CD71/TER119フローサイトメトリーアッセイを用いてマウス赤血球前駆細胞の同定と解析

次の実験の全体的な目標は、マウスの採取したばかりの組織から直接赤血球前駆体を特定することです。これにより、これらのマウスの赤血球生成系が変化している時期に、それらの分子特性を研究することができます。例えば、胚発生中または低酸素ストレスへの応答中に、まず造血組織がマウス胎児の肝臓または成体脾臓または骨髄から単離され、単一細胞懸濁液に解離されます。

次に、細胞を細胞表面マーカーCD71およびTER119に対する抗体で標識し、例えば、細胞の生存または細胞周期の状態を測定するために、標識された細胞懸濁液をフローサイトメトリーアナライザーを使用して分析し、成熟の異なる段階における特異的赤芽球サブセットを同定する。これらの特異的サブセットは、細胞選別によって精製することができます。その後、赤芽球の成熟サブセットごとに細胞および分子分析を実施してもよい。

特定の成熟段階で赤芽球を新たに分離された造血組織で直接同定する能力は、生理学的皮質の細胞を研究する機会を与えてくれます。したがって、この方法により、さまざまな成熟段階の高赤芽球を研究し、in vivoで応答することができます。マウスが刺激を受けると、赤血球生成クレートが加速します。

たとえば、高地を模倣した低酸素状態や、ホルモンのエリスロポエチンの注射などです。マルチパラメータフローサイトメトリーを使用して、複雑な組織環境内のBLATSを同定すると同時に、それらのシグナル伝達生存と細胞周期の状態を研究します。また、赤芽球の特定の成熟段階を新鮮な組織から直接選別し、その遺伝子発現レベル、クロマチン状態、またはその他の分子機能を調べることもできます。

マウスの決定的赤血球生成は、成体マウスの脾臓と骨髄で起こります。したがって、これらの組織は安楽死させたマウスから採取されます。マウスを安楽死させた後、心臓穿刺によってEDTAまたはヘパリン採血チューブに血液を採取し、この血液は後でヘマトクリット数、網状赤血球数、またはCBC分析に使用されます。

採取した脾臓と大腿骨を、冷間染色剤が入った別々のチューブに入れます。バッファ。必要に応じて、採取したティッシュを氷の上に置いてください。脾臓の重さを量ります。

赤血球生成ストレス反応を受けているマウスは、脾臓の重量の大幅な増加を示す可能性があります。続いて、採取した組織から脾臓細胞および骨髄細胞を、マウス胚で以前に実証された手順により調製する。決定的な赤血球生成は、胎児の肝臓で胚の12.5日目から15.5日目の間に起こります。

妊娠12.5日目から14.5日目に胎児肝細胞を得るために、時限妊娠した雌マウスを調製します。時限妊娠した雌マウスを安楽死させ、子宮の角を氷の入ったシャーレに移します。冷温培地または染色バッファー。

から胚を採取するために、12.5日目以下の胎児の肝臓を解剖するためには、解剖顕微鏡が必要です。まず、各ビーズをホーンから離します。次に、子宮の壁をそっと切除して、羊水嚢内にある胚を放出します。

羊膜をそっと剥がします。胎児の肝臓は、はるかに小さな心臓の下にある最大の赤い腹部組織です。胎児の肝臓を解剖するには、鉗子を使用して肝臓の両側の胚を固定し、肝臓を腹部から培地にそっと押し込みます。

肝臓を新鮮な染色緩衝液の入ったチューブに穏やかに移しました。結局のところ、胎児の肝臓は解剖され、新鮮な染色剤が入ったチューブに移されました。バッファーは、ピペッティングによって肝臓を機械的に解離し、解離した細胞を40ミクロンのナイロンメッシュスクリーンで細胞を2回遠心分離してろ過し、上清を廃棄して染色バッファーに懸濁します。

2回目の洗浄後、細胞をトライアンブルーで染色し、ヘモサイトメーターを使用してカウントします。E 13.5の胎児の肝臓は、約10から7番目です。細胞は、フローサイトメトリー分析のために、200マイクロリットルサンプルあたり10〜6番目の細胞の1〜2倍で細胞を再懸濁します。

このビデオプロトコルの目的上、フローサイトメトリーのための抗体染色は、胎児の肝細胞のみで実証されます。この手順を開始するには、マウス細胞のFC受容体を遮断するための精製ウサギIgG、CD71、FETR、one、19PE、および細胞表面タンパク質を高速に向ける抗体を含む一次抗体染色プレミックスを調製します。チューブを2〜3回反転させて抗体溶液を穏やかに混合し、予め調製した胎児肝細胞サンプルに予め混合した一次抗体染色液200μリットルを加え、ピペットで優しく上下させて細胞を再懸濁します。

次に、これら6つのコントロールセルサンプルを調製します。細胞が細胞の背景自家蛍光を提供するために染色緩衝液に残されている未染色サンプル、各抗体またはプロトコルで使用される色は、チャネル間のスペクトルの重複を補正するためにプロトコルで使用される色で、この実験では、TUR 1 19 PE CD 71 fz高速、ビオチンおよびストレプトアビジンA PCおよび7 A DA蛍光から高速ビオチンの1つのコントロールを引いたものです。 これは、細胞が高速ビオチンを除くプロトコル内のすべての色または抗体で染色されるチャネルの真の背景を提供します。サンプルと関連するコントロールを、氷上で一次抗体染色液中で45分から1時間暗所でインキュベー

インキュベーションの終了時に、各サンプルチューブに3ミリリットルの染色バッファーを加えて細胞を洗浄し、摂氏4度の重力の約400倍で3〜5分間回転させます。次に、連鎖球菌をPCに塗布し、チューブを氷上で30〜45分間インキュベートします。インキュベーションが完了したら、最初の抗体染色と同様に細胞を洗浄します。

最後に、細胞を不透過性の細胞を含む染色液に細胞を再懸濁し、DNA色素7aadを死細胞を除外する。これで、サンプルをフローサイトメトリー分析する準備が整いました。この手順の最も難しい側面は、赤芽球サブセットの信頼性の高い同定を可能にするフローサイトメトリーイベントの正しいゲーティング解析です。

これには、すべての正しいコントロールサンプルを機械で慎重にセットアップし、スペクトルのオーバーラップを慎重に補正し、死細胞、凝集体、非常に小さなイベントを除外するゲート化が必要です。データ分析の開始時。未染色サンプルと単一カラーコントロールサンプルは、各色の組み合わせのスペクトルオーバーラップの補正を設定するために使用されます。

この例では、fit e 蛍光が PE チャネルにどのようにこぼれるか、およびこのスペクトルのオーバーラップが補正後にどのように補正されるかを示します。まず、未染色コントロールを使用して、適合E陽性領域とPE陰性領域を定義します。次に、fit E 単色コントロールを使用して、PE チャネルへのスペクトルの波及を視覚化できます。

FlowJoソフトウェアによるデジタル補正により、PEチャンネルのE信号のスピルオーバーが最小限に抑えられます。一度補償されたデッドセル、凝集体、および小さなイベントを取り除くことができます。集合体とセルのダブレットは、前方散布図の高さと前方散布図の面積をプロットし、狭い対角ゲート内のイベントを選択することで削除します。

死んだ細胞は、dapi A細胞不透過性DNAダイに対して陰性の細胞を選択することによって除去されます。DAPI陰性生存細胞ゲートは、前方散乱が非常に少ない核やデブリなどの非常に小さなイベントも除外します。次に、胎児肝細胞のゲーティング戦略を示します。

新たに採取された細胞を、CD 71、TUR one 19、および非赤血球系譜マーカーに向けられたZI標識抗体のカクテルで標識した。この例では、サンプルはスペクトルのオーバーラップに対してすでに補正されており、凝集体、デッドセル、および非常に小さなイベントを除外するようにゲート化されています。系統陽性のfitzy染色を除くすべての色を含むFMOサンプルを使用して、fitzyヒストグラムをプロットし、系統陰性細胞ゲートを定義し、次にこのゲートをZI標識系統マーカーで染色した胎児肝細胞サンプルに適用します。

系統陰性細胞を選択し、Y 軸上に CD 71 および TER one 19 でプロットします。A 軸では、セルをサブセット S 0 から S 5 に分割する準備が整いました。Lin 枯渇 S ゼロ サブセットには、EPO 依存性の開始前に CFUE 電位を持つ細胞が大部分含まれています。

Sのサブセットには、主に細胞周期のS期にあるEPO依存性のCFUE細胞が含まれています。Sの2つのサブセット細胞はコロニー形成の可能性を失い、ヘモグロビンS3サブセットを発現し始めています主に好塩基性赤芽球S4およびS5サブセットは晩期赤芽球を含んでいます。ここに示されているのは、CD 71およびTER one 19に向けられた抗体で処理および標識された脾臓細胞からのデータ取得、および死受容体の高速ヒストグラムに続く分析戦略です。

1 つは、斜めのゲートが 1 つのセルである可能性が高いイベントを表すすべての取得済みイベントを示します (ダブレットまたはより大きな集計を除く)。このゲートのセルは、ここでヒストグラム2でさらに分析されます。原子核やデブリの可能性が高い非常に小さなイベントは除外されます。

ゲート細胞はヒストグラム3に示されており、膜透過性アポトーシス細胞である可能性が高いDAPI陽性細胞は、さらなる分析から除外されています。ヒストグラム4は、結果として得られる生存可能な脾臓細胞の集団を示しています。pro eGateには、CD 71、高TER1、19、中間セル、tur R 1、19の高セルが含まれており、ヒストグラム5でさらに分析されます。

ここで、CD71高細胞は、成熟度の低い大領域である赤芽球と、より小さく、より成熟したAB赤芽球に細分される。最も成熟した赤芽球サブセットはARI C.細胞表面タンパク質の発現は、TER R one 19およびCD 71と同時に関連する抗体を添加することにより、これらサブセットのそれぞれについて同時に測定することができる。染色ヒストグラム6は、細胞表面の死受容体の発現が速く、特に、基礎状態のマウスおよびE ppoの単回投与を注射したマウスにおけるAサブセットの領域において示している。

その結果、EPOはその領域での迅速な発現を抑制することが示されています。細胞内タンパク質の集団in vivo発現または細胞周期の状態も、各サブセットの細胞について測定できます。この代表的な細胞周期解析では、マウスにBRDUを腹腔内注射し、30〜60分後に骨髄を採取しました。

CD 71およびTER one 19について染色することに加えて、細胞は、サイクルのS期にあるそれらの複製D-N-A-B-R-D-U陽性細胞へのBRDUの組み込みのために染色されました。界面セルはBRDU陰性であり、G1またはG2のM相に分解できます。DNADを使用して、7つのA、A、D細胞を、PRO、E、エリア、A、B、およびA ECの各サブセットから選別してもよい。

ここでは、細胞サイズの減少、核凝縮、およびヘモグロビン発現を反映した褐色の増加を伴う連続的な成熟を示すシトシン調製物で示されています。最後に、E 13.5胎児肝臓におけるS3サブセットの代表的な細胞周期解析をここに示します。妊娠中のマウスにBRDUを注射しました。

胎児の肝臓を30〜60分後に採取し、固定パーメを固定し、CD 71、TER one 19、およびBRDUに対する抗体で染色した。S3細胞の細胞周期状態は、S期細胞がどこにあるかを解析します。BRDU陽性およびDNA含量は、DNA色素7 A a dについて染色することにより定量されます。

私たちが説明するサイトメトリーアプローチにより、細胞表面マーカーや他のタンパク質の発現、フォッソ特異的抗体を使用した細胞生存細胞シグナル伝達、細胞周期の状態などの細胞機能を同時に調査できます。したがって、赤芽球の分子応答、さまざまな刺激に対する異なる成熟段階、または遺伝子変異の影響を調査することができます。フローサイトメトリー成熟サブセットは、細胞表面マーカーの発現と前方散乱の観点から定義されることに注意する必要があります。

一般に、各サブセットの細胞は、さまざまなマウスモデルで同様の形態学的赤芽細胞の段階に対応することがわかりました。ただし、新しいマウスモデルを検討する際には、この点を確認することをお勧めします。各サブセットから細胞を選別し、その形態を調べることにより、各サブセットの細胞をRNAまたはトランスクリプトーム解析のために選別することもできます。ソーティング実験では、細胞への純粋なストレスを最小限に抑えるために、低い選別圧力と広い鼻を使用します。

また、各ソーティング実験後に細胞の純度と生存率を確認することをお勧めします。最後に、特定のサブセットの頻度の変化を検出するときは、それがそのサブセット内のセル数の真の変化によるものなのか、それとも他のサブセットの変更によるものなのかを判断することが重要です。したがって、サブセットの周波数を測定するだけでなく、各サブセットのセルの絶対数も常に測定する必要があります。