げっ歯類やヒトから鼻嗅覚幹細胞を単離する

本手順の全体的な目的は、分子レベルの異常を特定すること、あるいは病理学的または外傷を負った脳を修復することを目的に、ラットまたはヒトから鼻腔嗅覚幹細胞を単離することです。まず、外科的に鼻腔から嗅粘膜生検試料を採取します。次に、嗅上皮およびその上皮幹細胞を除去して、下層の固有層にある外胚葉性間葉系幹細胞に焦点を当て、その後、げっ歯類組織を解離させるか、あるいはガラスカバースリップ上で培養したヒトインプラントから増殖細胞を回収することで、これらの細胞を単離します。

本手順の最終ステップは、幹細胞スフィアを培養し、ニューロン様細胞への分化を誘導することです。最終的に、嗅粘膜全体から個別の幹細胞を分離・採取します。浮遊スフィアまたはニューロン様細胞は、脳疾患における分子マーカーの特定や、神経系の損傷修復に利用することが可能です。

ここでは、嗅粘膜からヒトおよび齧歯類の鼻腔幹細胞を単離する方法について説明します。既存の手法に対する本手法の主な利点は、これらの幹細胞が神経組織に属しており、あらゆる生存個体から容易に採取可能であること、そして病的な脳の診断や修復に利用できることです。私は耳鼻咽喉科医として、数多くの臨床研究のために数百例の鼻腔生検を実施してきました。

この処置は安全であり、実施可能です。また、局所麻酔または全身麻酔下で行われます。私は、ヒトまたはラットの鼻腔由来幹細胞の培養を専門とする若手研究者です。

これらは高い増殖能と神経細胞への分化能を示します。これらは、健忘症やパーキンソン病の動物モデルにおいて有効であることが証明されています。粘膜を採取する前に、クリーンベンチ内でDMEM/F-12培地を調製した35 mmペトリ皿を3枚用意します。

足指への刺激により、ラットがペントバルビタールナトリウムによって深い麻酔状態にあることを確認した後、断頭により安楽死させます。頭部を分離し、皮膚を取り除きます。鋏で下顎を取り除き、自身の器具を用いて、切歯の後方から両側の顔面筋を除去します。

ロン・ジュール（Ron Jur）を使用して、鼻腔を覆っている骨を片側ずつ除去します。鼻腔の奥にオレンジ色または茶色の器官として嗅甲介が見えてくるので、ピンセットを用いて慎重に除去します。

26ゲージの針を用いて、垂直板の弧、篩骨板、および鼻腔天蓋の3本のラインに沿って組織を切断し、中隔にある嗅粘膜を分離します。両側から生検検体を採取し、A-D-M-E-M ham F 12を満たしたペトリ皿に移します。この手順は、安楽死の開始から10分以内に完了させる必要があります。

次に、粘液を除去するため、生検組織を培地を満たしたペトリ皿に2回移します。本手順は、地域の関連倫理委員会の規定に従い、耳鼻咽喉科医が実施する必要があります。また、すべての外来患者からインフォームドコンセントへの署名を得てください。0度または30度の硬性内視鏡を用いて、両側の鼻腔を検査し、ポリープや炎症性病変の有無を確認します。

鼻中隔の弯曲を考慮して、最適な鼻腔を選択します。綿棒を使用し、エピネフリン配合リドカインなどの局所麻酔薬を塗布し、十分に浸透するまで10分間置きます。篩骨鉗子を用いて、中鼻甲介内側の根部または鼻中隔の背側内側領域から、2平方ミリメートルの生検組織を採取します。

ここでは、根部領域からの生検組織を示します。次に、滅菌針を用いて嗅覚生検組織を、1 mLのDMEM/F-12で満たした滅菌済みの2 mLチューブに移します。チューブを逆さまにし、生検組織が確実に培地に浸っていることを確認してください。

チューブを冷蔵容器に入れ、研究室まで輸送します。この段階で、生検組織をそのまま特定の脳疾患に焦点を当てた比較分子研究に使用するか、あるいは幹細胞作製のために処理することができます。ヒトまたはラットの生検組織を洗浄し、1 mLのDMEM ham F 12で満たしたペトリ皿の中で生検組織をインキュベートします。

37 °Cで1時間、2つの溶液に浸します。次に、解剖顕微鏡下で拡散反転光を用い、マイクロスパチュラを使用して、ヒトまたはラットの嗅上皮をその下層にある固有層から分離します。嗅上皮は黒色の背景に対して半透明に見えますが、固有層は白色の背景に対してオレンジがかった褐色に縞模様に見えます。

精製後、上皮は灰色に、固有層は茶色に見えます。固有層をDMEM/F-12で満たしたペトリ皿に移します。組織がげっ歯類由来である場合は、25ゲージの針2本を用いて固有層を小さく切断します。次に、これらの断片を1 mLのcollagenase 1Aが入った15 mLチューブに移し、滅菌プラスチックピペットを使用して組織を分散させます。

その後、チューブを37°Cで10分間インキュベートします。解離を停止させるために、チューブを静かに揺らしながら、カルシウムおよびマグネシウム不含のPBSを数mL加え、200 ×gで5分間遠心分離します。細胞ペレットを培地で再懸濁し、プラスチック培養皿に播種します。

次に、組織がヒト由来である場合は、レモンを適切に3〜4個の断片にスライスします。4ウェルプレートの各ウェル（直径2 cm）に、スライスした組織を1片ずつ挿入し、滅菌済みのガラスカバースリップ（直径1.3 cm）で組織を覆います。

次に、いずれの組織型においても、各培養皿に500 µLの培地を加えます。培地は2〜3日ごとに交換してください。5〜7日間培養すると、幹細胞が培養皿へと浸潤し始めます。

2週間後には、細胞がコンフルエントになるはずです。コンフルエントに達したら、継代して細胞を培養フラスコに移し、幹細胞球を形成させます。

2日ごとに、前処理済みのフラスコに16,000 cells/cm²の密度で細胞を再播種します。細胞に0.2 mL/cm²の添加剤入り培地を供給します。2〜5日後、浮遊している細胞球を回収し、移植前に再播種または分散させます。

嗅覚幹細胞をニューロン様細胞へと分化させる細胞療法の動物モデルです。B 27、ペニシリン、ストレプトマイシン、グルタミン、およびグルタミン酸を含むNeurobasal培地で細胞を21日間培養し、3日ごとに培地交換を行います。ニューロン様細胞は、播種から5〜7日後、合計2〜3週間後に現れます。

ヒト鼻腔嗅覚幹細胞は外植片から成長し、急速に増殖しました。1〜2週間以内に十分なコンフルエント状態に達することが可能です。幹細胞の重要な特性であるネスチン（nestin）の発現を評価するため、ポリリジンコート皿を用い、EGFおよびFGF-2を添加した無血清培地で培養したところ、嗅覚幹細胞はスフィアを形成しました。これらのスフィアを血清含有培地に播種すると、さらなる分化・増殖が認められました。

培地において、それらは約50%のGFAP発現細胞、最大15%のtubulin発現細胞、および最大5%のolig2発現細胞を含む細胞集団を形成しました。スフィア由来細胞を添加剤入りのneurobasal培養培地で培養したところ、集団の大部分がbeta-III tubulinを発現するニューロン様細胞となりました。これらのニューロン様細胞は、MAP2も同様に発現していました。

このように、幹細胞の運命は1学期で変更させることができました。この手法を用いれば、4週間足らずで数百万個の幹細胞を容易に生成および維持することができ、臨床医による将来的な自己細胞移植が可能になります。鼻腔内抵抗性生検は、バイオマーカーや脳疾患の特定に非常に有用です。

最近、私たちは自閉症の新たな候補遺伝子の特定に成功しました。すでに自閉症患者および対照群の個体から嗅覚幹細胞バンクを構築しており、これは他のヒト脳疾患へも応用可能です。