無傷の感覚器官の前駆細胞の生細胞イメージングショウジョウバエ蛹
May 27th, 2011
このビデオでは、我々は非対称的に無傷で感覚器官の前駆細胞と表皮細胞を割っての生細胞イメージングのための方法を説明します。ショウジョウバエ蛹
この手順の全体的な目標は、変態中の分裂性胸部感覚器官前駆細胞またはSOP細胞のライブセルイメージングのためにDriss Pupiを準備することです。これは、まず、生細胞イメージング用の子孫ピュイを得るために適切な遺伝的クロスを設定することによって達成されます。手順の2番目のステップは、適切な段階でoph puyを収集して、非対称に分裂する神経前駆細胞を視覚化することです。
手順の3番目のステップは、イメージングのために蛹を取り付けるために瞳孔ケースを取り外すことです。手順の最後のステップは、スライドとカバースリップの間に蛹をマウントし、ライブセルイメージングに進むことです。最終的には、野生型または変異型感覚器官細胞の非対称細胞分裂および分化中の蛍光標識タンパク質のダイナミクスを示す結果を、エピ蛍光顕微鏡または共焦点顕微鏡法のいずれかで得ることができます。
免疫組織化学のような既存の方法に対するこの技術の主な利点は、タンパク質のダイナミクスをリアルタイムで、無傷の琵琶で数時間にわたって追跡できることです。UASの制御下で、1時間以内に経過したピュイを特定します。これらのピュイは特徴的な瞳孔の形態を持っていますが、色素沈着がありません。
選択したピュイは、新しいファイルに転送するか、クロスファイルに印を付けて、どのピュイが白かったかを記憶することができます。18時間後、ピュイが適切な段階に到達したら、顕微鏡スライド上に両面テープを貼り、解剖顕微鏡の下で瞳孔ケースをスライド腹側に接着します。一対の鉗子を使用してURMの端を特定してつかみ、そっと持ち上げると、未成熟のハエの頭が現れます。
ハエの体に穴を開けないように注意してください。瞳孔ケースの側面をそっと引き裂き、完全に取り外して胸部と腹部の前部を露出させます。同じ側を後部に向かって慎重に引き裂き続け、瞳孔ケースを反対側に引っ張ってテープに貼り付けます。
腹部が完全に露出したので、柔らかい毛のブラシを蛹の頭の下にそっと押し込み、瞳孔ケースの残りの部分から持ち上げます。蛹を顕微鏡スライドの背側を上にして置きますカバースリップが胸部SOP細胞領域に触れるように、蛹を45度の角度で配置します。まず、ワトマン濾紙で10×10mmの窓を中央に切り取り、18×18mm四方のフレームを作ります。
フレームを水に浸し、飽和するまでしてから、蛹の周りに置きます。5 ccのシリンジを使用して、フレームの周囲にシリコングリースの均一な層を塗布し、層の厚さが瞳孔の直径よりわずかに大きくなるようにします。22 x 22ミリメートルのカバースリップの中央に約1マイクロリットルの水をピペットで固定し、液滴が瞳孔のノドムに触れるようにカバースリップを配置します。
静かに押して、蛹に対して完全なシールと平らな面を形成します。生きた蛹がマウントされたので、解剖技術とマウント技術を組み合わせることで、共焦点顕微鏡を使用してイメージングできます。ライブイメージングでは、有糸分裂SOP細胞の切断溝におけるアクチンGFP融合タンパク質の蓄積を視覚化できます。
ここでは、時間の経過とともに、Num RFP と RAB 5G FP のパートナーの分布を 2 つの SOP ドーター セル間で比較できます。NUM RFP のパートナーは非対称に分布しているのに対し、RAB 5G FP は瞳孔後期に両方の細胞に均等に分布していることに注意してください。分化した外部感覚器官を可視化することができ、メノス感覚ソケットおよび毛髪は自家蛍光を示し、ここではSOP細胞のサブセットで発現されるL-G-L-G-F-Pと重なって示されている。
Markemシステムの使用 一度習得すると、このテクニックは適切に実行されれば10分以内に行うことができます。この手順に続いて、特定の抗体マーカーを持つ感覚器官細胞の硫酸塩の同定や、GFP融合タンパク質と内因性タンパク質の共局在研究などの追加の質問に答えるために、免疫組織化学などの他の方法を実行できます。
概要
このビデオでは、Drosophilaの完全な蛹における非対称的に分裂する感覚器前駆細胞と表皮細胞の生体内イメージング方法を紹介します。この手順により、細胞分裂と分化中のタンパク質ダイナミクスのリアルタイム可視化が可能になります。
主要な研究要素
科学の分野
- 神経科学
- 細胞生物学
- 発生生物学
背景
- 生体内イメージングは、細胞プロセスをリアルタイムで洞察することを可能にします。
- Drosophilaの蛹は、感覚器の発生研究のモデルとして役立ちます。
- 非対称的な細胞分裂は、適切な器官形成に重要です。
- 蛍光タグ付けにより、発生中の特定のタンパク質の追跡が可能になります。
研究の目的
- 分裂する感覚器前駆細胞のダイナミクスを視覚化すること。
- 非対称分裂中の娘細胞におけるタンパク質分布を比較すること。
- Drosophilaにおける感覚器の発生の理解を深めること。
使用した方法
- イメージングに適した子孫を得るために遺伝的交配を設定すること。
- 適切な発生段階で蛹を収集すること。
- 専門的な技術を使用して蛹をイメージング用にマウントすること。
- 蛍光タグ付けされたタンパク質を観察するために共焦点顕微鏡を使用すること。
主要な結果
- リアルタイムイメージングにより、細胞分裂中のアクチンやその他のタンパク質のダイナミクスが明らかになりました。
- SOP娘細胞にタンパク質の非対称分布が観察されました。
- 外部感覚器は自己蛍光を示し、視覚化を助けました。
- この技術は効率的に実行でき、実験のスループットを向上させます。
結論
- この方法は、Drosophilaの生体内細胞ダイナミクスを研究するための強力なツールを提供します。
- リアルタイムイメージングは、免疫組織化学などの従来の方法を上回ります。
- 将来の研究では、この技術を基にさらなる細胞レベルの質問を探求することができます。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Live-cell imaging of sensory organ precursor cells in intact Drosophila pupae enables real-time visualization of asymmetric protein dynamics during cell division, providing mechanistic insights into Notch signaling regulation. This approach supports target validation by allowing direct observation of fate-determinant segregation and pathway activity in a genetically tractable, disease-relevant system. The method enhances predictive confidence in early discovery by linking subcellular protein dynamics to cell fate outcomes, informing de-risking strategies for targets involved in asymmetric division and stem cell differentiation.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by visualizing asymmetric distribution of cell fate determinants like Numb during mitosis.
- Scientific Value: Supports functional target validation through real-time correlation of protein dynamics with Notch pathway inhibition in daughter cells.
- Operational Value: Facilitates biological de-risking by allowing comparison of wild-type and mutant conditions using MARCM mosaic analysis in intact tissue.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream workflows by establishing reproducible live imaging of SOP cell division in intact pupae.
- Operational Value: Addresses assay standardization and quantitative outputs through measurable protein localization patterns (e.g., actin at cleavage furrow, symmetric RAB5 distribution).
- Operational Value: Highlights screening readiness and scalability via a mounting protocol completed in under 10 minutes, enabling repeated imaging sessions.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Discusses disease relevance through evolutionarily conserved mechanisms of asymmetric cell division and Notch signaling in sensory organ development.
- Scientific Value: Describes translational continuity from discovery (SOP specification) through terminal differentiation (external organ formation with autofluorescence).
- Strategic Value: Supports risk-adjusted advancement decisions by linking protein dynamics to functional outcomes in progenitor cell lineages.
Pipeline & Workflow Integration
This method positions within the discovery continuum from Early Discovery to Lead Identification by enabling real-time assessment of target engagement and pathway modulation in asymmetric cell division.
- Discovery Biology: Explains how the method supports hypothesis testing, pathway clarification, and biological de-risking via direct visualization of Notch inhibitor segregation.
- Screening: Describes assay readiness, reproducibility, and quantitative outputs through standardized mounting and fluorescent protein tracking in mitotic SOPs.
- Analytics: Highlights measurements, readouts, or statistical outputs that help teams compare conditions, such as asymmetric vs. symmetric protein distribution in daughter cells.
- Translational Research: Connects the method to preclinical continuity through conservation of asymmetric division mechanisms in stem cell-driven tissue regeneration.
- Enterprise Reuse: Frames the method as a reusable capability rather than a single-use technique, adaptable to multiple GFP-tagged proteins and genetic backgrounds.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence, target validation, reduction of mechanistic ambiguity in cell fate specification.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability of live imaging in intact developmental models.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions, capital efficiency, and reduced late-stage biological risk through early mechanistic insight.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization and advancement decisions based on direct observation of target protein dynamics in disease-relevant contexts.
Implementation Considerations
- Required scientific expertise in Drosophila genetics, Gal4/UAS systems, and fluorescent protein tagging.
- Instrumentation and analytical infrastructure needs include confocal or epifluorescence microscopy and silicone-based mounting chambers.
- Cross-team standardization requirements for genetic crosses, pupal staging, and MARCM-based mutant analysis.
- Adaptation considerations across model systems, noting conservation of asymmetric division mechanisms but species-specific mounting adjustments.
- Practical limitations supported by source material: technique requires intact pupal thorax and is limited to stages where SOPs are mitotically active (first 12 hours post-pupariation).
