ビブラトームは、コルチ器の哺乳類器官の細胞構築の強化された保全のためセクショニング

本実験の全般的な目的は、細胞構築を最大限に維持した状態でコルチ器をイメージングすることです。これは、摘出および固定済みの内耳をビブラトームで切断し、蝸牛あたりの切断面数を最小限に抑えながら厚い切片を得ることで達成されます。その後、これらのビブラトーム切片を免疫組織化学染色し、これによりコルチ器におけるさまざまな細胞型や細胞構造の特定が可能になります。

次に、切片を固定し、共焦点顕微鏡でイメージングして、Z方向の位置を定義する高解像度画像を取得します。厚いVibratome切片全体を通じて、切断プロセスによる影響を最小限に抑えながら、コルチ器内の細胞や構造を共焦点顕微鏡で観察できる結果が得られます。パラフィン切片や凍結切片などの既存の手法と比較したこの技術の主な利点は、蝸牛への物理的な損傷が最小限に抑えられ、コルチ器の細胞構造をより良好に保存できることです。内耳を単離するために、まず、安楽死させた成マウスをカミソリで断頭します。

正中線に沿って頭蓋骨を開き、ピンセットを用いて慎重に脳を取り除いてそれぞれの耳を露出させ、両側の内耳を掻き出します。内耳を新鮮な4%パラホルムアルデヒドを入れたクライオチューブに入れ、4°Cで一晩緩やかに揺らして固定します。翌日、1倍リン酸緩衝生理食塩水で3回洗浄して固定液を除去し、10%EDTA中で4°Cで5日間インキュベートして成体組織を脱灰します。

内耳をすすぎ、処理の準備が整うまで1×PBSで保存します。アガロースを1×PBSに加え、完全に溶解するまで電子レンジで加熱して4%低融点アガロースを作成します。溶解したアガロースは、使用直前まで55 °Cのウォーターバスで保持してください。

ピンセットを用いてPBSから内耳を取り出し、剥離可能な包埋モールドの底に配置します。残った液体をピペットで取り除いた後、モールドにmol and arosを充填し、コルチ器の横断切片を作成するために内耳を完全に覆います。内耳の外側半規管が外側から見えるように配置してください。

内耳の視認角度を調整し、蝸牛の最も後方の領域によって形成される線が、予定している切断面から45度の角度になるようにします。アガロースが凝固したら、プラスチック製型を剥がします。カミソリを使用して余分なアガロースを切り落とし、立方体を作成します。

組織が十分に支持されるよう、周囲に十分なアガロースを残すようにしてください。切片作成時には、アガロースキューブの底部を瞬間接着剤でバイブラトムの切断面に固定し、40〜100 µmの厚さで切断し、切片を0.1% Triton X 100を含む1× PBSを入れたディッシュにピンセットで回収します。

組織切片をアロスから切り離します。開口部の広いピペットチップを用いて、切片を0.1% Triton X 100を含む新鮮な1倍PBSが入ったディッシュに移し、組織培養プレート内で抗体染色を行います。抗体染色の完了後、組織切片を顕微鏡スライドに封入します。

厚い組織切片の圧砕を防ぐため、カバーガラスとスライドガラスの間に隙間を作るように、切片の周囲を四角く囲む形で真空グリースを塗布します。組織切片を顕微鏡スライドに転送します。カバーガラスの端をしっかりと押し下げて、密封します。

あるいは、カバーガラスを載せる4つの角に、メッシュサイズの既知であるAGROSクロマトグラフィー樹脂を1 µLずつ注入し、カバーガラスを被せて、ネイルポリッシュで端を封印します。共焦点Zスタックの最初の画像では、器官の皮質断層を通じて、内有毛細胞、その隣接する内有毛細胞、外有毛細胞、およびディーター細胞が観察されます。核染色時、ピラー細胞はS100抗体染色によって可視化され、黄色く見えます。Zスタックを3 µmステップで断層方向に進めることで、核の出現と消失を確認し、ピラー細胞の数を数えることができます。

このビデオを視聴することで、振動切片法（vibram）を用いた内耳の切片作成、これらの切片に対する免疫組織化学染色の実施、および共焦点顕微鏡によるイメージングの手法について十分に理解することができます。あらゆる抗体に適用可能なこの簡便な手順により、コルチ器の細胞組織を最大限に保持することが可能になります。