セミ厚い脳スライスにおける高解像度蛍光イメージングへの迅速なアプローチ

本手順の全体的な目的は、厚い脳切片内の蛍光ニューロンをより容易に可視化することです。まず、脳をアエロスプラグホルダーに埋め込むことでこれを達成します。手順の次のステップでは、圧縮トメを用いて脳を厚い切片に切断します。

手順の第3段階では、グリセロール勾配を用いて脳切片を光学的に透明化します。手順の最終段階では、透明化した脳切片をスライドグラスにマウントし、蛍光イメージングを行います。最終的に、落射蛍光顕微鏡または共焦点顕微鏡を用いることで、厚い脳切片内のニューロンにおける高解像度な蛍光タンパク質リポーターの発現結果を得ることができます。

薄切切片法、連続蛍光顕微鏡法、またはマルチフォトイメージングなどの既存の手法に対する本手法の主な利点は、はるかに迅速で労力が少なくて済み、高価または高度な顕微鏡技術を必要としないことです。まず、心臓灌流によるNC two固定を行い、4 °Cで1～2時間後固定したマウス脳組織を回収します。次に、PBSを用いて2%の高強度・低ゲル点アガロ溶液を調製し、電子レンジで溶解するまで加熱します。

溶融したagrosを試験管に移し、40 °Cのヒートブロックに置いて温度を平衡化させます。agrosの温度が安定する間に、固定した脳組織を specimen syringeのプランジャーに接着します。Sano Aate glueを用い、装着した組織を飽和ショ糖PBS溶液に浸して脳表面をコーティングし、その後プランジャーをプランジャーハウジング内に引き下げます。温めたarosをプランジャーにピペッティングし、気泡が入らないように注意しながら脳組織を完全に覆います。

最後に、試料シリンジを冷却ブロックで約1分間冷却します。アロス（aros）をセットするには、脳組織を包埋した試料シリンジを圧縮ホームに取り付けます。ブレードの端を試料シリンジの出口に密着させ、バッファータンクにPBSを満たします。

マイクロメーターを回転させます。埋没させた脳組織が標本シリンジから押し出されるまで、スライス厚1回分だけ前進させます。最初のスライスを作成するには、コントロールユニットのスタートボタンを押してください。

埋没組織を送り出し、スタートボタンを押す操作を繰り返し、目的の枚数の切片を作成します。転送ピペットで切片を回収し、PBSを満たしたガラス製吸入バイアルに移します。回収した切片からPBSの大部分をピペットで取り除き、PBS調製10% glycerol溶液に置換します。切片が沈むまで、卓上回転シェーカーを用いて4°Cでバイアルを緩やかに揺らします。

25%、50%、次に75%のグリセロール溶液を用いて、デカンテーションと充填の工程を繰り返し、段階的なクリアリングを続けます。75%グリセロール溶液をピペットで取り除き、90%グリセロールに置換します。気泡が入らないように注意し、緩やかに揺らしながら4°Cで平衡化させます。

スライスが最大限に透明化されると、それ以上沈むことはなくなり、中性浮力を持つようになります。ピンセットを使用して、25 by 75 mmの顕微鏡スライドの視野範囲に適合するように、周囲に2〜3 mmの縁を持たせた開いた長方形に両面テープをカットします。スライド上の縁の内側に脳スライスを配置します。

カバーガラスを粘着テープの上にそっと下ろします。気泡が入らないように注意しながら、圧力をかけて密閉し、余分なグリセロールを吸引した後、カバーガラスの縁に透明なマニキュアを塗布して封印します。封印が乾燥したら、スライドをスライドボックスに入れて4°Cで保存するか、イメージングを行います。

直ちに落射蛍光顕微鏡を用いて観察します。enhanced GFPを発現するウイルスベクターの発現パターンが、厚さ200 µmのマウス脳組織冠状切片に確認できます。ここでは、落射蛍光画像のハイライト領域を共焦点顕微鏡を用いて高解像度で示し、皮質第5層の個々のニューロンを明らかにしています。

このビデオを視聴することで、迅速かつ高解像度な蛍光イメージングに向けた、固定済み厚切脳切片の作製方法について十分に理解することができます。