ネズミ鞭虫感染症：腸内のタイプ2免疫と炎症のモデル

この手順の全体的な目的は、自然な海南虫感染モデルを確立し維持することです。まず、マウスにT. currensの卵を経口投与して感染させます。21日後、感染動物を安楽死させ、血液、腸間膜リンパ節、糞便ペレット、結腸、および盲腸を採取します。

これらのサンプルを用いて、tricks. Mirrorsに対する免疫応答を解析できます。血清サンプルはELISAで解析し、TRA特異的抗体を検出します。

細胞性免疫応答を解析するために、リンパ節細胞のin vitro再刺激を行うことができます。タンパク質含量の評価には糞便ペレットをウェスタンブロットに供し、結腸のQPCR分析によって遺伝子発現解析を行うことができます。最後に、盲腸の先端部は組織学的検査に使用し、盲腸の残りの部分は感染マウスの虫負荷を測定するために使用できます。

最終的に、マウスが trais MOUs 感染に対して耐性を持つか感受性を持つかを示す結果を得ることができ、寄生虫に対する免疫応答を特性評価することが可能です。この手法は、どの因子がTヘルパー細胞の活性化を制御しているか、またどのタンパク質がTH2細胞の分化に必要かといった、免疫学分野における重要な疑問を解決するのに役立ちます。Trauss MOUs の卵は、免疫不全マウスまたは KR などの遺伝的感受性系統で増殖させることができ、感染から 35 日後に安楽死させたマウスから卵を回収します。

動物の腹側を露出し、滅菌済みピンセットとハサミを用いて、マウスの腹部をエタノールで洗浄します。腹部の皮膚をつかみ、小さく切開します。腹腔内容物を露出し、盲腸と近位結腸を確認した後、それらを取り除きます。

臓器を、ペニシリンおよびストレプトマイシンを添加したDMEMを含む10 centimeterのペトリ皿に移します。次に、ピンセットを用いて盲腸と近位結腸を切開し、管腔と虫体を露出させます。切開した臓器をPBSを含むビーカーに入れ、静かに振盪して糞便を洗い流します。

盲腸の洗浄後、それを新しいペトリ皿に移し、曲げ鉗子を用いて慎重に虫体を取り出します。各マウスから回収したすべての虫体を、5 mLの抗生物質添加DMEMが入った6ウェルプレートの1ウェルに移します。6ウェルプレートを湿らせたペーパータオルと共にタッパー容器に入れ、37 °Cで4時間インキュベートし、虫体に産卵させます。

このインキュベーションの後、ピンセットを用いて元のウェルから虫を取り出し、DMEMが入った2つの新しいウェルに分けて移します。このように虫を分けることで、ピペットによる卵の回収率を最大化できます。元のウェルから、分泌抗原と卵を含む残りの培地を回収し、15 milliliterのFalconチューブに移します。

チューブを3000 RPMで5分間遠心分離します。その後、4時間抗原を含む上清を取り出して保存し、ペレットを含む卵を滅菌水で再懸濁します。線虫を入れた6ウェルプレートを再び37°Cに置き、翌朝まで一晩インキュベートします。

線虫を廃棄した後、先に示した方法でウェルの中身を回収し、上清を遠心分離して卵を単離します。一晩抗原を含む上清を保存し、卵を水で再懸濁させます。前述と同様に、これらの卵を4時間のインキュベーションで得られた卵と合わせます。

70 µmのストレーナーで卵をろ過し、残った虫を除去します。その後、卵を75 cm四方のフラスコに移します。遮光のためフラスコをアルミホイルで覆い、室温で6週間保存します。

これにより、6週間後に卵が成熟し、胚発生します。卵を洗浄し、水をかき混ぜて、生存している卵の数を数えます。こちらをご覧ください。

生存可能な有胚卵と非生存卵の例として、Exeter濃度50を50 µLで再懸濁します。この時点で、卵はマウスに接種するまで4 °Cで保存することが可能です。卵を含む溶液を十分に再懸濁させてください。

必要な量の接種物を14 mLのスナップキャップチューブに移し、チューブを反転させて混ぜ合わせます。1 mLシリンジに取り付けた、動物のサイズに適したサイズの経口投与用針を用いて、卵を200 µL吸い上げます。マウスの項皮を掴み、経口ゾンデにより卵を投与します。

感染させたマウスをケージに戻し、21日間感染を進行させます。21日後、非ヘパリン化シリンジを用いて、心穿刺により感染マウスから血液を採取します。二酸化炭素による安楽死後、血液サンプルは4°Cで保存してください。

血清の分離およびELISAによるtra特異的IgGおよびIgEの解析を行います。前述の手順に従い、マウスの腹腔を露出させます。次に、鉗子を用いて、鋏または別の鉗子で盲腸を牽出します。

小腸を右側に押しやり、腸間膜リンパ節を露出させます。腸を傷つけないように注意しながらリンパ節を慎重に摘出し、2 mLの培地 containing 2 mL の培地を入れた15 mLのFalconチューブに入れます。その後、リンパ節細胞を、寄生虫に対する細胞性免疫応答を分析するために、虫培養液から得られた4時間の抗原S上清を用いてin vitroで再刺激することができます。

リンパ節を採取した後、前述の手順に従って盲腸と結腸を摘出します。ピンセットを使用して遠位結腸から糞便ペレットを取り出し、2 mLの酸素チューブに入れます。ペレットは-20 °Cで保存し、ウェスタンブロットを用いてタンパク質含量を分析します。ハサミを使用して近位結腸を約1 cm切り取り、RNA保存用チューブに入れます。その後、4 °Cで保存します。

ピンセットで盲腸の先端を保持し、先端から約5 mmを切り出します。3 mLシリンジと22 G針を用いて、サンプルをPBSで洗浄します。その後、4%パラアルデヒドを含む5 mLファルコンチューブ（スナップキャップ付き）に移します。

パラアルデヒドで固定した盲腸サンプルは4°Cで保存し、組織学的解析に使用できます。盲腸の残りの部分はペトリ皿に入れ、-20°Cで凍結させて線虫を殺します。線虫の計数を容易にするため、盲腸を融解させ、ハサミを用いて約5mLの水が入ったペトリ皿に移します。

盲腸を切開して管腔を露出し、振とうして糞便をシャーレに回収します。洗浄した盲腸を水を入れた新しいペトリ皿に移し、滑らかな曲ed鉗子を用いて腸上皮細胞を掻き出します。その後、盲腸を水を入れた別のペトリ皿に移し、組織を小さく切り刻みます。

解剖顕微鏡下で糞便、腸上皮細胞、および盲腸組織を観察し、虫体を数えながら除去し、新しいディッシュに移します。ここでは、単離前後の盲腸内の虫体の外観を示しています。tragus mirrors infection black sixは寄生虫を制御できている一方で、KRマウスでは寄生虫負荷が増加しています。

同様に感受性の高いAKRマウスでは、血清ELISAによって測定した結果、C57BL/6マウスよりも著しく高いTRA特異的IgG2aタイターが認められます。本実験において、ウェスタンブロット解析を行ったところ、感染後の糞便中における杯細胞特異的タンパク質Relmβの量は、C57BL/6マウスでは増加していましたが、AKRマウスでは増加していませんでした。盲腸遠位部の組織学的解析では、耐性を持つTRAマウスやC57BL/6マウスにおいて杯細胞の過形成と粘液産生が認められましたが、感受性の高いAKRマウスでは認められませんでした。

このビデオを視聴することで、trismus卵の増殖方法、実験用マウスへの感染方法、および感受性マウスまたは耐性マウスにおける感染解析のための腸管組織、腸間膜、腸管リンパ節、および血液の採取方法について十分に理解することができます。