Name: アン in vivoで齧歯類モデル (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-05-11T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 8 s
Description: 学ぶラットの背屈筋にin vivoで収縮誘発損傷を起こす方法。脛骨近位部へのピン固定、腓骨神経刺激、トルク計測により、筋機能と構造の変化を定量的に評価し、損傷メカニズムと回復過程を解明する。

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著者は、メリーランド州でのトランスレーショナルイメージング（C - TRIM）と磁気共鳴研究センター（MRRC）のためのコアで博士、実験スペースや設備の彼の寛大な寄付のためのロバートBlochと博士ラオGullapalliと大十に感謝します技術サポートのため。この作品は、国立衛生研究所（K01AR053235と1R01AR059179）からと筋ジストロフィー協会（＃4278）からRMLへの補助金によって支え、そしてジャイナ教の財団からJARへの助成金によっていた。

（1） 生体傷害モデルと等尺性トルクの測定インチ <ol><li>これらの手順は、ラットやマウス7,17,18に使用することができます。開始するには、精度の気化器を（猫＃91103、獣医装備、株式会社、プレザントンを使用して（誘導チャンバ内の誘導のためのイソフルラン4〜5％が、その後のメンテナンスのためノーズコーンを介してイソフルランを2％〜に）吸入麻酔下で動物の仰臥位を配置、CA）。乾燥から角膜を保護するために各眼に無菌眼科用クリーム（Paralube獣医軟膏、PharmaDerm、Flohamパーク、ニュージャージー州）を適用します。作業中は、動物がケージの外に置かれた加熱ランプの使用により保温されており、常に動物から6インチ以上を保った。 </li><li>毛を除去することにより、軟組織や骨にシード皮膚の細菌を防ぐためにbetadineの交互スクラブと70％アルコールで洗浄して準備が肌。深部腱反射の欠如（足をつまんへの応答がない足の撤退）によって適切な麻酔を確認してください。針は、手動でリグ（マウス用25Gまたは27G）に手足を安定させるために近位脛骨を通して配置されます。針は足の前部コンパートメントを入力しないでください。 </li><li> 、固定位置に針をロックする動物が仰臥位になるようにし、つま先はまっすぐに直面している。カスタムメイドの装置は、針を固定し、それによって足を安定させるために使用されます。 </li><li>カスタム加工のフットプレート（図1）に四肢の足を置きます。フットプレートの軸はステッピングモータ（モデルT8904、NMB Technologies社、チャッツワース、カリフォルニア州）およびトルクセンサ（モデルQWFK - 8M、Sensotec、コロンブス、オハイオ州）に添付されます。足は、最初にそれは図1のように、脛骨と直交するように調整する必要があります。 </li><li>神経の中にある腓骨、の首付近に腓骨神経を刺激するために経皮電極（723742、ハーバード装置、ケンブリッジ、MA）または皮下電極を（J05針電極針、36BTP、ヤリの電極供給、ギルロイ、カリフォルニア州）を使用してください表面的な位置。視覚的に足が確保される前に、痙攣（マウス、ラットで1 msのパルスを0.1ミリ秒のパルス）のシリーズを実行することによって、孤立した背屈を確認してください。足を粘着テープで底板に固定されると、電圧の増加に応じて単収縮の振幅の増加は、反対の筋肉（plantarflexors）が同時に刺激されていないことを確認します。 </li><li>負傷前、および損傷後の選択された時点で、dorsiflexorsの容量を生産する最大の力は、"最大等尺性トルク"（筋肉の長さの変化のないトルク）として記録されます。トルクの測定は、傷害を誘発するために使用されているのと同じリグ上で実行されます。最大等尺性トルクを記録する前に、パルスの振幅は、単収縮張力と足首の最適な位置がdorsiflexorsの異なる長さでけいれんを与えることによって決定される最適化するように調整されます。 dorsiflexors（静止長、別名ロー）の最適な長さを決定するためにトルク角カーブを取得した後、トルクの周波数のプロットは、徐々に200 msのパルス列中のパルスの頻度を増やすことによって得られる。最大融合テタニー収縮は通常90〜100 Hzで得られる。 3つの別々のけいれんと強直性収縮を記録し、さらなる分析のために保存されます。 </li><li>収縮活性化、足首の回転の開始、およびトルクのデータ収集を同期する（LabVIEWバージョン8.5、ナショナルインスツルメンツ、オースティン、テキサス州）に商用ソフトウェアを使用してください。コンピュータ制御のモーターが同時にこうして長く収縮（また、筋肉の損傷を引き起こす"偏心"収縮と呼ばれる）につながる、底屈にフットプレートを移動しながら背屈筋の筋肉の刺激が発生します。特定のプロトコルは、調査員が希望する傷害の所望の大きさに依存します。傷害の大きさ、または組織損傷は、そのような角速度、筋活動のタイミング、動きの範囲、そして長く収縮の数などの変数の操作によって調整することができます。 </li><li>怪我を誘発するために、動きの範囲、延長の速度、および必要に応じて刺激のタイミングを変化させる、最大等尺性収縮に長く収縮を重ね合わせる。例えば、最大等尺性収縮はdorsiflexorsで取得され、200ミリ秒後にそれらはおおよその通常の動き（900 ° /秒）に、選択した速度で長くされています。我々は以前に運動の前に活性化し、延長の程度が負傷14を得る上で重要な要因であることが示されている。 dorsiflexorsによって生成されるトルクの大半は、TA 11からであり、我々はこの筋肉5,13-15に傷害のこのモデルは、結果という以前に示されている。 TAは、延長を通して刺激されたまま。 </li><li>負傷した後、動物を装置から削除されます。脛骨ピンは削除された、足は再び洗浄され、そして動物がケージに戻った（37 ° Cでの温度制御加熱ブロックに配置）と回復するまで監視されます。これは、動物が目を覚まし、携帯になるまで待機が含まれています。動物が手術中に観察可能な痛みに苦しんでいないし、長く収縮により誘発される損傷後の歩行には目に見える変化は（例：跛行）は​​ありません。しかし、適切な抗痛みの治療は、（ - 手術後48時間で0.1 mg / kgを12時間ごとにブプレノルフィン0.05）、その後に投与される。 </li></ol> （2）全体の筋肉の緊張のその場測定において 。 <ol><li>動物が用意され、1.3を通じて1.1節で説明したように脛骨を安定化されている。すべてのインストゥルメンテーションは、適切なキャリブレーションのために試験前に少なくとも30分の電源が入っていて、力変換器の温度ドリフトを最小限に抑えます。 </li><li>足首に皮膚の前方を切開すると前脛骨筋（TA）の腱を切断。慎重に腱に4.0エチコンシルク非吸収性縫合糸を束ね、付属のS -フック（重量= 0.1グラム）、モデルFT03、グラスの楽器、ワーウィック、ロードアイランド）を介して負荷のセルにvicryl縫合糸を取り付けます。また、カスタムクランプ（重み= 0.5グラム）がvicryl縫合（図2）に腱を添付するために使用することができます。 </li><li>ロードセルは、TAが安静時の長さに調整し、（原点と挿入の間にプルの直線）が正しく整列させることができるように（カイトのマニピュレータ、世界精密機器株式会社、サラソタ、フロリダ州）マイクロマニピュレータに取り付けられている。 TAは、熱のランプで、鉱物油による脱水から冷却から保護されます。ロードセル（各試験の前にキャリブレーション）からの信号を集録ソフトウェア（PolyVIEWバージョン2.1、グラスの楽器によって収集して格納されるA / DボードにDCアンプ（モデルP122、グラスの楽器、ワーウィック、ロードアイランド）を介して供給されています、ワーウィック、ロードアイランド）。 </li><li>ロードセルにTAを接続し、L 0を決定するために、異なる筋肉の長さで、単一の痙攣（1ミリ秒の矩形パルス）適用されます。ノギスを用いて測定した筋肉静止長は、、脛骨粗面とmyotendinous接合間の距離として定義されます。この長さで、徐々に力周波数の関係を確立するためにパルス振幅し、パルス周波数を増加させる。最大限に融合強直性攣縮は約90 - 100Hzの（0.1ミリ秒または1 msのパルスで構成される300ミリ秒の電車の期間）で得られる。最大収縮活性化（P 0）を誘導するためにTAをアクティブにする最大の刺激強度の150％を使用してください。最大強縮性収縮を繰り返し行うとP 0の割合で表現、任意の時点で疲労のインデックスを提供することができます。 </li></ol> （3）in vivoでのMR イメージングおよび/ ​​または齧歯類の骨格筋の分光。 すべてのMRIとMRSはParavision 5.0ソフトウェアを実行している12cmの勾配のインサート（660 mTの/ mの最大勾配、4570 T / m / sの最大スルーレート）を備えたBruker Biospin（ビルリカ、MA）7.0テスラMR装置で実行されます。 <ol><li> 1.1で上記のようイソフルラン気化した動物は麻酔です。 MR -互換性のある小動物のモニタリングとゲーティングシステム（SAインスツルメンツ社）は、呼吸数、体温を監視するために使用されます。マウスの体温は36〜37℃の温水循環装置を使用してに維持されている。カスタムメイドのホルダーは、膝から足に磁石のボアと平行に両足と仰臥位でマウスを配置するために使用されます。 4チャンネルの受信専用表面コイルが共振器72ミリメートルの線形1H内に配置されます。共振コイルをチューニングし、試料にマッチングされています。 </li><li> MRイメージング：ローカライザ後、以下のMRスキャンが実行されます：次のパラメータを持つ緩和の強化によるT1強調高速収集（RARE）：TE = 9.52ミリ秒、TR = 1800、エコートレインの長さ= 4、面内分解能100 × 100μmの、およびスライス厚さ= 750ミクロン。デュアルエコーPD/T2 RARE：TE = 19.0/57.1ミリ、TR = 5000ミリ秒、エコートレインの長さ= 4、面内分解能100 × 100μmであり、スライス厚= 750μmの。 b値= 350秒/ MM -2、TE = 26ミリ秒、TR = 4500ミリ秒、面内分解能150 × 150μmであり、スライス厚= 750μmの12の非共線的な方向性を用いてスピンエコー（SE）拡散テンソル画像データ。 16 TESのΔTEで182.5ミリまで= 11.4ミリ= 11.4ミリ秒、TR = 10000ミリ秒、面内分解能150 × 150μmであり、スライス厚さ= 750μmのを使用して、マルチスライス、マルチエコー（MSME）T2パラメトリックマッピングデータ。 </li><li>画像処理：平均拡散係数（MD）、小数異方性（FA）画像だけでなく、ラクトマップを作成するための拡散テンソル再建とラクトはTrackVis（ボストン、マサチューセッツ;マサチューセッツ総合病院医学のためのMartinosセンター）を使用して実行されます。 T2マッピングをMATで記述されたカスタムソフトウェアを使用して実行されます正規のT2信号の方程式に、各ピクセルで測定されたデータに合わせて非線形最小二乗法を用いて、LAB（ナティック、マサチューセッツMathworks社）。関心の測定の領域は、TA内のパラメータの値を評価するために実行されます。 </li><li> 1H分光法：自動化されたシミングはTAの1 × 1 × 4 mm 3のボクセル上で実行されます。ポイント分解分光法（PRESS）パルスシーケンスは、（TR / TE = 18分の2000ミリ秒）1024の平均値と同じボクセルからスペクトルを取得するために使われます。データ収集は、各脚で34分です。スペクトルデータは、LCModelパッケージ16を使用して処理されます。 31P分光法：デュアルチューン（1H、31P）表面コイルが生体分光法（ISIS）パルスシーケンスで選択されている画像を使ったり、ローカライズされた分光法（単一パルスの実験を使用して）非ローカライズを行うために使用されます。 </li></ol> 4。収穫と筋肉を保存。 TASは、実験の最後に後に回収秤量し、液体窒素で凍結スナップし、-80℃で保存されていますこれは、in vivo実験の後、任意の時点で行うことができます。筋肉は、これは端末の手続きであるとして、即座にその場実験の後に収穫されています。詳細な形態学的研究のために、動物は、左心室を介して血流を介して4％パラホルムアルデヒドで固定されています。 5。代表的な結果。 図3は、 生体内での装置でのラットから代表的なデータを示してin vivoでの装置の背屈筋の筋によって生成される最大トルクを取得するために使用される;それはまた、これらの同じ筋肉に損傷を誘導するために使用されます。足関節が底屈の約20 °（0​​ °を考慮脛骨に直交配置さ足付き）に配置されているときに筋肉の長さ張力関係に起因する、最大等尺性トルクは一般的に発生します。最大等尺性トルクが得られた後、足は、傷害のプロトコルを開始する任意の位置に配置することができます。 70 ° - 図3は、0 °から動きの円弧の30繰り返しの傷害のプロトコルを表します。等尺性相（塗りつぶされた矢印）と収縮で誘起された傷害のプロトコル中に長く相（オープン矢印）から生成されたトルクで安定した低下に注意してください。トルクは、NMMの単位で記録されますが、絶対値は、動物の大きさとその条件（例えば、損傷した筋肉、疲労筋肉、または相同組換えに起因する特定のタンパク質を欠く筋肉）に依存している。 図4は、 その場装置でのラットから代表的なデータを示しています。私たちはその場装置に延長収縮が関与するのではなく、それは私たちは、隔離が適切に整列し、既知の長さで、個々の筋肉によって生成される最大張力を測定することができます。図4は、ラットの前脛骨筋の疲労試験中に発生する力の漸進的な損失を示しています。この特定の例では、巨大な収縮が5分、1秒毎に1回行った。テンション（力）は、通常、ニュートン（またはグラム）に記録しますが、トルクと同様に、絶対値は、動物の大きさと状態に依存している。筋肉の重さがすぐにこの手順の後に得られるので、力は筋肉の断面積に（"特定の力"と呼ばれる）正規化することができる。 図5は、T1加重とT2パラメトリックマッピングなどのマウスのin vivoイメージングの代表的なデータを、（）、拡散テンソル画像（B）、1 H分光法（C）、および31 P分光法から3Dラクトを示しています。詳細は、図の凡例に記載されています。 <img src="/files/ftp_upload/2782/2782fig1.jpg" alt="図1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図1"> 図1： 生体内での装置で .*けがを生成するには、脛骨が安定化し、足はモーター駆動のプレートに取り付けられている。踏み板は底屈（点線矢印）に足を強制しながら足首のdorsiflexorsは、腓骨神経を介して刺激される。 * ラバリング＆デデイン、許可を得て使用してJのバイオメカニクス、2005年。 <img src="/files/ftp_upload/2782/2782fig2.jpg" alt="図2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図2"> 図2： 現場装置でロードセルは、TAが安静時の長さに調整し、X、Y、およびZの方向に適切に配置することができるように、マイクロマニピュレータに取り付けられている。 TAの遠位腱は、ロードセルに接続されていると、単一のけいれんは、L 0を決定するために、異なる筋肉の長さで誘導されています。最大強直性収縮は、最大収縮活性化（P 0）を決定するために取得されます。最大強縮張力を繰り返し行うとP 0の割合で表現、目的の時点で疲労のインデックスを提供することができます。 782/2782fig3.jpg"ALT ="図3"/&gt; 図3：ラットの収縮を長くするからトルクの生体装置の代表的なトレースの録音でのトルクのデータ 。この特定の例では、筋肉、900の角速度で運動の70 °の円弧によって踏み板が（開いている矢印）の延長前にピーク等尺性収縮（塗りつぶされた矢印）を誘導するために200ミリ秒刺激した° /秒<img src="/files/ftp_upload/2782/2782fig4.jpg" alt="図4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図4"> 図4：ラットの前脛骨筋（TA）の反復刺激の間の最大等尺性強縮張力の減少を示す場装置の代表的なデータでからテンションデータ 。この例では、TAは、単離された最適な長さ（L 0）に調整し、5分間、1秒毎に1回200ミリテタニー収縮で刺激。 <img src="/files/ftp_upload/2782/2782fig5.jpg" alt="図5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図5"> 図5：in vivoイメージング ：画像は前脛骨筋（TA）からT1加重とT2パラメトリックマッピングの横（軸方向）のセクションを示す。点線の赤いボックスは、対無傷（右側）の増加負傷者（左側）にT2の増加を示すためにTAを囲んB：拡散テンソル画像（DTI）からの代表的な3DラクトC：マウスTAの1 Hのスペクトルが示すいくつかの検出可能な脂質の共鳴、筋肉細胞内の（IMCL）とextramyocellular脂質（EMCL）ピーク間の分化は、このメソッドを使用して取得されたD：ラットのTAの31 P MRスペクトルは、ホスホクレアチン（PCR）、無機リン酸塩（Pi）、三を示しています。アデノシン5' -三リン酸（ATP）の共鳴（α、β、γ）。

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利害の衝突は宣言されません。

&quot;筋肉の損傷は、&quot;多くの方法で定義されており、測定されている。構造上の損傷は、組織学的所見6,9で明らかですが、動物実験で使用されているものを含む筋肉の損傷を、評価するために使用される生物学的マーカーの多くを持つ一つの問題は、彼らは通常の力の喪失と相関しないということです。筋肉の損傷は、しばしばそれを調べるために使用されるアッセイのコンテキスト内で定義されており、誰も発見は、損傷後の収縮性の変化を考慮することはできません。完全収縮機能が傷害マーカーの存在にもかかわらず持続することができるので、力の損失は、傷害3の最も有効な指標である、そしておそらく最も関連性の可能性があります。 発生率は、予測が困難なランダムな事象であり、臨床症状が大幅に変化するにつれ、それは、人間の筋肉の損傷を研究することは困難である。したがって、多くの筋肉の損傷に関するデータの多くの変数を制御し、傷害と回復のメカニズムを研究する能力を提供する動物の研究から確認されている。私たちが説明している生体傷害の装置での研...

（全ての機器は、踏み板を除いてマウスとラットでも同じです） <ul><li> BUDバリューラインキャビネット（ニューアーク、06M4718） </li><li>多機能L / O USB - 6221M（ナショナルインスツルメンツ、779808〜01） </li><li>ステッピングモータコントローラ（ニューアーク、16M4189） </li><li>ステッピングモータ（ニューアーク、16M4198） </li><li> （ハネウェル、Sensotec、DV - 05）ゲージアンプの歪み</li><li>トルクセンサ（ハネウェル、QWLC - 8M） </li><li>フットプレートと安定化装置（カスタムが作った、特許出願中） </li></ul>

アン in vivoで</em収縮で誘起された損傷と回復の非侵襲的モニタリングの>齧歯類モデル

An in vivo Rodent Model of Contraction-induced Injury and Non-invasive Monitoring of Recovery

筋肉の菌株は、医師によって治療された最も一般的な苦情の一つです。筋肉の損傷は通常、単独で患者の病歴と身体検査から診断されている、しかし、臨床症状は、筋肉の損傷や筋肉の疾患を有する患者では傷害の程度、患者の痛みの公差等によって大幅に変動しますので、筋肉の損傷の評価は通常、このような動きの優しさ、強さ、範囲、そして最近では、画像検査などの臨床症状、に限定。このような血清クレアチンキナーゼのレベルのような生物学的マーカーが、、一般的に筋肉の傷害で上昇しているが、そのレベルは常に力の生産の損失と相関関係はありません。これは、被害の&quot;直接測定&quot;を提供するが、関数のすべての損失を計上していない動物は、からにも組織学的所見の真です。いくつかの収縮力で筋肉の全体的な健康の最も包括的な措置と主張してきた。筋肉の損傷は生体力学的条件の様々な環境下で発生するランダムイベントなので、勉強することは困難です。ここで、我々 は 、in vivo動物モデルでのトルクを測定することで信頼性の筋肉の損傷を生成するために説明します。我々はまた、 その場で分離された筋肉から力の測定のための我々のモデルについて説明します。さらに、我々は小動物MRIの手順を説明します。

アン<em&gt; in vivoで</emけがの&gt;動物モデルが記載されている。方法は、腓骨神経の皮下の位置を利用しています。速度、筋活動のタイミング、および動きの円弧は、すべての商用ソフトウェアを使用して事前に決定し、同期されます。損傷後の変更が監視されます<em&gt; in vivoで</em&gt; MRイメージング/分光法を用いた。

筋 strains（筋挫傷・筋牽引）は、医師が治療する中で最も頻度の高い不満の一つです。筋損傷は通常、患者の病歴と身体的な……

本手順の全体的な目的は、ラットまたはマウスの背屈筋に、in vivoで信頼性の高い収縮誘発損傷を再現することです。これは、近位脛骨に細ゲージのピンを刺入することで達成されます。その後、脚を装置上で固定します。第3のステップは、総腓骨神経が適切に刺激されているかを確認することです。最後に、足をフットプレートに固定してトルク測定を行い、損傷を誘発する伸張性収縮を実施します。最終的に、再テスト、トルク測定、および/または磁気共鳴スキャンを用いることで、機能および構造の変化を示す結果を得ることができます。当研究室では、骨格筋の収縮機能を評価するためにいくつかの手法を用いています。in situ法は、TIBialis anteriorなどの単離筋の最適筋長および最大張力を決定したい場合に用いられます。このin vivo手法の主な利点は、解剖学的構造が完全に維持されることです。さらに、同一個体内で時間を追って繰り返し測定を行うことが可能です。MRIを用いることで、骨格筋の解剖学的構造を、損傷の前後で非侵襲的にモニタリングすることができます。まず、麻酔をかけた動物を、ヒートランプの下で仰臥位に安置します。角膜の乾燥を防ぐため、両眼に滅菌眼軟膏を塗布します。除毛後、ベタジンと70%アルコールで交互に洗浄し、皮膚の処置を行います。足指つまみ反射（toe pinch reflex）が消失していることを確認し、麻酔深度が適切であることを検証します。次に、近位脛骨に針を刺入し、肢をリグに固定します。つま先が真上を向くように針の位置を固定してください。針を固定し、脚を安定させるために、特製のデバイスを使用します。足をステッピングモーターとトルクセンサーに取り付けられたフットプレートの上に置きます。足が脛骨に対して直角になるように調整します。皮下電極を用いて、腓骨頸付近の腓骨神経を刺激します。単独の背屈が確認された後は、経皮電極を使用することも可能です。足部を足固定プレートに粘着テープで固定し、収縮活性化を同期させる市販のソフトウェアをロードします。損傷前の足関節回転の開始およびトルクデータの収集を行います。最大融合強直収縮を誘発させるために、90から100 Hzの刺激を適用します。これは、足関節の動きを伴わずに背屈トルクを記録する等尺性収縮である必要があります。損傷を誘発するためのさらなる分析に向けて、3回の独立した単収縮および強直収縮を記録します。最大等尺性収縮に伸張収縮を重ね合わせ、必要に応じて可動範囲、伸張速度、および刺激のタイミングを調整します。損傷後、最大等尺性トルクをもう一度記録します。最後に、脛骨ピンを抜去し、脚部を洗浄します。動物を加熱されたホームケージに入れ、回復するまで観察します。この手順は、ここで示すようにマウスでも実施可能です。適切なキャリブレーションを行い、

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JoVE Journal

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アン in vivoで齧歯類モデル

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