Name: インスリン注射と成人のインスリン感受性を測定する血リンパの抽出キイロショウジョウバエ /em (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-06-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 52 s
Description: 学ぶ成人Drosophila melanogasterの血リンパグルコース測定法。インスリン注射後のグルコースクリアランスを分光光度法で評価し、代謝疾患モデルとしての有効性を示す生理学的アッセイを確立する。

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1。インスリン溶液の調製<ol><li>は0.01 mg / mlの濃度を達成するためにPBSでインスリンを溶解することにより新鮮なウシのインスリン溶液を調製します。インスリン/ PBSおよび制御PBSの両方のソリューションは、注射の手順では氷上で保存する必要があります。これらのソリューションは、0.5％（v / v）のFD＆Cブルーなしで準備する必要があります。 1食品着色料。 </li></ol> 2。針の準備とセットアップインジェクション<ol><li>マイクロピペットpuller.Theを使用してガラスキャピラリーの針を準備し、以下の引き手の設定は、注射のための十分な品質の針の生成：熱、345、プル、210、速度、100;時間、200（100ミリ秒）。たて針は、キムワイプの組織を通じて、先端を押すことによって平滑化されている必要があります。この鈍化過程では、細長い高抵抗チップを削除し、より大きな細孔径を持つstouterのヒントを生成します。 </li><li>単独でインシュリン/ PBS溶液またはPBSを含むマイクロ遠心チューブにチップアッププレース鈍い針。各針のバック充填でアクションの結果をキャピラリー。ない破片や気泡が先端に表示されていないことを保証するために実体顕微鏡下で針の先端を観察。きれいに記入していない任意の針を捨てる。 </li><li>針の先端が実体顕微鏡を通して見えるようにマイクロマニピュレータを手動マイクロインジェクターのニードルホルダーとの位置ニードルホルダーに充填して針を挿入します。微量注入器の注射器のプランジャーに接続されている手動マイクロインジェクターのマイクロメーターのノブを回して、針の流体列に正圧を適用します。 </li><li>その流体の変位のための十分な圧力が針の先端にキムワイプを触れると流体の流れを確認することで適用されていることを確認します。 </li><li>いったん針が明確なテープ付き注射、貼付ニードルシャフトにキャリブレーションチャートの準備、および20倍の倍率下実体顕微鏡を介して焦点に針の先端を持参されています。 </li></ol> 3。準備を飛ぶ<ol><li> 10日齢の雌ハエは、注射の実験に使用されています。羽化後24時間以内にハエを集める。男性と場所雌ハエ標準出力または治療の食事療法を含むバイアルにガスのパッド上に加湿CO 2、ソートでハエを麻酔。 10日間実験飼料のメスのハエを維持する。 </li><li>実験飼料の上で羽化し、分離後10日目に、転送が2％寒天5mlのプラグを含むバイアルに彼らの食糧を含むバイアルの便を運行する航空会社と12〜16時間にわたってそれらを飢えさせる</li><li>インスリン注射前1時間、10％グルコース浸したフィルターを含むバイアルに飢えたハエを移す。 </li><li>簡潔にグルコースの給餌後に加湿CO 2でハエを麻酔してから、冷たい氷の上に固定化する。 </li></ol> 4。注射の手順<ol><li>優しく細かいピンセットを持つコールド固定化フライをつかみ、先端はフライの胸部の左側の前方領域に隣接するようにそれは針の先端に近いホールド。実体顕微鏡下で焦点に針の先端とフライの胸部の両方をもたらす。 </li><li>針の先端がフライの胸部（図1）の左前楯板領域の隆起の中心に触れるようにゆっくりと針の先端に向かって飛んで移動する。フライが適切な方向と針の先端で整列されると、針が前楯板の中心をimpalesように針の上にフライを進めていく。 </li><li>流体の0.1μlのハエに注入されるまで、マイクロインジェクターのマイクロマニピュレータのノブとシリンジのプランジャーを進めることによって、必要に応じて正圧を適用します。ハエの血体腔への流体の流れは、前胸部の左側に青い色を与えるだろう。時折一つは、任意の針の先端の閉塞を取り除くと流体の流れを可能にするために数回を収納して進める必要があります。 </li><li>注入されたハエは、血リンパの抽出の前に指定された時点で2％寒天バイアルに回復することができます。 </li></ol> 5。血リンパコレクション<ol><li>簡単に言うと、目的のポスト噴射の時点と位置で加湿CO 2でハエを麻酔背側を下にCO 2パッドの表面に貼付両面テープ上の各フライ。整列頭部カプセルと偶数行でハエを手配。一つは、テープの接着剤に羽を押すと固定化を確保するためにトリミングされた木製のアプリケータースティックを使用することができます。 </li><li>頭部カプセルの前面にステレオ顕微鏡を通して見えるように一度ハエが、テープに固定細かい鉗子でそれぞれのハエの口吻を持ち、ゆっくりとフライの腹側と後、後部領域に向かってそれを引いている。 </li><li>もう一方の手を持つとの位置に口吻を保持しながら、穿刺だけでシャープなタングステン針（図2）を使用してptilinal縫合上記頭部カプセルの中心地。一つは、あまりにも遠く、それは頭部のカプセルの他の側面に針の先端をパンチするのは簡単ですし、続いてcを失うように針を挿入しないように注意する必要があります血リンパの流れのontrol。穿刺は全血リンパを収集する前に注射群で飛ぶ。 </li><li>頭部カプセルが破裂されると、そっとその場の腹部に圧力を適用するためにトリミングされた木製のアプリケータースティックを使用してください。それはあなたが圧力を適用すると、その腹側に置いたようにフライをロールオーバーすると便利かもしれません。この手順では、頭部カプセル穿刺部位から血リンパの液滴が生成されます。 </li><li>頭部カプセル穿刺部位から出てきた体液の液滴に1μlのマイクロキャピラリーチューブの一方の端をタッチしてください。血リンパは、毛細管現象を介してチューブを入力します。卒業ボリュームのチャートに対して、マイクロキャピラリーチューブ内の流体の列をチェックして収集した血リンパの量を決定し、記録します。 </li></ol> 6。体液のグルコース定量<ol><li>インフィニティグルコース液100μlを含むマイクロプレートウェルに体液のサンプルを取り出します。血リンパのサンプルをロードしながら氷の上でプレートを保管してください。 </li><li> 50mmの25mmの、12.5mmの、6.25mMと3.125mMで別々に1μlのグルコースストック溶液のそれぞれをロードすることによって標準曲線を確立する。 </li><li> 37サンプルをインキュベート° Cで1​​0分間。 </li><li> 340nmで吸光度を検出する。 </li><li>血リンパのボリュームのアカウントが収集され、既知のグルコース濃度の標準曲線に基づいて、サンプルのグルコース濃度を決定する。 </li></ol> 7。代表的な結果典型的なインスリン耐性の応答はグルコースの循環レベルの低下は15分後の注射を検出されるインスリン注入ハエで検出される。対照的に、そのような応答は、PBSを注入ハエ（図3）には見られません。末梢グルコース処理のこの応答は30分後に注射するインスリン注入のハエで続行されます。我々は定期的に各注射群では4〜5ハエごとに血リンパの0.2から0.5μlを抽出する。三注入グループは各実験に含まれています。 <img src="/files/ftp_upload/2722/2722fig1.jpg" alt="図1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図1"> 図1針の挿入部位（Demerec、1950年から変更された） 中7件を表示ショウジョウバエの胸部の左側。胸部の左側の前部、背部上の前楯板の中心を通って針を挿入します。 <img src="/files/ftp_upload/2722/2722fig2.jpg" alt="図2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図2"> 図2血リンパの抽出のための穿刺の場所（Demerec、1950年から変更された） 中7件を表示ショウジョウバエの頭部の正面図。穿刺だけptilinal縫合上記頭部カプセルの中央に細かく削ったタングステンプローブを備えたヘッドカプセル。 <img src="/files/ftp_upload/2722/2722fig3.jpg" alt="図3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図3"> 図3：コントロールの成人で検出された典型的なインスリン負荷応答が飛ぶ。コントロールワット1118ハエは、ウシインスリン（PBS中の1 NG）またはPBSのみを注射した。複製グループのハエは、0、15または30分間回復させたと循環グルコースレベルを測定した。

<ol><li>Rulifson, E. J., Kim, S. K., Nusse, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ablation+of+insulin-producing+neurons+in+flies%3A+growth+and+diabetic+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Ablation of insulin-producing neurons in flies: growth and diabetic phenotypes.</a> Science. 296, 1118-1118 (2002).</li>
<li>Kim, S. K., Rulifson, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conserved+mechanisms+of+glucose+sensing+and+regulation+by+Drosophila+corpora+cardiaca+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Conserved mechanisms of glucose sensing and regulation by Drosophila corpora cardiaca cells.</a> Nature. 431, 316-316 (2004).</li>
<li>Broughton, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Longer+lifespan%2C+altered+metabolism%2C+and+stress+resistance+in+Drosophila+from+ablation+of+cells+making+insulin-like+ligands%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Longer lifespan, altered metabolism, and stress resistance in Drosophila from ablation of cells making insulin-like ligands.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 3105-3105 (2005).</li>
<li>Haselton, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Partial+ablation+of+adult+Drosophila+insulin-producing+neurons+modulates+glucose+homeostasis+and+extends+life+span+without+insulin+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Partial ablation of adult Drosophila insulin-producing neurons modulates glucose homeostasis and extends life span without insulin resistance.</a> Cell Cycle. 9, 3063-3063 (2010).</li>
<li>Haselton, A. T., Fridell, Y. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+Drosophila+melanogaster+as+a+model+for+the+study+of+glucose+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+%28Albany+NY%29%22%5BJournal%5D)">Adult Drosophila melanogaster as a model for the study of glucose homeostasis.</a> Aging (Albany NY). 2, 523-523 (2010).</li>
<li>Belgacem, Y. H., Martin, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+insulin+pathways+alters+trehalose+level+and+abolishes+sexual+dimorphism+in+locomotor+activity+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Disruption of insulin pathways alters trehalose level and abolishes sexual dimorphism in locomotor activity in Drosophila.</a> J Neurobiol. 66, 19-19 (2006).</li>
<li>Demerec, M. Biology of Drosophila. , John Wiley & Sons. New York. (1950).</li>
</ol>

利害の衝突は宣言されません。

このレポートに記載されている方法は、 ショウジョウバエの血リンパの組成の検出可能な変化をもたらす生理学的プロセスを調査するあらゆる研究に有用である可能性がある。この方法で注入し、血リンパのコレクションを組み合わせることで、それは特定の実験的治療または操作の直接の生理学的に関連する影響を把握することが可能です。断頭2を含む以前の技術よりも体液のコレクションでこの&quot;流血&quot;技術の主な利点は、腸contents.Ifケアが時々に現れる可能性のあるpericerebral脂肪体の組織を、収集しないように取られるとこの手法は、体液サンプルの汚染を最小限に抑えることです。血リンパの液滴を滲み、その後のサンプルは、正確に生体内循環液の状態を反映している必要があります。 このスケールで実行されたすべての注入実験に内在する潜在的交絡因子は、注射後の総循環流体の初期希釈です。これは、簡単に年齢をマッチさせたコントロールに実験的なハエやインスリンのPBSの同じ量を注入し、結果を正規化することによって、しかし、し...

<table border="1"><tbody><tr><th>試薬/装置の名前</th><th>会社</th><th>カタログ番号</th></tr><tr><td>ウシインスリン</td><td>シグマ</td><td> I5500 </td></tr><tr><td>無限のグルコース試薬</td><td>サーモエレクトロン株式会社</td><td> TR1541 </td></tr><tr><td>手動マイクロインジェクター</td><td>サターのインストゥルメント</td><td></td></tr><tr><td> P - 87 Flamming /ブラウンマイクロピペットプラー</td><td>サターのインストゥルメント</td><td></td></tr><tr><td>シングルバレルホウケイ酸ガラスキャピラリー</td><td> AMシステム</td><td> 626000 </td></tr><tr><td> FD＆C青色1号</td><td>マコーミックアンドカンパニー</td><td></td></tr><tr><td> 1μlのマイクロキャピラリーチューブ</td><td>ドラモンド</td><td></td></tr><tr><td>三軸の手動マイクロマニピュレーターとベース</td><td>世界の精密機器</td><td></td></tr></tbody></table>

インスリン注射と成人のインスリン感受性を測定する血リンパの抽出キイロショウジョウバエ</em

Insulin Injection and Hemolymph Extraction to Measure Insulin Sensitivity in Adult Drosophila melanogaster

保存された栄養感知のメカニズムが発達幼虫期の1,2時の血糖値の恒常性を維持するために、それぞれのペプチドは哺乳類のインスリンとグルカゴンに似た哺乳類やショウジョウバエ、機能間に存在する。主に有糸分裂後の成人のハエの研究は、インスリン様ペプチドの遺伝子除去（ILP）産生細胞（IPC）を3の結果としてグルコースの恒常性の摂動を明らかにした。したがって、成人ミバエは、II型糖尿病を含む代謝性疾患に適した遺伝的モデルシステムとして有望視されて保持する。さらにショウジョウバエのシステムを開発するには、哺乳動物における耐糖能とインスリン感受性を測定するために使用される同等の生理的アッセイを確立する必要があります。この目的のために、我々は最近、成人のハエにおける経口ブドウ糖負荷応答を測定するための新たな手順を記載していると4,5グルコース恒常性を維持するに成人IPCの重要性を示した。ここで、我々は、インスリンの注射6前述の手順を変更し、成体のハエで、末梢インスリン感受性を測定するために新たな血リンパの抽出法とそれを組み合わせている。一意に、我々のプロトコルは、インスリン注射、インスリンシグナル伝達変異体と大人のハエの耐糖能とインスリン感受性に影響を与える潜在的な介入を特徴づけることが可能になる方法論に応じて末梢グルコース負荷を処分する大人ハエの能力の直接的な生理学的な測定が可能です。

ショウジョウバエに見られる保存されたインスリンのシグナル伝達経路<em&gt;キイロショウジョウバエ</em&gt;この生物II型糖尿病を含む代謝性疾患をモデル化するための潜在的なツールとなっています。そのためには、効果的に成人ハエの末梢グルコース処理の全身のインスリン作用を測定するための生理学的アッセイを確立することが重要です。

哺乳類とショウジョウバエの間には保存された栄養感知機構が存在し、哺乳類のインスリンおよびグルカゴンにそれぞれ類似したペプチドが機能している。

この手順の全体的な目的は、成体のdrosophila melanogasterにおける血リンパ糖濃度に対するインスリン注入の影響を測定することです。まず、飢餓状態のショウジョウバエに濃縮グルコース溶液を摂取させ、次に、グルコースを摂取させたハエにインスリンを注入することでこれを達成します。本手順の3番目のステップは、汚染されていない血リンパ・サンプルを採取することです。手順の最終ステップは、血リンパ中のグルコース濃度を測定することです。最終的に、分光法を用いて、外因性インスリンが Esof la Melan gaster におけるグルコースクリアランスを促進することを showing する結果を得ることができます。成虫の斬首出血などの既存の手法と比較した本手法の主な利点は、この処置によって腸内容物を最小限に抑えられる点にあります。これにより、血リンパサンプルの汚染を防ぎます。加湿二酸化炭素を用いて麻酔をかけ、閉塞から24時間以内にハエを回収してください。雌のハエを選別し、標準飼料の入ったバイアルに入れます。ショウジョウバエを10日間 aging させます。10日後、2%アガロースの5 mLプラグを含むバイアルにハエを移し、12～16時間飢餓状態にします。インスリン注入の1時間前に、飢餓状態のハエを10%グルコースを浸したフィルターペーパーが入ったバイアルに移します。注入用インスリン溶液を作成するには、牛インスリンをリン酸緩衝生理食塩水に溶解し、最終濃度を0.01 mg/mLにします。また、PBSのみを含むコントロール溶液も調製します。インスリン溶液とコントロール溶液の両方に、最終濃度が 0.5% になるように青色の食用色素を加え、全工程を通して両溶液を氷上で保持します。新しく引き出したガラス針の先端を、キムワイプに押し付けて鈍らせます。孔径の大きい丈夫なチップを作成するには、鈍化した針の先端を上にして、インスリン溶液またはコントロール溶液が入ったマイクロ遠心チューブに入れ、毛細管現象によって針の内部を満たします。実体顕微鏡下で各針に気泡がないかを確認し、完全に充填されていないものは廃棄してください。充填済みの針を手動マイクロインジェクターの針ホルダーに挿入し、マイクロマニピュレーターを用いて、針先が実体顕微鏡で確認できる位置にホルダーを配置します。マイクロインジェクターシリンジのプランジャーに取り付けられたマイクロメーターノブを回し、ニードル内の液柱に正圧をかけます。化学拭き取り用ワイプをニードルチップに触れさせ、液体が流れるのに十分な圧力がかかっているかを確認します。注入の準備が整ったニードルに、透明テープで校正チャートを固定し、実体顕微鏡を用いて20倍の倍率でニードルチップに焦点を合わせます。グルコースを投与したショウジョウバエを、加湿した二酸化炭素で短時間麻酔し、実体顕微鏡下で麻酔状態を維持するため、氷上のパッドの上に置きます。微細ピンセットでハエを1匹つかみ、針の先端がハエの左側前胸領域に隣接するように針の近くに保持します。針の先端とハエの胸部の両方に焦点を合わせます。ハエをゆっくりと針先へ移動させ、針先がハエの左前胸部の隆起の中心に触れるようにします。胸部をさらに針の方へ進め、針が前胸部の中心を貫通するようにします。マイクロインジェクターのマイクロマニピュレーターノブを使用してシリンジプランジャーを押し、0.1まで正圧をかけます。インスリン溶液またはコントロール溶液を数µL、ショウジョウバエに注入しました。注入により、前胸部の左側に青色が付着します。注入したハエを2% Arosファイル内で回復させ、血リンパ抽出前に0分、15分、30分の反復グループに分けて待機させます。その間、二面テープを二酸化炭素パッドに固定してください。ゼロ群のハエを麻酔し、頭部カプセルが揃うように、背面を下にしてテープ上に均等な列に配置します。ハエをテープに固定後、微細ピンセットでハエの口器（proboscis）を掴み、腹側、次いで後方へ向けてゆっくりと引いて、頭部カプセルの前面が見えるようにします。口器を固定したまま、鋭いタングステン針を用いて、頭部を完全に貫通させないよう注意しながら、頭部カプセルの縫合線（lenal suture）の上方を穿刺します。すべてのショウジョウバエに穿刺した後、先端を整えた木製アプリケータースティックを使用して、ハエの腹部に軽く圧力をかけます。これにより、頭部カプセルの穿刺部位から少量の血リンパ液が滴下します。1 µLのマイクロキャピラリーチューブの先端を、この血リンパ液の滴に触れさせます。分光光度計を用いて、マイクロキャピラリーチューブ内の液柱を計量体積表と照らし合わせ、採取した血リンパの量を決定し記録します。340 nmでの吸光度を測定してグルコース濃度を決定します。ウシインスリン溶液を注入したハエは、対照溶液を注入したハエと比較して、注入後15分および30分の時点で血リンパ中のグルコース濃度が低下していることが示されました。このビデオを視聴することで、成体ショウジョウバエへの少量の溶液の注入方法、成体ショウジョウバエからの血リンパの抽出方法、および本手順に従った成体ショウジョウバエの血リンパ中グルコース濃度の測定方法について十分に理解できるはずです。タンパク質濃度の測定や血リンパ中のトリグリセリド濃度の測定などの他の実験を行うことで、「インスリンは成体ショウジョウバエの栄養代謝の関連側面にどのような影響を与えるか」といった疑問に対する答えを得ることができます。

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