追跡調査のためのQdot ®二ナノとマウス骨髄由来樹状細胞の世代とラベリング

本手順の目的は、Qドットナノ結晶を用いたイメージング研究のために樹状細胞を調製することです。まず、鼠径部、大腿骨および脛骨から骨髄細胞を単離します。次に、GM-CSF存在下で骨髄細胞を培養し、樹状細胞への分化を促進させます。

その後、8日後に骨髄細胞培養物から樹状細胞を回収します。プロシージャの最終ステップは、蛍光Qナノ結晶で細胞を染色することです。最終的に、明るく染色された樹状細胞を蛍光顕微鏡で視覚化できます。

GFPタグ付き樹状細胞を用いるなどの他の手法と比較して、この技術を用いる主な利点は、Qドットナノ結晶がアセトンなどの有機溶媒で染色した後でも蛍光を保持することにあります。この手法は、さまざまな疾患における、あるいは異なる疾患の文脈におけるこれらの細胞の遊走特性など、樹状細胞生物学における重要な疑問に答えるのに役立ちます。染色の手順については、私の研究室の大学院生であるMaria Aliが実演します。

安楽死後、骨端を切断しないよう注意しながら、マウス2匹から脛骨と大腿骨を慎重に摘出します。次に、骨を折らないように注意しながら、ティッシュペーパーを使用して骨に付着しているすべての組織を清掃します。これらの操作はバイオセーフティフード内で行ってください。

35 mmのペトリ皿に70% ethanolを満たし、そこに骨を10分間浸します。骨が滅菌されたら、エタノールから取り出し、新しいペトリ皿に入れて5分間自然乾燥させます。次に、大腿骨を中央で、脛骨を最も細い先端部分で切断します。

滅菌シリンジを用いて、骨の内部に1 mLのRPMI培地を注入します。細胞懸濁液を15 mLチューブに回収し、スイングバケットローター付き遠心機を用いて、4 °C、300 ×gで10分間遠心分離を行い、RPMI培地で2回洗浄します。最後の洗浄後、細胞を2 mLのCK溶出バッファーに再懸濁し、赤血球を除去するために室温で5分間インキュベートします。

次に、10% FBS添加RPMIを13 milliliters加え、前回と同様の遠心分離条件で、この培地を用いてさらに2回細胞を洗浄します。細胞数をカウントし、濃度を2 × 10⁵ cells/milliliterに調整します。10% FBS添加RPMIを用いて、リコンビナントマウスG-M-CSFを最終濃度20 nanograms/milliliterになるように添加します。

次に、この懸濁液10 millilitersを滅菌済みの微生物学用10 centimeterペトリ皿に分注し、二酸化炭素インキュベーター内で細胞懸濁液を培養します。3日後、準備した各プレートに、20 nanograms per milliliterの組換えマウスG-M-C-S-Fを含む10% FBS添加RPMIをさらに10 milliliters加えます。

さらに3日後、各シャーレから10 mLの細胞懸濁液を回収し、同様の条件で遠心分離を行い、回収量と同量の10% FBS添加RPMIでペレットを再懸濁して、新しいリコンビナントマウスG-M-C-S-Fを補充します。最後に、細胞懸濁液を元の各シャーレに戻し、二酸化炭素インキュベーター内でさらに2日間培養します。培養8日後、新鮮な培地でシャーレを洗浄し、浮遊細胞およびゆるく付着している細胞を回収します。

次に、製造元の指示に従い、Q tracker 6 55 cell labeling kitを用いて回収した細胞を標識します。10 nM濃度のQ nano crystalsを用いて、5×10⁶個のマウス骨髄由来DCを標識します。まず、キットのコンポーネントAおよびBを各5 µLずつエッペンドルフチューブに混ぜ合わせ、室温で5分間インキュベートします。その後、10% FBS含有RPMIを1 mL加え、チューブを30秒間ボルテックスします。

次に、0.5 mLのRPMI（10% FBS添加）に懸濁した5×10⁵個のDcsをエッペンドルフチューブに加え、D溶液中で37°Cで60分間細胞をインキュベートします。その後、前述と同様の条件下でRPMI（10% FBS添加）を用いて細胞を2回洗浄し、ペレットをRPMIに再懸濁します。

この図はdcsの蛍光顕微鏡写真の例を示しています。標識直後、標識した細胞の液滴をガラススライド上に滴下し、カバーガラスで覆いました。その後、蛍光顕微鏡を用いてサンプルを評価しました。

この図では、48時間のin vitro成熟後のdcsの蛍光顕微鏡写真がラベル付けされて示されています。dcsは、二酸化炭素インキュベーター内のスライド培養チャンバーを用いて、100 ng/mLのLPSおよび20 ng/mLのTNF α存在下で48時間培養されました。その後、サンプルをPBSで洗浄し、アセトンで固定し、DPIで対比染色した後、蛍光顕微鏡を用いて評価しました。

in vitroで成熟させた標識済みDCをフローサイトメトリーで解析しました。Qdot染色された細胞は、FL3チャネルにおいて強いシグナルを示しました（Qdot染色ありおよびなし）。さらに、成熟マーカーであるCD86およびCD40に対する特異的抗体、およびアイソタイプコントロールでDCを染色し、フローサイトメトリーで解析しました。加えて、成熟したQdot標識DCおよびコントロールの培養上清中のIL-6および一酸化窒素レベルを測定しました。

切断した組織における標識されたDCSの代表的な図をここに示します。成熟したDCSをC 57 black sixマウスに静脈内注射しました。3日後、マウスを犠牲にして脾臓を回収しました。

OCTで包埋して急結凍し、クライオスタットを用いて8 µmの切片を作成しました。その後、サンプルをアセトンで固定し、DPIで対比染色を行い、蛍光顕微鏡を用いて評価しました。これらの手順に従いました。

異なる成熟刺激に対する樹状細胞の遊走など、追加の疑問を解決するために、抗原提示や異なる刺激による成熟などの他の手法を行うことができます。