Cの生体レーザー軸索切断にエレガンス

本手順の全体的な目的は、in vivoにおいてレーザーを用いてCLニューロンを精密に切断することです。これは、軸索切断システムを組み立て、レーザーの焦点を精密に合わせ、光軸の調整および出力の調整を行うことで達成されます。線虫を顕微鏡スライド上で固定することで、空間的および時間的な精密な制御をもってニューロンを切断することが可能になります。

切断されたニューロンの再生程度は、成長円錐のスコアリング、またはニューライトの長さの追跡によって測定します。フェムト秒レーザーなどの既存の手法に対する本手法の主な利点は、マイクロポイントパルスレーザーが低コストなシステムであり、セットアップとメンテナンスが容易で、幅広い用途に容易に適応できることです。本手法は通常、GABA作動性運動ニューロンの再生研究に適用されますが、皮膚や筋肉などの他の細胞型、あるいは特定の神経シナプスの除去に使用することも可能です。

この手法にはマイクロポイントレーザーシステムが必要です。レーザーは複合顕微鏡のエピ蛍光ポートに取り付け、切断対象となる細胞内の蛍光色素に適合する単一のダイクロイックミラー、パルスジェネレーター、およびレーザー操作用のフットペダルを備えています。顕微鏡には、最低限、100倍 1.4 NAのオイル浸漬対物レンズと4倍の対物レンズを装備している必要があります。

ジョイスティック操作が可能な電動ステージを用意し、照明のためにエアテーブルに設置します。ライトガイドとシャッター機構を備えた光源をマイクロポイントレーザーに取り付けます。シャッター機構を用いることで、レーザーとは独立して照明強度を低減させることができ、有用です。

コンピュータに接続されたカメラには、少なくとも 16 hertz のフレームレートが必要であり、低光量下でも良好に動作しなければなりません。コンピュータには、ニューロンの観察、カメラの制御、および電動ステージの操作を行うための Nikon elements などのイメージングソフトウェアが必要です。完全に組み立てが完了すると、ユーザーは片手で顕微鏡のピントを合わせ、もう一方の手でステージを移動させ、フットペダルでレーザーを起動させながら、画面上の画像を鮮明に確認することができます。

砂粒ほどの大きさの生物におけるニューロンの切断は、困難を伴う場合があります。これを達成するには、レーザーを3次元すべてにおいて正確に集光させる必要があります。まず、Z平面のピント合わせから始めてください。

より精密なフォーカシングを行うため、ND 16のニュートラル密度フィルターを挿入してレーザーを減衰させ、ND 16と4つの蛍光フィルターの両方を挿入します。次に、スイッチを「select」に回してマイクロポイントレーザーをシングルパルスに設定し、フィルターホイールを適切なロングパスバリアフィルターに移動させます。ここで、ミラー付きスライドをステージ上に置き、4倍対物レンズと透過光を用いて、スライド内のピンホールにフォーカスを合わせます。

ピントを合わせた後、スライドにイマージョンオイルを1滴滴下し、100倍対物レンズでピンホールに再度ピントを合わせます。次に、光路切替レバーを使用してカメラシャッターを開き、レーザーシャッターを開きます。正確なフォーカス調整が困難な場合は、透過光強度を下げてピンホールのエッジを鮮明にします。

フォーカスを確認するため、フットペダルを使用してレーザーを照射します。Z平面のフォーカスが適切であれば、ミラーに小さな穴が現れます。次に、顕微鏡のフォーカスをミラーを貼ったスライドの平面よりわずかに上に合わせ、再度レーザーを照射します。

これにより、1回目よりもさらに小さな穴が開くか、あるいは全く跡が残らないはずです。ミラースライドの下に焦点を合わせた場合も、同様の結果が得られるはずです。しかし、もしより大きな穴が開いた場合は、アブレーションヘッドのフォーカスリングを使用してレーザーの焦点を再調整してください。

最後に、穴が接眼レンズの十字線と正しく揃っていることを確認してください。継続的に使用する場合、Z平面のフォーカスを調整する必要はほとんどありません。XY平面でレーザーをフォーカスさせるには、ミラーに別の穴を開け、Nikon elementsのソフトウェアにアクセスしてください。

取得メニューでライブキャプチャモードを開始します。計測ツールバーでROIエディタを選択し、ダブルクロスツールを選択して、十字線を新しい孔の中心に合わせてドラッグします。[Save ROI]をクリックし、エディタを終了してライブキャプチャを再開します。

マウスでステージを操作するには、マウスXY設定を有効にします。これでレーザーの焦点合わせが完了しました。ニュートラル密度フィルターを元の位置に戻し、今後の使用に備えてレーザーパルスを1から10に設定します。

まず、M9溶液を用いて3%のアガロース溶液を調製し、50 mLチューブに約5 mL分注します。チューブを55〜65 °Cのウォーターバスに入れ、残りは後で使用するために保存します。次に、ラベルを貼った2枚のスライドガラスを用意します。

きれいなスライドグラス2枚をテープで固定し、アガロースを1滴落として、虫を配置するためのパッドを作成します。30秒後にアガロースが凝固したら、0.05〜0.1 µmのポリスチレンビーズを3〜5 µL、パッド上にピペットで滴下します。10分以内に、白金ピックを用いて5〜10匹のトランスジェニック虫をビーズの上に素早く配置し、ラベル化されたニューロンが容易に観察できるようにします。虫を傷つけないよう、標準的なカバーガラスを虫の上に注意深く被せます。

スライドを動かします。これで、分類学的解析を行うためのワームスライドの準備が整いました。接眼レンズを使用して、4倍の倍率でワームを探し、100倍の対物レンズで焦点を合わせ直します。次に、透過光を消し、蛍光光を点灯させ、光路をカメラに切り替えます。

マウスを使用して、ニューロンを十字線の中心に合わせます。次に、フットペダルでレーザーを照射します。適切なレーザー出力であれば、1回または2回のパルスでニューロンを切断できます。

レーザー出力が高すぎると、周囲に損傷を与えたり、虫に穴が開いたりします。レーザー出力を調整するには、アッテネータープレートを移動させてください。レーザーが弱くなった場合は、アッテネータープレートの位置を調整して切断を継続できます。ただし、これは通常、レーザーのDセル内のKumar in four 40を交換する必要があることを示しています。正しく実施してください。

レーザー切断術により、ニューロンに小さな断裂が生じます。場合によっては、損傷部位の周囲に小さな瘢痕が形成されることがあります。実際には、動物1頭につき1〜3個のニューロンを切断しますが、理論的な制限はありません。

終了後、カバーガラスを真上に持ち上げて取り除き、虫がアガロースパッド上に残るように注意して回収します。カバーガラスを滑らせて外さないでください。ニードルノーズ鉗子を用いて、虫の周囲のアガロースパッドを切り出します。

OP 50を含む播種直後のNGMプレートにパッドを置き、10 µLの滅菌M9バッファーで線虫を解放します。切断後8時間から48時間で再生状態を評価できます。評価を行うには、健康な線虫を3〜5 µLのポリスチレンビーズ上に再固定し、神経細胞および切断された神経細胞を可視化します。切断部位より遠位の神経断端が残ります。遠位および近位の両断端は、切断直後に縮小しますが、近位断端からの再生が期待されます。

再生は、成長円錐の形成によってスコア付けすることができます。あるいは、通常、神経突起の長さを追跡して比較します。GABA作動性ニューロンの60～70%が、切断後24時間以内に成長円錐を形成します。レーザーで適切に切断できない場合は、レーザーのピントが合っていないか、ダイセル内の色素を交換する必要がある可能性が高くなります。

また、線虫が動き回る場合は、アガロースパッドが湿りすぎている可能性があります。この問題を回避するには、線虫を配置する前にパッドを約30秒間放置させる必要があることが分かっています。さらに、線虫を固定するために、より小さいサイズのマイクロビーズの使用を試みることもできます。

最後に、軸索にビーズ状の外観が見られる場合は、アガロースパッドが乾燥しすぎている可能性があります。このビデオを視聴することで、マイクロポイントレーザーシステムのセットアップ方法について十分な理解が得られたはずです。これにより、切断のための線虫の固定、個々のニューロンの切断、およびその後の再生の評価を行うことができます。