Name: 生体内イメージングを使ってリアルタイムで腫瘍におけるナノ粒子の取り込みの評価 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-06-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 4 s
Description: 学ぶ ナノ粒子の腫瘍取り込みを生体内イメージングで定量化する手法。鳥類胚モデルを用いたリアルタイム高解像度イメージングにより、ナノ粒子の動態を詳細に評価し、がん研究への応用が可能です。

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この研究は、アリゾナ州にJDLとNIH / NCIの助成金＃CA120711 - 01A1とCA120711 - 01A1にCCSRIグラント＃700537とCIHRグラント＃84535によってサポートされていました。全ての実験は、動物実験の規制やガイドラインに従って実施し、ウェスタンオンタリオ大学で、カリフォルニア大学サンディ​​エゴ校の委員会、動物実験を使用していた。

1。鳥類胚のCAMへの腫瘍の接種<ol><li> 8のようなシェルレス受精ニワトリ胚を準備します。 </li><li>胚発生の9日目に、1 mLシリンジに接続して18ゲージ針を用いて、マイクロインジェクターを組み立てます。タイゴンチューブの5〜6インチピース（1 / 32"内径、3 / 32"外径、1 / 32"壁厚）をカットし、慎重にチューブに針のベベルを挿入する。チューブの約4〜5インチのはず針の先端（図1a）から延びる。 </li><li>細胞懸濁液と注射器とチューブを埋める。その後、チューブの端にマイクロインジェクションのガラス針を挿入し、慎重に気泡を取り除く。 </li><li> CAM（図1c）内ボーラスとして10,000-100,000癌細胞とイルミで解剖の範囲で9日目胚（図1b）を注入する。徐々に細胞を注入し、慎重に針がCAM内に表示されるボーラスを形成する細胞の正しい場所にあることを確認してください。 CAMの表面にドリップをキムワイプまたは他のアプリケーターを用いて洗浄することができる細胞。 </li><li> 60％の湿度で38℃で加湿インキュベーターに胚を戻すと成長し、血管が発達する（最大7日間）に腫瘍ができます。 </li></ol> 2。ナノ粒子の調製<ol><li>ニワトリ胚への注入のために蛍光標識CPMVのナノ粒子を準備するには、。いずれかを削除する1分間のために使用し、遠心前にウイルス粒子を（100μg/ mlの濃度に、PBS、pH7.4中8のように合成された渦混合物も希釈凝集体。音波処理も複合体および凝集の程度に応じて役に立つかもしれません。4℃で保存した場合、蛍光標識CP​​MVsの株式は、少なくとも1年間は安定である。·ダークのC。夫婦を入れて定期的に株式をチェックして、スライドガラスの上に落とし、蛍光。透過型電子顕微鏡（TEM）をチェックすると、粒子が抱合した後、そのまま残っているかどうかを判断するために使用することができます。 </li><li>簡単に言うと、ウイルス粒子の1マイクログラムは、（2μlの最終容量で）銅被覆グリッドに追加することができます。次に、電子顕微鏡（フィリップスEM 410）で1分間、2％酢酸ウラニルの等量を追加します。 </li></ol> 3。蛍光標識ウイルス粒子の静脈注射<ol><li> 16日目に、上記のように、マイクロインジェクターを組み立てます。注射器にチューブ（&gt; 200μL）を介してウイルス粒子の所望の体積を描く。慎重に気泡を取り除く。チューブの端にマイクロインジェクション用ガラス針を挿入します。針が（図2a）できるだけ長くしてテーパー状になっていることを確認してください。針が非常に鈍い場合は、外胚葉を通して貫くことができなくなりますし、血管を貫通して失敗します。針が非常にシャープの場合は組織を貫通する際に、先端が収縮されます。 </li><li>静脈内（図3D）可視化する目的のサイトから遠位の腫瘍を有する胚に1 mg / mlのフルオレセインデキストラン（MW7万ダ、Invitrogen社）の100μlを注入する。 CAMの静脈の成功カニューレは、インジェクションフローのパス内の血液のクリア（図2b）によって明らかである。注入後の血管の漏れ1時間を評価する。 </li><li>静脈内に目的のサイトから遠位血管の漏れで腫瘍を含む胚には1mg / CPMV -のAlexa Fluor ® 647（CPMV - AF 647）やPEG化CPMV -のAlexa Fluor ® 647（CPMV - PEG - AF 647）mlの溶液50μlを注入する可視化すること。 </li><li>画像の即座に腫瘍と横河電機回転ディスク、浜松ImagEM 9100〜12 EM - CCDカメラを装着したツァイス審査Z1正立顕微鏡を用いて注射後時間ごと。 </li></ol> 4。リアルタイム生体イメージング<ol><li>胚の撮像ユニットを組み立てるには、胚のイメージングユニットの蓋の下側の画像ポートの周囲に真空グリスの薄層を適用し、ポートに18 mmのガラスカバーを装着します。 </li><li>カバースリップは、イメージングのための必要なエリアをカバーするような胚を配置します。ゆっくりとカバースリップがちょうど胚に接触するまでふたを少し下げて、その後（図2c）の場所でそれを保持するためにユニットの上に蓋をねじ込む。 </li><li> ° C胚を含む皿の外胚の撮像ユニットに37に加熱水を追加し、その後、37に平衡内部環境室℃で直立共焦点顕微鏡のステージ上に全体のユニットを配置</li><li>スピニングディスク共焦点蛍光顕微鏡（図2E）の下で胚を含む撮像ユニットを置きます。撮像ユニットは、キャプチャされる三次元Zスタックやタイムラプスイメージの両方を可能にする、場所に胚を保持して画像を取り込む際に固定されたビューのフィールドを保持します。我々は、パーキンエルマーの（旧即興）Volocityのソフトウェアパッケージを（図3a）を用いて3次元タイムラプス画像を取得し、分析する。腫瘍の三次元スタックの高解像度とdetaile可視化するために周囲の血管系を取得する特定の時間点でのD構造解析。腫瘍血管系の詳細な構造変化をマッピングするために定期的な時間の点で三次元スタックを取得する。画像の腫瘍注射後の時間ごと。 </li><li>腫瘍や間質内の選択した領域内の平均値のAlexa Fluor（AF）647信号（非腫瘍領域）Volocity（パーキンエルマー）等の画像の定量ソフトウェアを用いて計算することにより、ウイルス粒子の取り込みを定量する。間質比は腫瘍は間質の平均AF 647信号を介して腫瘍の平均AF 647信号を割ることにより算出した。 1より高い腫瘍/間質比は、ナノ粒子が腫瘍によって占有されていることを示します。 </li></ol> 5。代表的な結果： この例ではここで説明する、私たちは9日目ニワトリ胚（図1b）のCAM内に大きさで1mm程度ボーラスを形成するために、HT - 29結腸癌細胞を注入した。接種後、胚は十分な腫瘍の増殖と血管新生（図1c）を許可する加湿インキュベーターで7日間培養した。胚は、腫瘍の血管新生を確認するために、低分子デキストランを静脈内注射した、と腫瘍はツァイスAxioExaminer Z1正立顕微鏡（図2d）で可視化した。 CPMV - AF 647またはCPMV - PEG - AF 647ナノ粒子（図3aとb）の静脈内投与後、高解像度のリアルタイム共焦点イメージング（図2eは）CPMVとCPMV - PEGは、ナノ粒子の両方が急激に全体の血管系のラベルが付いたことを明らかにしたが、腫瘍によるCPMV - PEGの取り込みは、12時間（図3a）の後CPMVより約3倍高かった。ナノ粒子の相対的な腫瘍の取り込み、画像解析ソフトウェアを（パーキンエルマーからVolocity）を用いて決定した。関心領域は、腫瘍内と外で選ばれた（間質コンパートメントにおける）とそれぞれの平均蛍光強度を測定した。データは、腫瘍/間質比として表現さ​​れます。 <img src="/files/ftp_upload/2808/2808fig1.jpg" alt="図1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図1"> 図1。鳥類の胚のCAMへの腫瘍のマイクロインジェクション。示されているように（a）にマイクロインジェクション装​​置は、コンポーネントから組み立てられます。 （B）9日目での鳥の胚では、CAMが表面全体を覆​​うように広がっているときに腫瘍を接種する準備が整いました。 （C）16日目では、腫瘍は直径1cm（破線）にまでに成長し、ナノ粒子を注射するための準備ができているでしょう。 <img src="/files/ftp_upload/2808/2808fig2.jpg" alt="図2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図2"> 図2ナノ粒子の注入と生体内イメージング。 CAMの静脈に注入するインジェクターの針の先端は準備ができて（）を示すと（b）マイクロインジェクターの針が静脈に挿入した（矢印）とクリアで見られる血流（に注入ナノ粒子解剖顕微鏡下で注入血液の）。 CAMとの直接インタフェースカバーと鳥類の胚を含む（C）イメージングユニット。 （D）ナノ粒子の注入に先立って、腫瘍の血管新生は、フルオレセインデキストランの投与後に生体内イメージングを用いて評価する。 （e）のイメージングユニットは37℃に温度調節エンクロージャのセット内で直立共焦点顕微鏡のステージ上に位置する胚を含む<img src="/files/ftp_upload/2808/2808fig3.jpg" alt="図3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図3"> 図3。ヒト腫瘍におけるナノ粒子の取り込みの生体内可視化。腫瘍は、（a）CPMV - AF647と（b）CPMV - PEG - AF647の注入後7時間を可視化している。その後の分析のための鳥類の胚から腫瘍のd）の切除。

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<li>Zijlstra, A., Lewis, J., Degryse, B., Stuhlmann, H., Quigley, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+inhibition+of+tumor+cell+intravasation+and+subsequent+metastasis+via+regulation+of+in+vivo+tumor+cell+motility+by+the+tetraspanin+CD151%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+cell%22%5BJournal%5D)">The inhibition of tumor cell intravasation and subsequent metastasis via regulation of in vivo tumor cell motility by the tetraspanin CD151.</a> Cancer cell. 13, 221-234 (2008).</li>
<li>Lewis, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viral+nanoparticles+as+tools+for+intravital+vascular+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+medicine%22%5BJournal%5D)">Viral nanoparticles as tools for intravital vascular imaging.</a> Nature medicine. 12, 354-360 (2006).</li>
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<li>Chatterji, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+addresses+on+an+addressable+virus+nanoblock%3B+uniquely+reactive+Lys+residues+on+cowpea+mosaic+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Chemistry+%26+biology%22%5BJournal%5D)">New addresses on an addressable virus nanoblock; uniquely reactive Lys residues on cowpea mosaic virus.</a> Chemistry & biology. 11, 855-863 (2004).</li>
<li>Brunel, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrazone+ligation+strategy+to+assemble+multifunctional+viral+nanoparticles+for+cell+imaging+and+tumor+targeting%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+letters%22%5BJournal%5D)">Hydrazone ligation strategy to assemble multifunctional viral nanoparticles for cell imaging and tumor targeting.</a> Nano letters. 10, 1093-1097 (2010).</li>
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<li>Steinmetz, N. F., Cho, C. F., Ablack, A., Lewis, J. D., Manchester, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CPMV+nanoparticles+target+surface+vimentin+on+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nanomedicine%22%5BJournal%5D)">CPMV nanoparticles target surface vimentin on cancer cells.</a> Nanomedicine. , Forthcoming (2010).</li>
</ol>

利害の衝突は宣言されません。

鳥類の胚の漿尿膜（CAM）は、ヒトの腫瘍の血管動態と薬物動態を評価するための有用なモデルです。 CAMモデルの構造と位置は、高品質の画像取得を可能にし、侵襲的な外科手術なしで癌異種移植片の多くの種類の対応。また、がんの腫瘍異種移植片は、腫瘍組織におけるナノ粒子の蓄積を評価するために、迅速、安価でセミハイスループットな手段を提供し、7日以内に血管が新生になる漿尿膜に移植。シェルレスニワトリ胚のCAMに移植された癌の異種移植片は、腫瘍血管系におけるナノ粒子の取り込みに関する直立落射蛍光または共焦点顕微鏡、文脈と時間情報の高分解能光学系にアクセスすることができるので容易に得ることができる。このモデルにおける癌の異種移植片は深さ未満が200メートルを維持しながら、大きい腫瘍で、その結果、CAMを介して横方向に成長する傾向がある。標準の落射蛍光顕微鏡は、効果的に腫瘍全体の質量を貫通することができるので、これは彼らが特に生体内イメージングに適しています。対照的に、マウスの中で表在性または同所のサイトのいずれかで移植された腫瘍は、それは難しい正確に非侵襲的手法によりこれらの腫瘍内の深いナノ粒子をローカライズすること、三次元的に増殖する。我々は、ナノ粒子製剤の広い範囲ののin vivo解析に適していることがこのモデルの可能性を強調し、ヒト腫瘍異種移植片の数で量子ドット、リポソーム、および酸化鉄ナノ粒子の取り込みを評価するためにこのモデルを利用してきた。

<table border="1"><tbody><tr><th>試薬名/機器</th><th>会社</th><th>カタログ番号</th><th>コメント</th></tr><tr><td>受精レグホン種の卵</td><td>フレイの`sの孵化場、セントジェイコブス</td><td> N / </td><td></td></tr><tr><td>ドレメルロータリーツール</td><td>ドレメル</td><td></td><td>任意のモデルを使用できます。 </td></tr><tr><td>ドレメルのカットオフホイールありません。 36 </td><td>ドレメル</td><td> 409 </td><td></td></tr><tr><td>スポーツマンハッチャー</td><td>ベリーヒル</td><td> 1550HA </td><td></td></tr><tr><td>スポーツマンインキュベーター</td><td>ベリーヒル</td><td> 1502EA </td><td></td></tr><tr><td>エタノール</td><td></td><td></td><td> 70％（vol / vol）の</td></tr><tr><td>ポリスチレンは、ボートの重量を量る</td><td> VWR </td><td> 12577〜01 </td><td></td></tr><tr><td>正方形のペトリ皿</td><td> Simport、VWR </td><td> 25378-115 </td><td></td></tr><tr><td>ふたが付いているラバーメイドラバーコンテナ</td><td> Guillevin </td><td> RH3 - 228 - 00 - BLU </td><td>側面に開けた穴</td></tr><tr><td>垂直ピペットプラー</td><td>デビッドKopfは楽器</td><td>モデル720 </td><td>セッティング：16.3（ヒーター）および2.3（ソレノイド） </td></tr><tr><td>ナトリウムホウケイ酸ガラス毛細管</td><td>サターのインストゥルメント</td><td> BF100 - 58から10 </td><td> （OD、1.0ミリメートル、ID 0.58ミリメートル、10 cmの長さ） </td></tr><tr><td> 1Xダルベッコ改変イーグル培地（DMEM） </td><td>インビトロジェン</td><td> 11995073 </td><td></td></tr><tr><td>ダルベッコ</td><td>インビトロジェン</td><td> 14190250 </td><td> pH7.4の</td></tr><tr><td>リン酸緩衝食塩水（D - PBS）（1X）、液体</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> EDTA 4NA、液体とトリプシン、0.05％（1X） </td><td>インビトロジェン</td><td> 25300054 </td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎仔血清</td><td>インビトロジェン</td><td> 12483-020 </td><td>熱は、不活性化する</td></tr><tr><td>血球計</td><td> Hausserサイエンティフィック、VWR </td><td> 15170-090 </td><td></td></tr><tr><td>遠心</td><td>エッペンドルフモデル​​5810R </td><td> 5811 000.010 </td><td></td></tr><tr><td>細かい点鉗子</td><td> VWR </td><td> 25607-856 </td><td></td></tr><tr><td>タイゴンR - 3603チューブ</td><td> VWR </td><td> 63009-983 </td><td> 50フィート（1/32-inch内径、3/32-inch外径、1/32-inch壁の厚さ</td></tr><tr><td>注射18ゲージの針のための注射針</td><td> BD </td><td> 305195 </td><td> 100のボックス</td></tr><tr><td>注射の場合は1 mLシリンジ</td><td> BD </td><td> 309602 </td><td> 100のボックス</td></tr><tr><td>光ファイバ顕微鏡の照明</td><td> Amscope </td><td> HL250 - AY </td><td> 150W </td></tr><tr><td>キムワイプ</td><td> VWR </td><td> 10805-905 </td><td></td></tr><tr><td> V.有爪類の種子（カリフォルニア黒眼がない。5） </td><td>バーピー</td><td> 51771A </td><td></td></tr><tr><td>屋内成長が点灯</td><td>ホテルサンライト新宿、庭師の供給</td><td></td><td></td></tr><tr><td>メチル- PEO4 - NHSエステル</td><td>ピアース</td><td> PI22341 </td><td></td></tr><tr><td> MPEG - NHS、PEGスクシンイミジルエステル、MW 2000 </td><td> NANOCS </td><td> PEG1 - 0002 </td><td></td></tr><tr><td>のAlexa Fluor 647カルボン酸（スクシンイミジルエステル） </td><td>インビトロジェン</td><td> A20006 </td><td></td></tr><tr><td>オレゴングリーン488スクシンイミジルエステル* 6 -異性体* </td><td>インビトロジェン</td><td> O - 6149 </td><td></td></tr><tr><td>ジメチルスルホキシド（DMSO） </td><td>シグマ</td><td> D8418 </td><td></td></tr><tr><td>二塩基性リン酸一水素</td><td>シグマ</td><td> 379980 </td><td> K2HPO4（phopshateバッファ用） </td></tr><tr><td>一塩基性リン酸二水素</td><td></td><td> P5655 </td><td> KH2PO4（phopshateバッファ用） </td></tr><tr><td>スーパーローズ6サイズ排除カラム</td><td> GEヘルスケアバイオサイエンス</td><td> 17-0673-01 </td><td></td></tr><tr><td> AKTAエクスプローラ100クロマトグラフ</td><td> GEアマシャムファルマシア</td><td> WS - AKTA100 </td><td></td></tr><tr><td> AKTAハイフローキット</td><td> GEヘルスケアバイオサイエンス</td><td> 18-1154-85 </td><td></td></tr><tr><td>スクロース</td><td>シグマ</td><td> S0389 </td><td></td></tr><tr><td>超遠心分離機</tD&gt; <td>ベックマン</td><td></td><td></td></tr><tr><td> SW 28 Tiローター</td><td>ベックマン</td><td> 342204 </td><td>スイングバケット</td></tr><tr><td> 50.2 Tiローター</td><td>ベックマン</td><td> 337901 </td><td>固定角度</td></tr><tr><td>アミコンウルトラ- 15遠心フィルターユニット</td><td>ミリポア</td><td> UFC910008 </td><td> 100kDaのカットオフ</td></tr><tr><td>勾配前者</td><td>バイオラッド</td><td></td><td></td></tr><tr><td>デキストラン、フルオレセイン、70,000 MW、陰イオン性</td><td>インビトロジェン</td><td> D1823 </td><td></td></tr><tr><td>ディスク共焦点蛍光顕微鏡をスピニング</td><td>クォーラム、横河電機 CSU 10、横河</td><td> N / </td><td></td></tr><tr><td>落射蛍光広視野顕微鏡</td><td>クォーラム;ツァイスアクシオ審査、ツァイス</td><td> N / </td><td></td></tr><tr><td>浜松ImagEM 9100〜12 EM - CCDカメラ</td><td>クォーラム;浜松</td><td> N / </td><td></td></tr><tr><td>顕微鏡用温度のエンクロージャのユニット</td><td>精密プラスチック</td><td> N / </td><td></td></tr><tr><td>真空グリース</td><td> VWR </td><td> 59344-055 </td><td></td></tr><tr><td>円形のガラスはカバースリップしません。 1（18 mm）の</td><td> VWR </td><td> 16004-300 </td><td></td></tr><tr><td> Volocityソフトウェア</td><td>パーキンエルマー</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ニワトリ胚のエンクロージャ</td><td></td><td>カスタムの作製</td><td></td></tr><tr><td>繊細なはさみ</td><td> VWR </td><td> 25608-203 </td><td></td></tr><tr><td>ホルマリン</td><td> Bioshop </td><td> FOR201.500 </td><td> fumehoodで使用</td></tr><tr><td>最適なカッティング</td><td>フィッシャー、ティッシュテック</td><td> 1437365 </td><td></td></tr><tr><td>温度（OCT） </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>プラスチック金型</td><td>フィッシャー</td><td> 22-038217 </td><td></td></tr><tr><td> VWR VistaVision HistoBond粘着スライド</td><td> VWR </td><td> 16004-406 </td><td></td></tr><tr><td> DAPIで金を延ばす</td><td>インビトロジェン</td><td> P36931 </td><td></td></tr><tr><td>クライオスタット用替刃</td><td>フィッシャー</td><td> 12-634-2 </td><td></td></tr><tr><td>クライオスタット</td><td>ライカCM 3050 S </td><td> 14047033518 </td><td></td></tr></table>

生体内イメージングを使ってリアルタイムで腫瘍におけるナノ粒子の取り込みの評価

Evaluation of Nanoparticle Uptake in Tumors in Real Time Using Intravital Imaging

このような超音波、MRI、PETとCTのような腫瘍イメージング、、のための現在の技術は、適切な異種移植モデルの有用性を強調し、微視的なレベル1,2,3での腫瘍のナノ粒子の取り込みの評価のために高解像度の画像を得ることができない詳細な取り込みの分析を実行するインチここで、我々は、修正された、シェルのないニワトリ胚モデルにおけるヒト腫瘍異種移植片でのナノ粒子の取り込みを評価するために高解像度の生体内イメージングを使用してください。それはヒトの腫瘍の成長をサポートしているため、ニワトリ胚のモデルは、特にin vivoでの解析でこれらのために適している、比較的安価であり、麻酔や手術は4,5は必要ありません。漿尿膜（CAM）6に移植するときに腫瘍細胞は7日以内に完全に血管移植片を形成する。結果として得られる腫瘍は、ホストまたは腫瘍どちらのシステムにおいてもほとんど影響を与えずに最大72時間まで維持することができる非侵襲的リアルタイム、高分解能のイメージングにより可視化。腫瘍への遠位投与サイズと処方の広い範囲でのナノ粒子は可視化し、血流を介してそれらの流れのように定量化することができる、漏れやすい腫瘍血管から浸出し、腫瘍部位に蓄積する。ここでは、近赤外蛍光色素および/ ​​またはポリエチレングリコールポリマー（PEG）7、8、9,10,11で飾らササゲモザイクウイルス由来のナノ粒子（CPMV）の分析について説明します。静脈内投与時には、これらのウイルス粒子が急速に外部の両方の血管系のグローバルなラベルで、腫瘍7,12内で、その結果、内皮細胞によって内在化されています。ウイルス粒子のPEG化は、それらの血漿中半減期を増加させ、循環で自分の時間を拡張し、最終的に強化された透過性と保持（EPR）効果7、10,11を介して腫瘍で、その蓄積を高める。腫瘍中のナノ粒子の蓄積の速度および程度は画像解析ソフトを用いて経時的に測定される。この手法は、ヒトの腫瘍にナノ粒子のダイナミクスを可視化し定量化するために、両方のメソッドを提供します。

我々は、鳥類の胚のモデルでは動的な、リアルタイム生体イメージングを用いたヒト異種移植腫瘍の血管系でのナノ粒子の局在を定量化する新しいアプローチを提示する。

超音波、MRI、PET、CTなどの現在の腫瘍イメージング技術では、ナノ粒子の評価に向けた高解像度画像を得ることができません。

本手順の全体的な目的は、生体内イメージングを用いて腫瘍へのナノ粒子の取り込み量を定量化することです。まず、鳥類胚の殻除去と培養を行います。次に、漿尿膜（CAM）にゼノグラフト腫瘍を形成させ、約1週間成長させます。手順の3番目のステップは、ナノ粒子を静脈内に注入し、キセノグラフト腫瘍のリアルタイム生体内共焦点イメージングを行うことです。手順の最終ステップは、腫瘍を摘出し、切片を作成することです。最終的に、画像から腫瘍によるナノ粒子の取り込み量を定量化し、二次的な腫瘍解析を行うことができます。既存の手法に対する本手法の主な利点は、微視的なレベルで腫瘍内におけるナノ粒子の蓄積動態を評価するための高解像度画像を生成できる点にあります。さらに、このモデルシステムを用いることで、単一の研究者が2週間以内に非常に多くの実験群を解析することが可能です。加えて、Shells胚のCory Alloid膜は、物理的な操作や非侵襲的イメージングが容易に行える状態で露出しています。私の研究室では、がんの標的分子イメージングおよびドラッグデリバリーのためのナノ粒子の開発に注力しています。詳細な取り込み解析を行うための、迅速かつ安価なゼノグラフトモデルを探索した結果、シェルス鶏胚に着目しました。本研究では、改良型シェルス鶏胚モデルにおけるヒト腫瘍ゼノグラフトへのナノ粒子の取り込みを評価するため、高解像度生体内イメージングを用います。本プロトコルのために、4日目の受精鶏胚を準備します。標準的な方法を用いて、心拍を確認し、胚が受精しており生存していることを確認してください。その後、胚の日齢9日まで、38 °C、相対湿度60%以上の条件下で孵化させます。これにより、胚が腫瘍細胞の接種に適した状態になります。18ゲージの針を、5～6インチのタイゴンチューブを用いて1 mLシリンジに接続し、マイクロインジェクターを組み立てます。針の刃先（ベベル）を慎重にチューブ内に挿入してください。チューブが針先から約4～5インチ伸びている状態にします。次に、腫瘍細胞懸濁液をチューブを通してシリンジ内に吸い込み、反転させます。シリンジの側面を軽く叩き、プランジャーを押し下げて気泡を除去してください。続いて、チューブの末端にマイクロインジェクション用のガラス針を装着し、細胞懸濁液が針先まで到達するまでプランジャーを押し下げます。次に、解剖顕微鏡下で、10,000から100,000個の癌細胞をCAM内の間質空間にゆっくりと注意深く注入します。細胞がCAM内で目に見える塊を形成する必要があります。CAM表面に付着した細胞は、キムワイプや綿棒で軽く叩いて除去してください。その後、胚を38°C、湿度60%以上のインキュベーターに戻します。腫瘍を最大7日間成長・血管化させ、ナノ粒子のイメージング前に直径が少なくとも5 mmに達するようにします。ナノ粒子は、生体内顕微鏡に対応した蛍光色素でラベルし、PBS中で4 °Cで保存してください。この条件下で少なくとも1年間は安定です。次に、ナノ粒子を1分間遠心分離して凝集物を沈殿させ、マイクロインジェクターに吸引します。PBSを用いてナノ粒子を希釈し、最終的に50 µLの容量で50 µgのナノ粒子を注入できるよう、1 mg/mLの作業濃度溶液を調製します。胚発生16日目に注入を行います。腫瘍が十分に血管新生していることを確認し、腫瘍を保持する最適な胚を静脈的に選択します。腫瘍細胞およびナノ粒子とはスペクトル的に異なる低分子量蛍光デキストリンを注入してください。次に、蛍光顕微鏡下でデキストリンを可視化し、腫瘍の血管新生が最も顕著な胚を選択します。胚を選択した後、準備したマイクロインジェクターを用いて、調製したナノ粒子を少なくとも 200 µL 滴下します。その後、シリンジを反転させます。側面を軽く叩き、プランジャーを押し下げて気泡を取り除きます。次に、先端が細くなった長いガラス製マイクロインジェクション針をチューブの端に挿入し、ナノ粒子溶液が針先まで到達するまでプランジャーを押し下げます。鈍い針では外胚葉を貫通できず、鋭すぎたり細すぎたりする針は組織への挿入時に折れてしまいます。次に、静脈内に30～200 µLのナノ粒子を、可視化したい側の反対側の胚に注入し、ナノ粒子注入直後に画像を撮影します。次項で述べる腫瘍の手順については、まず胚イメージングユニットを準備することから始めます。最初に、蓋の底面にあるイメージングポートの周囲に、真空 그리스を薄く塗布します。次に、18 millimeterのガラスカバースリップをポートに装着します。次に、カバースリップがイメージングしたい領域の真上にくるように、ユニットに胚をセットします。カバースリップが胚に軽く接触するまでユニットの蓋をゆっくりと下げ、蓋をねじ込んで固定します。次に、胚が入ったディッシュをイメージングユニットに入れ、37 °Cの水を満たします。このユニットにより、回転ディスク共焦点蛍光顕微鏡の回転ディスク共焦点顕微鏡下で胚を固定します。環境チャンバーが37 °Cであることを確認してください。次に、カバースリップのウィンドウが顕微鏡対物レンズの直下にくるように、イメージングユニットをステージ上に配置します。その後、イメージングを開始してください。注射直後および1時間ごとの間隔で、腫瘍とその周囲の血管系の高解像度イメージスタックを取得します。その後、画像には腫瘍血管に起こる詳細な構造変化が反映されます。胚は、ウォーターバスを交換することなく、最大36時間まで連続的にイメージングすることが可能です。画像からウイルスナノ粒子の取り込み量を定量化するには、velocityなどのソフトウェアパッケージを使用してください。まず、腫瘍を選択し、周囲の間質から境界を明確にします。腫瘍を蛍光デキストリンで標識することで、選択が容易になります。次に、腫瘍内および隣接する間質の代表的な領域におけるナノ粒子の平均蛍光信号を算出します。次に、平均シグナルの比率を算出します。腫瘍選択を平均シグナルに対して強化します。間質選択を強化します。比率が1より大きい場合は、ナノ粒子が優先的に腫瘍に局在していることを示します。HT 29大腸がん細胞を、9日目のCAM内に直径約1 mmの塊となるように注入しました。7日間の培養後、鶏胚に低分子デキストリンを静脈内注入し、腫瘍の血管新生を確認しました。CPMV LOR 6 47またはペグ化CPMV LOR 6 47ナノ粒子の静脈内投与を行い、高解像度リアルタイム共焦点イメージングで観察したところ、CPMVおよびペグ化CPMVナノ粒子はともに血管系全体を迅速に標識することが明らかになりました。投与後12時間以内に腫瘍領域とストローマ領域の蛍光信号を定量化したところ、ペグ化CPMVの腫瘍への取り込みはCPMVの約3倍高いことが示されました。このビデオを視聴することで、鳥類胚モデルにおける腫瘍異種移植へのナノ粒子取り込みを評価するための高解像度生体内イメージングの手順について、鳥類胚の調製から腫瘍細胞の異種移植、ナノ粒子の静脈内投与、そしてリアルタイム生体内共焦点イメージングによる腫瘍へのナノ粒子取り込みの評価までを十分に理解することができます。

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