの変化に従ってください。我々はクロマチンの蛋白質のダイナミクスは、クロマチン可塑性の良い指標であることが判明。しかし、それは融合のGFPと目的の遺伝子を必要とするため、蛍光タグを追加するには、タンパク質の機能を妨げることができる。このように、前のFRAPを進めるために、融合タンパク質は、厳密には、そのネイティブ対応と同じプロパティと機能を持って確保するためにテストする必要があります。ゴールドスタンダードは、ノックアウト細胞株におけるGFP融合した内因性タンパク質の機能を補完することです。しかし、ノックアウト細胞株は、常に利用できるとは限りませんし、多くの場合、タンパク質の不在は、明確な表現型を持っていません。それにもかかわらず、人は適切な部分的な交換を保証するために内因性タンパク質と比較してすべての融合蛋白質の細胞内分布、その発現レベルは、その結合パートナーを、テストすることができます。 検証後、GFPの融合タンパク質は、ES細胞にトラン...

<table border="1"><tbody><tr><th>試薬の名前</th><th>会社</th><th>カタログ番号</th></tr><tr><td> DMEM </td><td>シグマ</td><td> D5671 </td></tr><tr><td>ゼラチン</td><td>メルク</td><td> 1.04078 </td></tr><tr><td>のOpti - MEM </td><td>ギブコ</td><td> 31985 </td></tr><tr><td>トランジット- LT1 </td><td> Mirus </td><td> MIR2300 </td></tr><tr><td> μ-スライド8ウェル</td><td> ibidi </td><td> 80826 </td></tr></tbody></table>

胚性幹細胞を生体内でクロマチン蛋白質のダイナミクスを測定するアッセイ（frap＆flip）を光退色

Photobleaching Assays (FRAP &amp; FLIP) to Measure Chromatin Protein Dynamics in Living Embryonic Stem Cells

光退色後蛍光回復（FRAP）や光退色で蛍光損失（FLIP）が良好な空間分解能と時間分解能を持つ生体細胞内の蛋白質のダイナミクスの研究を可能にします。ここでは、FRAP及びマウス胚性幹（ES）細胞のH1とHP1、を含む、クロマチンタンパク質のFLIPアッセイを、実行する方法について説明します。 FRAP実験で、細胞は緑色蛍光タンパク質（GFP）またはその誘導体（YFP、CFP、チェリー、など）を融合させた目的のタンパク質で、どちらか一過性または安定的に、トランスフェクトされています。トランスフェクト、蛍光細胞では、強烈な焦点レーザービームは、興味の比較的小さい領域（ROI）を漂白剤。レーザーの波長は、融合に使用する蛍光蛋白質に応じて選択されます。レーザー光が不可逆的にROI内の分子の蛍光シグナルを漂白剤と、すぐに漂白以下、漂白地域における蛍光シグナルの回復 - 無漂白の分子と漂白分子の交換によって媒介は - タイムラプスイメージングを使用して監視されます。生成された蛍光回復曲線は、タンパク質の流動性に関する情報を提供しています。蛍光分子が不動であれば、何蛍光回復は観察されません。補完的なアプローチでは、光退色における蛍光損失（FLIP）は、レーザービームは、繰り返し同じ場所を漂白し、信号強度は、他の場所で蛍光を発する細胞で測定されます。 FLIPの実験では、したがって、信号の減衰ではなく、蛍光の回復を測定し、タンパク質の移動度と同様に細胞区画を行き来し蛋白質を決定するのに便利です。一時的な結合は、クロマチン関連タンパク質の一般的なプロパティです。各クロマチン蛋白質の主要な割合が定常状態での任意の時点でクロマチンにバインドされていますが、バインディングは一時的であり、ほとんどのクロマチンタンパク質は、秒の順番で滞留時間で、クロマチン上で高い離職率を持っている。これらのプロパティは、ゲノムの式1に高い可塑性を発生させるために重要です。退色実験は、特にクロマチンタンパク質の動的な交換が（ヘテロクロマチンタンパク質1（HP1）、リンカーヒストンH1とコアヒストンを含む）以上であるES細胞、で、それゆえクロマチン構造蛋白質のGFP融合バージョンを使用してクロマチン可塑性を決定するために特に有用です。 2,3分化細胞に比べて。

我々は、光退色後蛍光回復（FRAP）や胚性幹（ES）細胞におけるクロマチン蛋白質の動態を監視する（FLIP）光退色で蛍光の損失を含む光退色の方法を説明します。クロマチン可塑性を研究する手段の一つであると考えられているクロマチン蛋白質のダイナミクスは、多能性細胞で強化されています。

胚性幹細胞を生体内でクロマチン蛋白質のダイナミクスを測定するアッセイ（FRAP＆FLIP）を光退色

光退色後蛍光回復 (FRAP) および光退色による蛍光消失 (FLIP) により、生細胞内におけるタンパク質のダイナミクスを...を用いて解析することが可能です。

本実験の全体的な目的は、胚性幹細胞におけるクロマチンタンパク質のダイナミクスをモニタリングすることです。これは、GFP融合プラスミドDNAをeESLに導入して形質転換細胞内で蛍光標識されたクロマチンタンパク質を発現させ、FRAPまたはFLIPを行うことで、回復または消失を測定することにより達成されます。光退色後、タンパク質の動的な挙動をモニタリングし、可動性および非可動性のタンパク質分率を決定します。FRAPおよびFLIPアッセイに基づき、クロマチンタンパク質のダイナミクスの違いを示す結果が得られました。SALSA洗剤を用いたクロマチンタンパク質の抽出などの既存の手法に対する本手法の主な利点は、単一の生細胞に適用できる点にあります。したがって、クロマチンとクロマチンタンパク質の会合を生きた状態で観察でき、特定の集団内における不均一性を決定することが可能です。まず、無菌操作を用いてマウス胚性線維芽細胞またはMeth細胞を播種します。クリーンベンチ内で、ゼラチンでコーティングしたライブイメージング用8ウェルマイクロスライドを準備します。ゼラチンコーティングを室温で5～30分間静置して固定させた後、余分なゼラチンを吸引して除去します。次に、ウシ胎児血清を添加したDMEM培地を用いて、コーティング済みの各ウェルに22,000個のmeth細胞を播種します。組織培養インキュベーター内で6時間培養します。DMEM培地を吸引して除去した後、添加済みのES培地を用いて、methコーティング済みの各ウェルに15,000個のR1胚性幹細胞を播種します。組織培養インキュベーターで一晩培養し、細胞のコンフルエンシーを50%まで高めます。翌日、細胞のコンフルエンシーが30から50%に達していることを確認してください。まず、古いES培地を250 µLの新鮮なES培地で交換します。次に、1.5 mLの滅菌試験管に、100 µLの無血清培地と、それに続いて10 µLのtransitを加え、トランスフェクション混合液を調製します。LTトランスフェクション試薬を1回分用意します。チューブを緩やかにピペッティングして混合し、室温で5～20分間インキュベートします。5～20分後、1.5 µgのGFP融合プラスミドDNAを加え、緩やかにピペッティングして混合します。その後、室温でさらに15〜30分間インキュベートします。トランスフェクション混合液が準備できたら、それを各ウェルに13.5 µLずつ加え、マイクロスライドを回転させて均一に分散させます。FRAPまたはFLIP解析に進む前に、インキュベーター内で細胞をさらに24〜48時間インキュベートします。24時間後、連続的に多くの画像を撮影するため、古いES培地を250 µLの新鮮なES培地に交換します。光退色機能を持つ Andor または Revolu

photobleaching-assays-frap-flip-to-measure-chromatin-protein-dynamics

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

FRAPは、緑色蛍光タンパク質（GFP）タグ付き培養細胞中のタンパク質の移動度を定量化するために使用されています。我々は、光退色後蛍光回復の割合を分析することにより、GFPのモバイル/不動の分画を検討した。本研究では、FRAPは、海馬ニューロンのスパインで行われました。...

培養海馬ニューロンの樹状突起棘の蛍光タグ融合タンパク質の光退色後蛍光回復（FRAP）

RNAポリメラーゼII転写反応速度は、生きた細胞内の特定の遺伝子を測定しています。興味のある遺伝子から転写されるmRNAは、蛍光標識と（FRAP）転写伸長の生体内動態が得られる光退色後蛍光回復を使用しています。...

単一生細胞におけるmRNAの転写の動態を測定

ここでは、pH感受性緑色蛍光タンパク質変異体pHluorinを用いて、細胞表面における軸索誘導受容体の密売の時空間的ダイナミクスを研究する。pHluorinタグ付き受容体は、細胞培養と...

細胞培養およびひよこ胚における軸索誘導受容体のダイナミクス評価におけるpHluorinの使用

生体内でゲノムにどのような影響を与えるかクロマチン制御因子とクロマチンの状態の問題は、細胞運命決定が発生中の胚になっている様子を、早期の我々の理解の鍵である。 ChIPの-SEQ-グローバルレベル-さアフリカツメガエル胚のためにここで概説でクロマチンの機能を調査するための最も一般的なアプローチ。...

クロマチンレギュレータと米国でのゲノムワイドスナップショット<em&gt;アフリカツメガエル</emChIPの-配列によって&gt;胚

光シートベースの蛍光顕微鏡による昆虫の胚の形態形成を撮像する技術の状態となっています。このプロトコルは、輪郭とモドキTribolium castaneumの胚に適した3つの取り付け技術を比較し、ライブイメージングに適して2つの新規のカスタムメイドのトランスジェニック系統を導入し、本質的な品質管理を説明し、現在の実験の限界を示しています。...

光シートベースの蛍光生活の顕微鏡または固定し、染色<em&gt;モドキTribolium castaneum</em&gt;胚

レーザー microirradiation は、細胞の DNA 修復の研究のための便利なツールです。様々 な DNA 損傷を誘発する UVA レーザーの使用のための方法論的アプローチが表示されます。正常な細胞周期; を維持するローカルの microirradiation...

タンパク質-タンパク質相互作用や DNA 損傷速度論を研究する共焦点の顕微鏡検査の技術を高度な

クロマチンの緩みは卵割球の進化の潜在性に関与することが表示されます。ただし、クロマチンの緩みを胚の発達の可能性を信頼性の高い指標として使用ことができるかどうかは知られていません。ここでは、クロマチン緩み評価受精卵が生じる完全な言葉こと実験的システムが記載されています。...

写真漂白後のココヤシの蛍光回復により、完全な長期的開発クロマチン緩みの解析

どのように FRAP など photoactivation のマイクロ ・ photomanipulation...

マイクロマニピュレーション技術形成ダイナミクスの解析と細胞骨格のレギュレータの売り上げ高

ここでは、プロトコルを提案フェルスター共鳴の同時使用のため力感受性の測定を有効にするタンパク質ダイナミクスを測定するため退色後蛋白質負荷と蛍光の回復を測定するエネルギー転送ベースのテンション...

蛍光技術の組み合わせを用いた生細胞内力感受性タンパク質ダイナミクスの測定

ウズラ胚モデル系における複数のタンパク質の迅速かつ効率的な発現を可能にする方法として、メッセンジャーRNA(mRNA)エレクトロポレーションを報告する。この方法は、蛍光的に細胞を標識し、エレクトロポレーション直後のタイムラプス顕微鏡検査によって生体内の動きを記録するために使用することができる。...

mRNAエレクトロポレーションを用いて鳥類胚における複数のタンパク質の迅速かつ効率的な発現

このプロセスは、シ ロイナ ナの蛍光標識核およびクロマチンマーカーラインと共焦点顕微鏡を用いて、シロイ ナナ...

シロイナ根における発生および環境ストレスにおける核形状とクロマチン動態の定量的ライブセルイメージング

学ぶFRAP・FLIP法による胚性幹細胞のクロマチン蛋白質ダイナミクス測定。GFP融合蛋白質を用いた光退色技術で、生細胞内の蛋白質動態と可動・不動割合を定量解析する方法です。

胚性幹細胞を生体内でクロマチン蛋白質のダイナミクスを測定するアッセイ（FRAP＆FLIP）を光退色

さらに動画を探す