追跡調査のためのQdot ®二ナノとマウス骨髄由来樹状細胞の世代とラベリング
2011年6月2日
樹状細胞の取り込み抗原およびT細胞に処理された抗原を提示する免疫器官に向かって移動する。 Qdot ®二ナノラベルは、長期的かつ安定的な蛍光シグナルを提供します。これは、蛍光顕微鏡により異なる臓器に樹状細胞を追跡できます。
この手順の全体的な目標は、Q dotナノ結晶を使用したイメージング研究用の樹状細胞を調製することです。これは、最初に骨髄細胞をmurn、femur、およびtibiasから単離することによって達成されます。次に、GM CSFの存在下で樹状細胞への細胞分化を促進するために、骨髄細胞培養を設定します。
その後、樹状細胞は8日後に骨髄細胞培養から回収されます。手順の最後のステップは、蛍光Qナノ結晶で細胞を染色することです。最終的に、明るく染色された樹状細胞を蛍光顕微鏡で可視化することができます。
GFPタグ樹状細胞などの他の方法と比較して、この技術を使用する主な利点は、Qドットナノ結晶がアセトンなどの有機溶媒で染色した後でも蛍光を保持することです。この方法は、樹状細胞生物学者が抱える重要な疑問、例えば、異なる疾患や異なる疾患におけるこれらの細胞の遊走特性などに答えるのに役立ちます。染色手順を実演するのは、私の研究室の大学院生であるMaria Aliです。
犠牲にした後、骨の端を切らずに2匹のマウスの脛骨と大腿骨を慎重に解剖します。次に、ティッシュペーパーを使用して、骨から付着したすべての組織をきれいにし、骨を壊さないように注意してください。バイオセーフティフードの中。
35mmのシャーレに70%エタノールを入れ、骨をエタノールに10分間浸します。骨を滅菌した後、エタノールから骨を回収し、新しいシャーレで5分間自然乾燥させます。次に、大腿骨の中央と脛骨の最も細い先端をカットします。
滅菌注射器を使用して、骨の内側に1ミリリットルのRPMI培地を注入します。細胞懸濁液を15ミリリットルのチューブに集め、スイングバケットローターを備えた遠心分離機で、摂氏4度でGの300倍で10分間遠心分離することにより、RPMI培地で2回洗浄します。最後の洗浄後、細胞を2ミリリットルのCK溶解液に懸濁し、緩衝液にし、室温で5分間インキュベートして赤血球を除去します。
次に、13ミリリットルのRPMIと10%FBSを加え、前と同じ遠心分離機の設定でこの培地で細胞をさらに2回洗浄します。細胞を数え、濃度を1ミリリットルあたり5番目の細胞の10の2倍に調整します。RPMI plus 10%FBSを使用して、組換えマウスG-M-C-S-Fを最終濃度20ナノグラム/ミリリットルに添加します。
次に、この懸濁液の10ミリリットルを無菌の微生物学的品質の10センチメートルのペトリ皿と培養物に加えます。二酸化炭素インキュベーター内の細胞懸濁液。3日後、準備した各プレートに、さらに10ミリリットルのRPMIと10%FBSと1ミリリットルあたり20ナノグラムの組換えマウスG-M-C-S-Fを追加します。
さらに3日後、各ペトリ皿から10ミリリットルの細胞懸濁液を回収し、同じ条件下で細胞を遠心分離し、ペトリ皿から回収したのと同じ量のRPMIと10%FBSでペレットを再懸濁し、新しい組換えマウスG-M-C-S-Fを補充します。最後に、細胞懸濁液を各元のペトリ皿に戻し、二酸化炭素インキュベーターでさらに2日間細胞を培養します。培養で8日後、ペトリ皿を新鮮な培地で洗浄することにより、浮遊して緩く付着した細胞を回復させます。
次に、収集した細胞をQ tracker 6 55細胞標識キットで、製造元の指示に従って、マウスの骨髄由来dcsを10ナノモル濃度のQナノ結晶で5回10〜6回標識します。まず、キット成分AとBの各5マイクロリットルをアイノールチューブで混合し、室温で5分間インキュベートします。次に、1ミリリットルのRPMIと10%FBSを追加し、チューブを30秒間ボルテックスします。
次に、5回目に10を5回足します。DCSを0.5ミリリットルのRPMIと10%FBSに懸濁し、37°CのD溶液中で細胞を60分間インキュベートします。次に、前と同じ条件で細胞をRPMIと10%FBSで2回洗浄し、ペレットをRPMIに再懸濁します。
この図は、DCの蛍光顕微鏡写真の例を示しています。標識後すぐに、標識細胞の滴をスライドガラス上に堆積させ、カバースリップで覆いました。次に、サンプルを蛍光顕微鏡を使用して評価しました。
この図では、48時間後のdcsの蛍光顕微鏡写真で、in vitroでの成熟が標識されているのがわかります。DCSは、二酸化炭素インキュベーター内のスライド培養チャンバー上で、100ナノグラム/ミリリットル、LPSおよび20ナノグラム/ミリリットル、TNFアルファで48時間培養しました。次に、サンプルをアセトンで固定したPBSで洗浄し、DPIで対比染色し、蛍光顕微鏡を使用して評価しました。
in vitroで成熟した標識dcsをフローサイトメトリーQドットで解析した細胞は、FLで強いシグナルを発し、Qは染色済みおよび未染色の3チャンネルで強いシグナルを示します。さらに、成熟マーカーであるCD 86およびCD 40に対する特異的抗体でDcsを染色し、その後、アイソタイプコントロール細胞をフローサイトメトリーで分析しました。さらに、IL 6 および一酸化窒素のレベルは、成熟 Q 染色 DCS およびコントロールの上清で測定されました。
ここでは、解剖された組織中の標識されたDCSの代表的な図を標識して示しています。成熟したDCをC 57 black sixマウスに静脈内注射した。3日後、マウスを犠牲にし、脾臓を採取しました。
OCTに埋め込まれたスナップ凍結と8ミクロン切片をクライオスタットを使用して調製しました。次に、サンプルをアセトンで固定し、DPIで対比染色し、蛍光顕微鏡を使用して評価しました。次の手順に従います。
抗原のポージングや異なる刺激による成熟などの他の方法は、異なる成熟刺激に応答した樹状細胞の移動などの追加の質問に答えるために実行できます。
概要
本研究では、Qdotナノ結晶を用いてイメージング用の樹状細胞を調製する手順について概説します。この手法により、蛍光顕微鏡による樹状細胞の可視化が可能となり、その遊走特性に関する知見を得ることができます。
研究の主要構成要素
科学分野
- 免疫学
- 細胞生物学
- 蛍光顕微鏡法
背景
- 樹状細胞は、T細胞に抗原を提示することで免疫応答において重要な役割を果たします。
- Qdotナノ結晶は、細胞追跡のための安定した蛍光信号を提供します。
- この手法により、さまざまな疾患背景における樹状細胞の挙動の研究が促進されます。
- 従来の手法では、同レベルの蛍光安定性が得られない場合があります。
研究目的
- Qdotナノ結晶を用いて樹状細胞を標識するための信頼性の高い手法を開発すること。
- 生体内（in vivo）における樹状細胞のトラッキングを容易にすること。
- 異なる疾患モデルにおける樹状細胞の遊走特性を探索すること。
使用された手法
- マウスからの骨髄細胞の単離。
- 樹状細胞へ分化させるためのGM-CSFを用いた細胞培養。
- Qdotナノ結晶による樹状細胞の染色。
- 蛍光顕微鏡およびフローサイトメトリーを用いた可視化。
主要な結果
- 適切にラベル化された樹状細胞は、強い蛍光信号を示した。
- GFPタグと比較したQdotナノクリスタルの安定性を実証した。
- in vitroおよびin vivoにおいて、樹状細胞の成熟と遊走を可視化した。
- 樹状細胞が関与する免疫応答メカニズムに関する知見を提供した。
結論
- Qdot標識法は、樹状細胞のダイナミクスを研究するのに有効です。
- 本手法により、さまざまな疾患における樹状細胞の挙動への理解を深めることができます。
- 今後の研究では、このアプローチを利用して、異なる成熟刺激を調査することが可能です。
よくある質問
業界における実用的な重要性
樹状細胞をQdotナノ結晶でラベル化することで、前臨床モデルにおける免疫細胞の遊走を追跡するための安定した長期的な蛍光が得られます。この手法は、抗原提示細胞のダイナミクスの確実な可視化を実現し、免疫療法の開発におけるメカニズム上のリスク低減を支援します。また、疾患に関連する系において樹状細胞の挙動を直接観察することが可能になるため、初期探索段階における予測の信頼性が向上します。
バイオ医薬品R&Dにおける戦略的応用
初期発見とターゲットバリデーション
- 科学的価値：疾患モデルにおける樹状細胞の遊走および抗原提示経路の解析を可能にする。
- 運用的価値：固定や溶媒への曝露後も持続する安定した蛍光ラベルを提供し、組織処理中の信号損失を低減させる。
- 予測的価値：in vivoでの局在および成熟状態を追跡することにより、樹状細胞生物製剤の機能的な検証をサポートする。
スクリーニングおよびアッセイ開発
- 科学的価値： 樹状細胞の成熟および活性化状態を評価するための定量可能な蛍光リードアウトを生成する。
- 運用上の価値： フローサイトメトリーおよび顕微鏡プラットフォームと互換性があり、免疫調節化合物のハイスループットスクリーニングを可能にする。
- アッセイの準備状況： 再現性のある免疫プロファイリングアッセイに適した、標準化されたラベル付き樹状細胞バッチを作製する。
トランスレーショナル・前臨床研究
- 科学的価値：末梢組織からリンパ器官への樹状細胞の移動の追跡を容易にし、免疫監視のモデル化を可能にする。
- 運用的価値：マウスモデルにおける縦断的なイメージング研究を可能にし、ワクチンまたはアジュバントによって誘導される免疫応答を評価できる。
- トランスレーショナルな連続性：樹状細胞の局在と機能的な免疫結果を相関させることで、バイオマーカーに基づいた研究をサポートする。
パイプラインおよびワークフローの統合
本手法は、初期のターゲットバリデーションから前臨床の免疫プロファイリングに至るディスカバリーワークフローに統合可能であり、免疫調節スクリーニングにおける機能的なリードアウトとして、樹状細胞のダイナミクスの可視化を実現します。
- 探索生物学： 抗原の捕捉、遊走、およびT細胞プライミングにおける樹状細胞機能の仮説検証をサポートします。
- スクリーニング： 化合物スクリーニングおよび免疫調節剤プロファイリングのための、標識樹状細胞の標準化された調製を可能にします。
- 分析： 定量的な蛍光およびフローサイトメトリーのリードアウトを提供し、異なる条件下での樹状細胞の成熟および活性化を比較します。
- トランスレーショナルリサーチ： in vitroでの樹状細胞の挙動を、疾患関連マウスモデルにおけるin vivoのトラフィッキングパターンへと結びつけます。
- エンタープライズでの再利用： 複数の免疫療法探索プロジェクトに適用可能な、免疫細胞標識のための再利用可能なプラットフォームを構築します。
運用および企業への影響
- 科学的価値：安定した長期的なトラッキングにより、樹状細胞介在性免疫応答におけるメカニズム的な曖昧さを低減する。
- 運用的価値：標準化されたラベル化プロトコルとバッチ間変動の最小化により、研究室間での再現性を確保する。
- 戦略的価値：標的への結合および免疫細胞のトラフィッキングに関する直接的な視覚的根拠を提供することで、免疫療法開発におけるgo/no-go判断を改善する。
- ポートフォリオへの影響：検証済みの樹状細胞の調節および遊走プロファイルに基づいた、リスク調整後の候補物質の優先順位付けを可能にする。
実施上の検討事項
- 初代細胞培養、無菌操作、および蛍光顕微鏡観察の専門知識が必要です。
- Qdot標識キット、フローサイトメーター、および組織切片作製用のクリオスタット装置へのアクセスが必要です。
- ユーザー間で細胞分化のタイミングおよび標識濃度の標準化を行う必要があります。
- ヒト樹状細胞モデルに適用する場合、サイトカイン条件および標識効率の最適化が必要になる場合があります。
- 実用上の制限として、高濃度におけるQdotの凝集の可能性があり、細胞毒性を避けるために慎重なタイトレーションが必要です。
