Name: 遺伝学的およびエピジェネティクス解析のためのパラフィン包埋材料からのDNA抽出 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-03-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 32 s
Description: 学ぶ パラフィン包埋組織からのDNA抽出法。キシレンによる脱パラフィン化、エタノール系列の再水和、プロテイナーゼKを用いた組織消化、フェノール・クロロホルム抽出を含む完全なプロトコルを解説。高品質DNAの回収と遺伝学的・エピジェネティクス解析への応用を実証する。

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我々は、彼らの評価とこのビデオと記事の批判のためにラムの研究室のメンバーに感謝したいと思います。この作業は、保健研究のためのカナダの協会からの資金によって支えられている。

<p class="jove_title"&gt; 1。操作上の留意事項</p&gt;<ul&gt;<li&gt;キシレンとフェノールは有害な化学物質であり、fumehoodで処理する必要があります。使用前に製品安全データシート（MSDS）を参照してください。</li&gt;<li&gt;キシレンは、特定のプラスチックを溶かして、彼らはこれらの化合物を許容するようにポリプロピレンチューブを使用する必要があります。</li&gt;<li&gt;特別なヒントは、内部の木炭のストッパーが含まれている購入してもよい。これにより、ピペット内の任意のゴム成分を溶解からキシレンを防ぎます。また、フィルター付きチップを使用することができます。</li&gt;</ul&gt;<p class="jove_title"&gt; 2。パラフィン除去</p&gt;<ol&gt;<li&gt; fumehoodでは、パラフィンを溶解するために5〜15分間穏やかに振盪しながらロッカー上に試験片と場所を含むラベルの付いたチューブにキシレンの800μlを（VWR、CABDH6216 - 4）を追加。</li&gt;<li&gt;ペレット3分間微量遠心機で最高速度（14,000 rpmまたは16 000 × g）で回転させてサンプル。慎重にキシレン上清を撤回し、キシレン廃棄物の廃棄のためにポリプロピレンチューブに処分する。ペレットを乱さないように注意してください。</li&gt;<li&gt;繰り返しキシレン洗浄ステップ1と2untilパラフィンが完全に溶解させる。これは通常、組織サンプルのサイズに応じて、2〜3回の洗浄が必要です。完全に溶解したサンプルはソフト表示され、そして時には、その構造的な整合性を失うことになる。サンプルの完全性は、ピペットチップで評価することができます。</li&gt;</ol&gt;<p class="jove_title"&gt; 3。エタノールの水分補給</p&gt;<ol&gt;<li&gt; 100％エタノール（v / v）の分子生物学グレードのエタノール、渦の800μlのを追加し、微量遠心機で14,000 rpmで3分間スピン。ペレットを乱さないように注意しながら、エタノールの上清を取り除く。</li&gt;<li&gt; 70％エタノール800μlを（100％（v / v）の蒸留水で希釈したエタノールを（DH追加<sub&gt; 2</sub&gt; O））、渦、そして14,000 rpmで3分間スピン。注意深くエタノールの上清を取り除く。</li&gt;<li&gt; 50％エタノール800μlを（100％（v / v）の蒸留水で希釈したエタノールを（DH追加<sub&gt; 2</sub&gt; O））、渦、そして14,000 rpmで5分間スピン。注意深くピペッティングでできるだけ多くのエタノールとして削除する。完全に再水和組織意志ではないペレットだけでなく、乾燥組織として、この時点でペレットを乱さないのは十分に注意してください。</li&gt;<li&gt;ではない乾燥した上に注意して、5分間エタノールの上清、空気乾燥したペレットを除去した後。</li&gt;</ol&gt;<p class="jove_title"&gt; 4。組織消化</p&gt;<ol&gt;<li&gt;溶解バッファー（下式）の200〜500μLを追加する。ペレットは、ピペットチップまたはボルテックスを用いて再懸濁する。完全に再サスペンド組織は、サンプルのより完全消化し、DNAの優れた収量をもたらすためにこの時点で余分な努力。</li&gt;<li&gt; 56でサンプルをインキュベート℃の水浴またはヒートブロックでC。</li&gt;<li&gt;組織のコアを、プロテイナーゼK（20 mg / mlのストック溶液、Invitrogen社、AM2548）朝と夜のスパイク20μlのために。</li&gt;<li&gt;組織が完全に溶解するまで2〜5日のための消化を上記の手順を繰り返します。</li&gt;</ol&gt;<p class="jove_step"&gt;溶解バッファー</p<ul&gt;<li&gt; 10mMトリス- HClをpH8.0の</li&gt;<li&gt; 100 mMのEDTA pH8.0の</li&gt;<li&gt; 50mMのNaCl</li&gt;<li&gt; 0.5％SDS</li&gt;<li&gt; 200μg/ mlのプロテ​​イナーゼK（使用直前に追加）</li&gt;</ul&gt;<p class="jove_title"&gt; 5。 DNAのクリーンアップ</p&gt;<ol&gt;<li&gt;飽和フェノール（フィッシャー、BP1750I - 400）と転倒混和等量のバッファーを追加します。微量遠心機で14,000 rpmで少なくとも5分間スピン。</li&gt;<li&gt;新しいチューブに水層を移す。相間に注意してください：白い物質がたくさんある？</li&gt;<li&gt;相間がクリアされるまで（通常は3回以上）水性画分を、ステップ1と2を繰り返します。相間の最終的な収率を高めるためにファジーです抽出*をバック行います。</li&gt;<li&gt;相間一度明確に、等量のフェノールを追加さ：クロロホルム：イソアミルアルコール（25:24:1）（フィッシャー、BP1752I - 400）、サンプルの抽​​出水性画分に。 5分間混合し、14,000 rpmで5分間スピン。残留フェノールとさらには水層の抽出を容易に、相間をシャープにThisreduces</li&gt;<li37℃で1時間、100μg/ mlの℃で&gt;新しいチューブに水層を除去し、treatwithのRNase A</li&gt;<li&gt;残りのRNaseを除去し、水性画分を収集する手順1〜4を繰り返します。最初のライセートでも削除するにははるかに少ないタンパク質があるはずだとして、あなただけの1または2のバッファ飽和フェノールのステップを必要としてください。</li&gt;</ol&gt;<p class="jove_content"&gt; * DHの50〜100μlを追加抽出をバック実行するには<sub&gt; 2</sub中間相と有機部分を含むサンプルチューブに&gt; 0。ミックス、そして5分間微量遠心機で14,000 rpmでサンプルを回転させるチューブを反転。水相を収集し、以前に取得した水性抽出に追加します。相間が透明になるまで抽出をバック続けます。</p&gt;<p class="jove_title"&gt; 6。 DNA沈殿</p&gt;<ol&gt;<li&gt;あなたの集められた水層の体積を見積もる。</li&gt;<li&gt; 1 / 10 3 M酢酸ナトリウムのpHは5.2と100％イソプロパノール（v / v）の分子生物学グレード（または100％エタノールの2.5倍量）の1ボリュームのボリュームを追加します。</li&gt;<li&gt;よく混ぜ、30分または一晩氷上でまたは-20℃の冷凍庫に入れて。</li&gt;<li4の最高速度で&gt;スピン（14,000 rpm）で℃で10分間微量遠心機で</li&gt;<li&gt;上清を捨てる。</li&gt;<li&gt;不要な塩を除去するために、70％氷冷エタノールでペレットを洗浄します。</li&gt;<li選択肢のバッファ（通常はDHで&gt;再懸ペレット<sub&gt; 2</sub&gt; O）。</li&gt;</ol&gt;<p class="jove_title"&gt; 7。 DNA定量化</p&gt;<ol&gt;<li&gt; DNAの濃度を定量化する。 A260：A280の比が約1.8である必要があります。 DNAの少量の場合は、光度計分光光度計を用いて測定が好ましい。</li&gt;<li&gt;以下の定量化、ゲル電気泳動は、サンプルDNAの品質をテストし、汚染RNAは完全に分解されているかどうかを判断するために実施すべきである。</li&gt;<li&gt;高品質抽出されたDNAは、現在のダウンストリームアプリケーションに適し、または後で使用するために-20℃で保存することができます。 RNAはまだあなたのサンプル中に存在する場合、DNAのクリーンアップと沈殿工程、およびサンプルの品質を定量化し、資格を再度繰り返す。</li&gt;</ol&gt;

<ol><li>Santos, M. C., Saito, C. P., Line, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extraction+of+genomic+DNA+from+paraffin-embedded+tissue+sections+of+human+fetuses+fixed+and+stored+in+formalin+for+long+periods%5BTitle%5D)+AND+%22Pathol+Res+Pract%22%5BJournal%5D)">Extraction of genomic DNA from paraffin-embedded tissue sections of human fetuses fixed and stored in formalin for long periods.</a> Pathol Res Pract. 204, 633-636 (2008).</li>
<li>Hilz, H., Wiegers, U., Adamietz, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stimulation+of+proteinase+K+action+by+denaturing+agents%3A+application+to+the+isolation+of+nucleic+acids+and+the+degradation+of+%27masked%27+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Biochem%22%5BJournal%5D)">Stimulation of proteinase K action by denaturing agents: application to the isolation of nucleic acids and the degradation of 'masked' proteins.</a> Eur J Biochem. 56, 103-108 (1975).</li>
<li>Sambrook, J. oseph, R, D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSambrook%2C+Joseph+%22Molecular+Cloning%3A+A+Laboratory+Manual%22">Molecular Cloning: A Laboratory Manual</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York. (2001).</li>
<li>Kennett, J. Y., Watson, S. K., Saprunoff, H., Heryet, C., Lam, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Technical+demonstration+of+whole+genome+array+comparative+genomic+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Technical demonstration of whole genome array comparative genomic hybridization.</a> J Vis Exp. , (2008).</li>
<li>Thu, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methylated+DNA+immunoprecipitation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Methylated DNA immunoprecipitation.</a> J Vis Exp. , (2009).</li>
<li>Tang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+extraction+from+formalin-fixed%2C+paraffin-embedded+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">DNA extraction from formalin-fixed, paraffin-embedded tissue.</a> Cold Spring Harb Protoc. , (2009).</li>
<li>Hongxin Fan, M. L. G., G, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+Extraction+from+Paraffin-Embedded+Tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Pathology+Protocols%22%5BJournal%5D)">DNA Extraction from Paraffin-Embedded Tissues.</a> Molecular Pathology Protocols. 49, 1-4 (2001).</li>
</ol>

利害の衝突は宣言されません。

病理組織学的解析と診断のための生検または外科的に切除した組織は、長期保管のために頻繁にホルマリン固定およびパラフィン包埋（FFPE）です。疾患の遺伝的基礎を理解する上で関心の高まりとともに、これらのサンプルからDNAを抽出する能力は、ゲノム解析とトランスレーショナル研究のために使用できる診断材料の貴重なソースを表します。歴史的にFFPEサンプルは、核酸などの分子解析のための実行可能なソースと見なされていなかった大きくタンパク質-核酸と6をつなぐタンパク質間クロスによって変更される可能性があります。しかし、プロテアーゼ消化は、PCR、アレイCGH、シーケンシングおよびメチル化のプロファイリングを含むダウンストリームの解析に適している断片化核酸を放出することの発見は、遺伝学的解析6のこれらの貴重な標本を使用できるようになります。 パラフィン包埋組織からのDNA抽出は、DNAを精製するため、差動溶解性に依存している堅牢な手順です。抽出したDNAの質と量とそれに続くDNA増幅の成功は、抽出作業中および作業後は、パラメータの数に依存しています。これらは、これらに限定されない：組織の種類と量、組織保存のために使用される固定液の種類、に固定、パラフィンブロックと保管条件の年齢だけでなく、所望のDNAセグメントの長さの期間を1,7を増幅。未溶解パラフィンが悪いサンプルの品質とPCR増幅の阻害につながるとして、組織からのパラフィンの除去は、抽出成功のための最も重要なステップです。

<table border="1"><tbody><tr><th>の名前</th><th>会社</th><th>カタログ番号</th><th>コメント</th></tr><tr><td>キシレン</td><td> VWR </td><td> CABDH6216 - 4 </td><td> - </td></tr><tr><td> 1.7ミリリットルSafeSealマイクロ遠心チューブ</td><td>バイオサイエンスソレンソン</td><td> 11510 </td><td> - </td></tr><tr><td> Spectrafuge 16Mマイクロ遠心機</td><td> Labnet </td><td> C0160 - B </td><td> - </td></tr><tr><td>溶解バッファー</td><td> - </td><td> - </td><td> 10mMトリス- HCl PH8、 100mMのEDTA pHを8、 50mMのNaCl、 0.5％SDS、 200μg/ mlのプロテ​​イナーゼK </td></tr><tr><td>プロテイナーゼKストック溶液</td><td>インビトロジェン</td><td> AM2548 </td><td> 20 mg / mlの</td></tr><tr><td>プロテイナーゼKストック溶液</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>飽和フェノールのpH 6.6/7.9をバッファリング</td><td>フィッシャー</td><td> BP1750I - 400 </td><td> - </td></tr><tr><td>フェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール（25:24:1、pHは6.7/8.0） </td><td>フィッシャー</td><td> BP1752I - 400 </td><td> - </td></tr><tr><td> RNaseの</td><td>ロッシュ</td><td> 10109169001 </td><td> 100mgの</td></tr><tr><td> 3M酢酸ナトリウム液（pH5.2） </td><td> - </td><td> - </td><td> 80ミリリットルの40.81グラムNaOAc 氷酢酸でpH 5.2に調整する 100mlにのdH 2 Oを追加 オートクレーブ</td></tr><tr><td> ND 3300分光光度計</td><td>光度計</td><td> - </td><td> - </td></tr></tbody></table>

遺伝学的およびエピジェネティクス解析のためのパラフィン包埋材料からのdna抽出

 DNA Extraction from Paraffin Embedded Material for Genetic and Epigenetic Analyses

病気の発生と進行は染色体再配列、コピー数の損益およびDNAメチル化を含む頻繁な遺伝とエピジェネティックな異常によって特徴付けられる。マイクロアレイのような高スループット、ゲノムワイドなプロファイリング技術、、の進歩は著しく、これらの特定の変化を識別して検出するために我々の能力を改善している。技術が向上し続けているしかし、制限要因は、サンプルの品質と可用性のまま。また、フォローアップ臨床情報と疾患の転帰は、しばしば数年、最初の検体採取後に収集されます。検体は、通常、ホルマリン固定およびパラフィン包埋（FFPE）、数十年の年間入院アーカイブに格納されています。抽出の適切な方法が適用されている場合、DNAが効率的かつ効果的にパラフィン包埋標本から回収することができます。適切に維持され、保存された検体から抽出した高品質のDNAは正常と病変組織との遺伝的およびエピジェネティックな署名の生成1の比較のために定量的なアッセイをサポートすることができます。パラフィン包埋サンプル、組織のコアやマイクロダイセクション組織からDNAを抽出するために組織からパラフィンを溶解するキシレン処理に供してから、エタノールの一連の洗浄を使用して再水和されています。タンパク質やヌクレアーゼなどの有害な酵素は、その後、プロテイナーゼK、などのドデシル硫酸ナトリウム（SDS）のような変性剤を含む消化2を容易に溶解バッファーの添加によって消化されています。核酸は、二相溶液を生成するバッファー飽和フェノールと高速の遠心分離を用いて組織ライセートから精製されています。タンパク質、脂質、多糖類の間と有機相のそれぞれに隔離されている間にDNAとRNAは、上部の水相に残る。水相と繰り返しフェノール抽出の保持は、きれいなサンプルが生成されます。フェノール抽出に続いて、RNアーゼAは、汚染RNAを除去するために追加されます。追加のフェノール抽出は、RNaseのインキュベーション後の、残りの酵素を除去するために使用されています。酢酸ナトリウムとイソプロパノール沈殿DNA、および高速の遠心分離の加算は、ペレットにDNAを使用し、イソプロパノール除去を促進しています。過剰な塩は、再ペレットに遠心分離によってDNA 3続いて、その後の酵素アッセイに干渉することができますが、70％エタノールで洗浄することによりDNAから除去することができる沈殿から引き継が。 DNAは、蒸留水または任意の緩衝液に再懸濁し、定量化し、-20℃で保存されています精製したDNAが続いて含まれて下流のアプリケーションで使用できる、限定されるものではないが、PCR、アレイ比較ゲノムハイブリダイゼーション4（アレイCGH）、メチル化DNA免疫沈降（MeDIP）と組織/腫瘍サンプルの統合的な解析を可能にする、シークエンシング。

このビデオでは、ホルマリン固定パラフィン包埋材料からのDNA抽出のためのプロトコルを示しています。これは、組織切片をキシレンで脱パラフィンされている複数の日手続き、エタノールで再水和とその後の遺伝子特異的またはゲノムワイドな解析のためにDNAを精製し、分離するプロテイナーゼKで処理です。

遺伝学的およびエピジェネティクス解析のためのパラフィン包埋材料からのDNA抽出

疾患の発症および進行は、染色体再編成やコピー数変化を含む、頻繁な遺伝的およびエピジェネティックな異常によって特徴づけられます。

このビデオでは、パラフィン包埋組織サンプルからDNAを抽出する方法を説明します。このデモンストレーションで使用するサンプルは、直径3 mm、長さ6 mmの組織コアです。今回は1つのコアを使用しますが、直径5 mm、長さ10 mmを超える大きなサンプル、または今回使用したサイズのコア2〜3個を、1回の手順で処理することが可能です。ただし、パラフィンを完全に除去し、組織を十分に消化させるために、プロトコルの調整が必要になる場合があることに注意してください。組織への処理を行う前に、組織を保存しているワックス状のパラフィンを溶解させる必要があります。キシレンとフェノールは毒性があるため、これはキシレンを用いて行います。これらの化学物質を使用する作業はすべてドラフトチャンバー内で行い、サンプルが入ったチューブに800 µLのキシレンを加えてください。次に、サンプルをロッカーに置き、緩やかに振盪しながら10分間放置します。14,000 RPMで3分間遠心分離してサンプルをペレット化し、チューブからキシレンを除去してパラフィンを溶解させます。パラフィンが完全に溶解するまで、これらの手順を2〜3回繰り返します。組織は湿っており、柔らかい状態でなければなりません。最終的なDNA回収量を増やすためには、すべてのパラフィンを除去することが重要です。したがって、組織サンプルが大きい場合は、より多くの洗浄回数が必要となります。サンプルからパラフィンが除去されたので、組織の消化を可能にするために組織を再水和させる必要があります。これはエタノール再水和系列を用いて行います。まず、サンプルに800 µLの100% ethanolを加え、ボルテックスした後、14,000 RPMで3分間遠心分離します。上清を除去します。これらの手順を、800 µLの70%エタノール、次に50%エタノールを用いて繰り返します。組織の凝集性が低下し、ペレット化に強い遠心力が必要になるため、最後の遠心処理は5分間行います。次に、細胞からDNAを放出させるために組織を消化させる必要があります。これは、SDSなどのタンパク質変性剤と、組織分解を担う酵素であるプロテイナーゼKを含む溶液である溶解バッファーを用いて行います。サンプルに200から500 µLの溶解バッファーを加えます。サンプルのサイズによりますが、400 µLが適切な量です。もちろん、溶解バッファーの成分および56 °Cのインキュベーション温度は、タンパク質の活性を最大化させるためのものです。ACE Kはタンパク質であるため、組織を分解できる期間には限りがあり、反応を継続させるには酵素を定期的に添加する必要があります。濃度10 mg/mLのACE Kタンパク質を20 µL、組織が完全に溶解するまで朝夕にサンプルに添加します。固形組織が見えなくなった時点で、細胞残渣バッファーからDNAを抽出する必要があります。飽和フェノールを用いて、サンプルを水相と有機相に分離します。水相にDNAが含まれています。通常のフェノールの酸性はDNAを分解させるだけでなく、水相と有機相の層の順序を逆転させてしまうため、緩衝液飽和フェノールを使用することが重要です。緩衝液飽和フェノールは2相に分かれて保存されており、フェノールが下層になることに注意してください。サンプルに等量の緩衝液飽和フェノールを加え、チューブを数回反転させます。次に、サンプルを遠心分離機にかけ、14,000 RPMで5分間遠心分離して相分離を誘導します。DNAおよびRNAは上層の水相に、タンパク質、脂質、および多糖類は中間相および下層の有機相に回収されます。中間相を乱さないように注意して水相を取り除き、新しいチューブに移します。多くの場合、1回目の遠心後、界面は緩んで戻りやすくなっています。少量の水を用いて抽出を行う必要があります。逆抽出のプロトコルは、本ビデオに付随するテキストで確認できます。界面が透明になるまでこれらの手順を繰り返します。通常、3〜5回繰り返すと界面が透明になります。DNAサンプルに同量のフェノール・クロロホルム・イソアミルアルコールを加えて進めてください。これはフェノール単独の場合と同じ目的で用いられますが、界面を明確にすることでDNAの回収率を最大化します。界面が透明かつ鮮明になるまで、この手順を1回または2回繰り返します。サンプルのタンパク質が除去されたので、次に混入しているRNAを除去する必要があります。これはRNAによって達成されます。サンプルにRNA分解酵素Aを最終濃度100 µg/mLで添加し、37 °Cで1時間インキュベートします。RNAが分解された後、RNAA酵素を除去する必要があります。DNAのクリーンアップ手順を前述と同様に繰り返します。最初に緩衝液飽和フェノールを使用し、次にフェノール・クロロホルム・イソアミルアルコールで処理することで、現在の汚染物質がRNA A酵素と分解されたRNAのみであるため、クリーンアップの回数を減らすことができます。サンプルがDNAのみとなったところで、溶液からDNAを沈殿させる必要があります。1/10量の酢酸ナトリウムと1容量のイソプロパノールを加えてください。あるいは、2.5倍量のエタノールを添加することも可能ですが、その場合はより大きなチューブが必要になります。サンプルを-20°Cで30分から1時間、あるいは夜間に作業を行う場合は一晩インキュベートしてください。DNAを取り扱うため、分解を防ぐためにサンプルを常に氷上で保持してください。沈殿したDNAをペレット化するため、サンプルを4 °Cで14,000 RPMにて10分間遠心分離します。シーケンシングなどの後続の実験に影響を及ぼす可能性のある過剰な塩を除去するため、ペレットを剥がさないように注意しながら上清を取り除きます。例えば、冷却した70% ethanolを1 mL加え、緩やかに再懸濁します。サンプルを再び14,000 RPM、4°Cで10分間遠心分離します。上清を注意深く取り除き、余分なエタノールを最大5分間自然乾燥させます。サンプルを乾燥させすぎないことが重要です。最後に、DNAを精製し、任意のバッファーで再懸濁できる状態にします。ここでは、オートクレーブ滅菌済みの蒸留水を使用します。DNAサンプルは、後で使用するために-20°Cで保存します。抽出完了後、DNAの品質と量を評価する必要があります。これはNanoDrop 3000を用いた分光光度法により行います。測定タイプに「nucleic acid」を設定し、計算方式に「DNA 50」を選択し、1.5 µLの水を用いて装置の初期化（ブランキング）を行ってください。ペデスタルを洗浄し、希釈液として1.5 µLの蒸留水を用いてブランク測定を行います。ペデスタルを洗浄し、1.5 µLのサンプルをロードして測定ボタンを押します。はい。完璧です。この時点では、A260/A280比が1.8であることが理想的です。抽出したDNAは、アレイ、比較ゲノムハイブリダイゼーション、メチル化DNA免疫沈降、シーケンシングなどを含む（ただしこれらに限定されない）下流のアプリケーションに使用可能な状態になります。これらのプロトコルのリンクをここに示します。すぐに必要ない場合は、サンプルを-20 °Cで保存して後で使用してください。

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