生体内イメージングを使ってリアルタイムで腫瘍におけるナノ粒子の取り込みの評価

本手順の全体的な目的は、生体内イメージングを用いて腫瘍へのナノ粒子の取り込み量を定量化することです。まず、鳥類胚の殻除去と培養を行います。次に、漿尿膜（CAM）にゼノグラフト腫瘍を形成させ、約1週間成長させます。

手順の3番目のステップは、ナノ粒子を静脈内に注入し、キセノグラフト腫瘍のリアルタイム生体内共焦点イメージングを行うことです。手順の最終ステップは、腫瘍を摘出し、切片を作成することです。最終的に、画像から腫瘍によるナノ粒子の取り込み量を定量化し、二次的な腫瘍解析を行うことができます。

既存の手法に対する本手法の主な利点は、微視的なレベルで腫瘍内におけるナノ粒子の蓄積動態を評価するための高解像度画像を生成できる点にあります。さらに、このモデルシステムを用いることで、単一の研究者が2週間以内に非常に多くの実験群を解析することが可能です。加えて、Shells胚のCory Alloid膜は、物理的な操作や非侵襲的イメージングが容易に行える状態で露出しています。

私の研究室では、がんの標的分子イメージングおよびドラッグデリバリーのためのナノ粒子の開発に注力しています。詳細な取り込み解析を行うための、迅速かつ安価なゼノグラフトモデルを探索した結果、シェルス鶏胚に着目しました。本研究では、改良型シェルス鶏胚モデルにおけるヒト腫瘍ゼノグラフトへのナノ粒子の取り込みを評価するため、高解像度生体内イメージングを用います。

本プロトコルのために、4日目の受精鶏胚を準備します。標準的な方法を用いて、心拍を確認し、胚が受精しており生存していることを確認してください。その後、胚の日齢9日まで、38 °C、相対湿度60%以上の条件下で孵化させます。これにより、胚が腫瘍細胞の接種に適した状態になります。

18ゲージの針を、5～6インチのタイゴンチューブを用いて1 mLシリンジに接続し、マイクロインジェクターを組み立てます。針の刃先（ベベル）を慎重にチューブ内に挿入してください。チューブが針先から約4～5インチ伸びている状態にします。

次に、腫瘍細胞懸濁液をチューブを通してシリンジ内に吸い込み、反転させます。シリンジの側面を軽く叩き、プランジャーを押し下げて気泡を除去してください。続いて、チューブの末端にマイクロインジェクション用のガラス針を装着し、細胞懸濁液が針先まで到達するまでプランジャーを押し下げます。

次に、解剖顕微鏡下で、10,000から100,000個の癌細胞をCAM内の間質空間にゆっくりと注意深く注入します。細胞がCAM内で目に見える塊を形成する必要があります。CAM表面に付着した細胞は、キムワイプや綿棒で軽く叩いて除去してください。その後、胚を38°C、湿度60%以上のインキュベーターに戻します。

腫瘍を最大7日間成長・血管化させ、ナノ粒子のイメージング前に直径が少なくとも5 mmに達するようにします。ナノ粒子は、生体内顕微鏡に対応した蛍光色素でラベルし、PBS中で4 °Cで保存してください。この条件下で少なくとも1年間は安定です。次に、ナノ粒子を1分間遠心分離して凝集物を沈殿させ、マイクロインジェクターに吸引します。PBSを用いてナノ粒子を希釈し、最終的に50 µLの容量で50 µgのナノ粒子を注入できるよう、1 mg/mLの作業濃度溶液を調製します。

胚発生16日目に注入を行います。腫瘍が十分に血管新生していることを確認し、腫瘍を保持する最適な胚を静脈的に選択します。腫瘍細胞およびナノ粒子とはスペクトル的に異なる低分子量蛍光デキストリンを注入してください。

次に、蛍光顕微鏡下でデキストリンを可視化し、腫瘍の血管新生が最も顕著な胚を選択します。胚を選択した後、準備したマイクロインジェクターを用いて、調製したナノ粒子を少なくとも 200 µL 滴下します。その後、シリンジを反転させます。

側面を軽く叩き、プランジャーを押し下げて気泡を取り除きます。次に、先端が細くなった長いガラス製マイクロインジェクション針をチューブの端に挿入し、ナノ粒子溶液が針先まで到達するまでプランジャーを押し下げます。鈍い針では外胚葉を貫通できず、鋭すぎたり細すぎたりする針は組織への挿入時に折れてしまいます。

次に、静脈内に30～200 µLのナノ粒子を、可視化したい側の反対側の胚に注入し、ナノ粒子注入直後に画像を撮影します。次項で述べる腫瘍の手順については、まず胚イメージングユニットを準備することから始めます。最初に、蓋の底面にあるイメージングポートの周囲に、真空 그리스を薄く塗布します。

次に、18 millimeterのガラスカバースリップをポートに装着します。次に、カバースリップがイメージングしたい領域の真上にくるように、ユニットに胚をセットします。カバースリップが胚に軽く接触するまでユニットの蓋をゆっくりと下げ、蓋をねじ込んで固定します。

次に、胚が入ったディッシュをイメージングユニットに入れ、37 °Cの水を満たします。このユニットにより、回転ディスク共焦点蛍光顕微鏡の回転ディスク共焦点顕微鏡下で胚を固定します。環境チャンバーが37 °Cであることを確認してください。

次に、カバースリップのウィンドウが顕微鏡対物レンズの直下にくるように、イメージングユニットをステージ上に配置します。その後、イメージングを開始してください。注射直後および1時間ごとの間隔で、腫瘍とその周囲の血管系の高解像度イメージスタックを取得します。

その後、画像には腫瘍血管に起こる詳細な構造変化が反映されます。胚は、ウォーターバスを交換することなく、最大36時間まで連続的にイメージングすることが可能です。画像からウイルスナノ粒子の取り込み量を定量化するには、velocityなどのソフトウェアパッケージを使用してください。

まず、腫瘍を選択し、周囲の間質から境界を明確にします。腫瘍を蛍光デキストリンで標識することで、選択が容易になります。次に、腫瘍内および隣接する間質の代表的な領域におけるナノ粒子の平均蛍光信号を算出します。

次に、平均シグナルの比率を算出します。腫瘍選択を平均シグナルに対して強化します。間質選択を強化します。

比率が1より大きい場合は、ナノ粒子が優先的に腫瘍に局在していることを示します。HT 29大腸がん細胞を、9日目のCAM内に直径約1 mmの塊となるように注入しました。7日間の培養後、鶏胚に低分子デキストリンを静脈内注入し、腫瘍の血管新生を確認しました。

CPMV LOR 6 47またはペグ化CPMV LOR 6 47ナノ粒子の静脈内投与を行い、高解像度リアルタイム共焦点イメージングで観察したところ、CPMVおよびペグ化CPMVナノ粒子はともに血管系全体を迅速に標識することが明らかになりました。投与後12時間以内に腫瘍領域とストローマ領域の蛍光信号を定量化したところ、ペグ化CPMVの腫瘍への取り込みはCPMVの約3倍高いことが示されました。このビデオを視聴することで、鳥類胚モデルにおける腫瘍異種移植へのナノ粒子取り込みを評価するための高解像度生体内イメージングの手順について、鳥類胚の調製から腫瘍細胞の異種移植、ナノ粒子の静脈内投与、そしてリアルタイム生体内共焦点イメージングによる腫瘍へのナノ粒子取り込みの評価までを十分に理解することができます。