遺伝学的およびエピジェネティクス解析のためのパラフィン包埋材料からのDNA抽出

このビデオでは、パラフィン包埋組織サンプルからDNAを抽出する方法を説明します。このデモンストレーションで使用するサンプルは、直径3 mm、長さ6 mmの組織コアです。今回は1つのコアを使用しますが、直径5 mm、長さ10 mmを超える大きなサンプル、または今回使用したサイズのコア2〜3個を、1回の手順で処理することが可能です。

ただし、パラフィンを完全に除去し、組織を十分に消化させるために、プロトコルの調整が必要になる場合があることに注意してください。組織への処理を行う前に、組織を保存しているワックス状のパラフィンを溶解させる必要があります。キシレンとフェノールは毒性があるため、これはキシレンを用いて行います。これらの化学物質を使用する作業はすべてドラフトチャンバー内で行い、サンプルが入ったチューブに800 µLのキシレンを加えてください。

次に、サンプルをロッカーに置き、緩やかに振盪しながら10分間放置します。14,000 RPMで3分間遠心分離してサンプルをペレット化し、チューブからキシレンを除去してパラフィンを溶解させます。パラフィンが完全に溶解するまで、これらの手順を2〜3回繰り返します。

組織は湿っており、柔らかい状態でなければなりません。最終的なDNA回収量を増やすためには、すべてのパラフィンを除去することが重要です。したがって、組織サンプルが大きい場合は、より多くの洗浄回数が必要となります。

サンプルからパラフィンが除去されたので、組織の消化を可能にするために組織を再水和させる必要があります。これはエタノール再水和系列を用いて行います。まず、サンプルに800 µLの100% ethanolを加え、ボルテックスした後、14,000 RPMで3分間遠心分離します。

上清を除去します。これらの手順を、800 µLの70%エタノール、次に50%エタノールを用いて繰り返します。組織の凝集性が低下し、ペレット化に強い遠心力が必要になるため、最後の遠心処理は5分間行います。

次に、細胞からDNAを放出させるために組織を消化させる必要があります。これは、SDSなどのタンパク質変性剤と、組織分解を担う酵素であるプロテイナーゼKを含む溶液である溶解バッファーを用いて行います。

サンプルに200から500 µLの溶解バッファーを加えます。サンプルのサイズによりますが、400 µLが適切な量です。もちろん、溶解バッファーの成分および56 °Cのインキュベーション温度は、タンパク質の活性を最大化させるためのものです。

ACE Kはタンパク質であるため、組織を分解できる期間には限りがあり、反応を継続させるには酵素を定期的に添加する必要があります。濃度10 mg/mLのACE Kタンパク質を20 µL、組織が完全に溶解するまで朝夕にサンプルに添加します。

固形組織が見えなくなった時点で、細胞残渣バッファーからDNAを抽出する必要があります。飽和フェノールを用いて、サンプルを水相と有機相に分離します。水相にDNAが含まれています。

通常のフェノールの酸性はDNAを分解させるだけでなく、水相と有機相の層の順序を逆転させてしまうため、緩衝液飽和フェノールを使用することが重要です。緩衝液飽和フェノールは2相に分かれて保存されており、フェノールが下層になることに注意してください。

サンプルに等量の緩衝液飽和フェノールを加え、チューブを数回反転させます。次に、サンプルを遠心分離機にかけ、14,000 RPMで5分間遠心分離して相分離を誘導します。

DNAおよびRNAは上層の水相に、タンパク質、脂質、および多糖類は中間相および下層の有機相に回収されます。中間相を乱さないように注意して水相を取り除き、新しいチューブに移します。多くの場合、1回目の遠心後、界面は緩んで戻りやすくなっています。

少量の水を用いて抽出を行う必要があります。逆抽出のプロトコルは、本ビデオに付随するテキストで確認できます。界面が透明になるまでこれらの手順を繰り返します。通常、3〜5回繰り返すと界面が透明になります。DNAサンプルに同量のフェノール・クロロホルム・イソアミルアルコールを加えて進めてください。

これはフェノール単独の場合と同じ目的で用いられますが、界面を明確にすることでDNAの回収率を最大化します。界面が透明かつ鮮明になるまで、この手順を1回または2回繰り返します。サンプルのタンパク質が除去されたので、次に混入しているRNAを除去する必要があります。

これはRNAによって達成されます。サンプルにRNA分解酵素Aを最終濃度100 µg/mLで添加し、37 °Cで1時間インキュベートします。RNAが分解された後、RNAA酵素を除去する必要があります。

DNAのクリーンアップ手順を前述と同様に繰り返します。最初に緩衝液飽和フェノールを使用し、次にフェノール・クロロホルム・イソアミルアルコールで処理することで、現在の汚染物質がRNA A酵素と分解されたRNAのみであるため、クリーンアップの回数を減らすことができます。サンプルがDNAのみとなったところで、溶液からDNAを沈殿させる必要があります。1/10量の酢酸ナトリウムと1容量のイソプロパノールを加えてください。

あるいは、2.5倍量のエタノールを添加することも可能ですが、その場合はより大きなチューブが必要になります。サンプルを-20°Cで30分から1時間、あるいは夜間に作業を行う場合は一晩インキュベートしてください。DNAを取り扱うため、分解を防ぐためにサンプルを常に氷上で保持してください。

沈殿したDNAをペレット化するため、サンプルを4 °Cで14,000 RPMにて10分間遠心分離します。シーケンシングなどの後続の実験に影響を及ぼす可能性のある過剰な塩を除去するため、ペレットを剥がさないように注意しながら上清を取り除きます。例えば、冷却した70% ethanolを1 mL加え、緩やかに再懸濁します。

サンプルを再び14,000 RPM、4°Cで10分間遠心分離します。上清を注意深く取り除き、余分なエタノールを最大5分間自然乾燥させます。サンプルを乾燥させすぎないことが重要です。

最後に、DNAを精製し、任意のバッファーで再懸濁できる状態にします。ここでは、オートクレーブ滅菌済みの蒸留水を使用します。

DNAサンプルは、後で使用するために-20°Cで保存します。抽出完了後、DNAの品質と量を評価する必要があります。これはNanoDrop 3000を用いた分光光度法により行います。測定タイプに「nucleic acid」を設定し、計算方式に「DNA 50」を選択し、1.5 µLの水を用いて装置の初期化（ブランキング）を行ってください。

ペデスタルを洗浄し、希釈液として1.5 µLの蒸留水を用いてブランク測定を行います。ペデスタルを洗浄し、1.5 µLのサンプルをロードして測定ボタンを押します。はい。完璧です。

この時点では、A260/A280比が1.8であることが理想的です。抽出したDNAは、アレイ、比較ゲノムハイブリダイゼーション、メチル化DNA免疫沈降、シーケンシングなどを含む（ただしこれらに限定されない）下流のアプリケーションに使用可能な状態になります。

これらのプロトコルのリンクをここに示します。すぐに必要ない場合は、サンプルを-20 °Cで保存して後で使用してください。