CD71/TER119フローサイトメトリーアッセイを用いてマウス赤血球前駆細胞の同定と解析

本実験の全般的な目的は、マウスから採取したばかりの組織内で赤血球前駆細胞を直接的に同定することです。これにより、これらのマウスの造血系が変化している時期における分子特性を研究することが可能になります。例えば、胚発生中や低酸素ストレスへの応答中において、まずマウスの胎児肝臓、または成体脾臓あるいは骨髄から造血組織を分離し、単一細胞懸濁液へと解離させます。

次に、細胞表面マーカーであるCD 71およびTER1-19に対する抗体、およびその他の目的のマーカー（例えば、細胞生存率や細胞周期の状態を測定するためのマーカー）で細胞を標識し、標識した細胞懸濁液をフローサイトメーターで解析して、成熟の異なる段階にある特定の赤芽球サブセットを同定します。これらの特定のサブセットは、セルソートによって精製することが可能です。その後、それぞれの赤芽球成熟サブセットに対して、細胞および分子レベルの解析を行うことができます。

新鮮に分離した造血組織内で、特定の成熟段階にある赤芽球を直接特定できる能力により、生理学的皮質における細胞の研究が可能になります。したがって、この手法を用いることで、異なる成熟段階にある高分化赤芽球のin vivoでの応答を研究することができます。マウスが刺激を受けると、赤血球造血速度が加速します。

例えば、高地を模倣した低酸素状態や、ホルモンであるエリスロポエチンの注入などが挙げられます。私たちはマルチパラメーターフローサイトメトリーを用いて、複雑な組織環境内における赤芽球を同定し、それらの生存シグナル伝達および細胞周期の状態を同時に解析しています。また、新鮮な組織から特定の成熟段階にある赤芽球を直接ソートし、その遺伝子発現レベル、クロマチン状態、またはその他の分子機能を探索することも可能です。

マウスの定常的な赤血球造血は、成体マウスの脾臓および骨髄で行われます。したがって、これらの組織を安楽死させたマウスから採取します。マウスを安楽死させた後、心腔穿刺によりEDTAまたはヘパリン採血管に血液を採取します。この血液は、後のヘマトクリット値の測定、網状赤血球数の測定、またはCBC分析に使用します。

採取した脾臓と大腿骨を、冷えた染色緩衝液を含む別々のチューブに入れます。必要に応じて、採取した組織を氷上で保持してください。脾臓の重量を量ります。

赤血球生成ストレス応答下にあるマウスでは、脾臓重量が大幅に増加する可能性があります。その後、採取した組織から、マウス胚で以前に示された手順に従って脾細胞および骨髄細胞を調製します。定常的な赤血球生成は、胚齢12.5日から15.5日の間に胎児肝臓で起こります。

妊娠12.5日から14.5日の胎児肝細胞を得るため、タイミング調整済みの妊娠マウスを用意します。タイミング調整済みの妊娠マウスを安楽死させ、子宮角を、氷上のペトリ皿（冷やした培養液または染色バッファーを含む）に取り出します。

胚齢12.5日またはそれ以前の胎児肝臓を摘出するためには、子宮から胚を取り出す際に解剖顕微鏡が必要です。まず、それぞれの胚を子宮角から分離します。次に、子宮壁を慎重に切開し、羊膜嚢内の胚を取り出します。

羊膜をそっと剥がします。胎児肝臓は、より小さな心臓の下に位置する、腹部で最大の赤い組織です。胎児肝臓を摘出するには、ピンセットで肝臓の両側から胚を固定し、肝臓を腹部から培地中へと静かに押し出します。

肝臓を新鮮な染色バッファーを含むチューブにゆっくりと移します。すべての胎児肝臓の摘出と新鮮な染色バッファーへの移送が完了した後、ピペッティングによって肝臓を機械的に分散させます。次に、分散させた細胞を40 µmのナイロンメッシュスクリーンでろ過し、遠心分離によって細胞を2回洗浄します。その際、上清を捨て、染色バッファーで再懸濁してください。

2回目の洗浄後、細胞をトリパンブルーで染色し、血球計数計を用いてカウントします。E13.5の胎児肝臓には、約10⁷個の細胞が含まれています。フローサイトメトリー分析用に、1サンプル200 µLあたり1〜2×10⁶個の細胞濃度で細胞を再懸濁します。

本ビデオプロトコルでは、フローサイトメトリー用の抗体染色を胎児肝細胞のみを用いて実演します。まず、マウス細胞のFC受容体をブロッキングするための精製ウサギIgG、CD71 FETR119 PE、および細胞表面タンパク質FASTに対する抗体を含む一次抗体染色用プレミックス液を準備します。チューブを2〜3回反転させて抗体溶液を穏かに混ぜ合わせ、あらかじめ準備した胎児肝細胞サンプルに一次抗体染色用プレミックス液を200 µL加え、ピペッティングで穏やかに細胞を再懸濁させます。

次に、これら6つのコントロール細胞サンプルを準備します。細胞の背景自家蛍光を確認するために染色バッファーに保持した未染色サンプル、各チャネル間のスペクトルの重なりを補正するための、プロトコルで使用する各抗体または色ごとのシングルカラーコントロール（本実験では、TUR one 19 PE CD 71 fz fast、biotin、およびstreptavidin A PC）を用意します。また、fast biotinの真の背景を把握するために、fast biotin以外のすべての色または抗体で細胞を染色したfluorescence minus oneコントロールを用意します。サンプルおよび関連するコントロールを、一次抗体染色液中で氷上に置き、暗所で45分から1時間インキュベートします。

インキュベーション終了後、各サンプルチューブに3 mLの染色バッファーを加えて細胞を洗浄し、4 °Cで約400 ×gで3〜5分間遠心分離します。次に、PCでstrep avidを添加し、チューブを氷上で30〜45分間インキュベートします。インキュベーション完了後、一次抗体染色の時と同様に細胞を洗浄します。

最後に、死細胞を除外するため、細胞膜非透過性のDNA染色剤であるseven a a dを含む染色液で細胞を再懸濁します。これで、サンプルをフローサイトメトリーで解析する準備が整いました。この手順で最も困難な点は、赤芽球サブセットを確実に同定するための、フローサイトメトリーにおけるイベントの正確なゲーティング解析です。

正確なコントロールサンプルの用意を含む慎重な装置のセットアップ、スペクトルオーバーラップに対する精緻な補正、および死細胞、凝集物、非常に小さなイベントを除外するためのその後のゲーティングが必要です。データ解析の開始時に、未染色サンプルと単色コントロールサンプルを用いて、各色の組み合わせに対するスペクトルオーバーラップの補正を設定します。

この例では、FITCの蛍光がPEチャネルにどのように漏れ込むか、また、補正後にこのスペクトルの重なりがどのように修正されるかを示します。まず、未染色コントロールを用いて、FITC陽性かつPE陰性の領域を定義します。次に、FITC単色コントロールを用いて、PEチャネルへのスペクトルスピルオーバーを可視化します。

FlowJoソフトウェアを用いてデジタル補正を行うことで、PEチャンネルにおけるspillover fit E信号を最小化します。補正後、死細胞、凝集塊、および小さなイベントを除去することができます。凝集塊および細胞のダブレットは、前方散乱光（FSC）のHeight（高さ）に対してArea（面積）をプロットし、狭い対角線上のゲート内にあるイベントを選択することで除去します。

DAPI（細胞膜非透過性DNA染色試薬）陰性の細胞を選択することで、死細胞を除去します。DAPI陰性の生存細胞ゲートでは、前方散乱光が非常に低い核やデブリなどの極小イベントも除外されます。次に、胎児肝細胞のゲーティング戦略について説明します。

採取したばかりの細胞をCD 71 TUR one 19、および非赤血球系マーカーに対するZI標識抗体カクテルで標識しました。この例では、サンプルはすでにスペクトルの重複について補正されており、凝集細胞、死細胞、および極めて小さなイベントを除外するためにゲーティングされています。系統陽性fitzy染色以外のすべての色を含むFMOサンプルを使用してfitzyヒストグラムをプロットし、系統陰性細胞のゲートを定義します。次に、このゲートをZI結合系統マーカーで染色した胎児肝細胞サンプルに適用します。

リネージュ陰性細胞を選別し、Y軸にCD 71、X軸にTER1-9を用いてプロットします。これにより、細胞をS0からS5までのサブセットに分ける準備が整います。リネージュ除去後のS0サブセットには、主にEPO依存性が生じる前のCFUE能を持つ細胞が含まれています。

S1サブセットには、主に細胞周期のS期にあるEPO依存性CFUE細胞が含まれます。S2サブセットの細胞はコロニー形成能を喪失し、ヘモグロビンの発現を開始しています。S3サブセットの細胞は主に好塩基性赤芽球であり、S4およびS5サブセットには後期赤芽球が含まれます。ここでは、CD71およびTER119に対する抗体、ならびにデスレセプターで処理および標識された脾細胞からのデータ取得後の解析戦略とヒストグラムを示します。

一方は、取得したすべてのイベントを示しており、そこでの対角ゲートは、ダブレットやそれ以上の凝集塊を除いた、単一細胞である可能性の高いイベントを表しています。このゲート内の細胞について、ここにあるヒストグラム2でさらに解析を行います。核やデブリである可能性が高い非常に小さなイベントは除外されます。

ゲート後の細胞はヒストグラム3に示されており、ここでは膜透過性の高いアポトーシス細胞である可能性が高いDAPI陽性細胞が、以降の解析から除外されています。ヒストグラム4は、その結果得られた生存脾細胞の集団を示しています。pro eGateにはCD 71 high TER one 19 Intermediate細胞が含まれており、tur R one 19 high細胞がヒストグラム5でさらに解析されています。

ここでは、CD 71高発現細胞を、より未熟でサイズが大きいA前赤芽球と、より成熟してサイズの小さいB前赤芽球に細分しています。最も成熟した前赤芽球サブセットはCです。TER 19およびCD 71と同時に適切な抗体を添加することで、これらの各サブセットにおける細胞表面タンパク質の発現を同時に測定できます。染色ヒストグラム6は、基底状態のマウスおよびEpoを単回投与したマウスにおける、特にAサブセットでのデスレセプターFasの細胞表面発現を示しています。

結果は、EPOが当該領域における速い発現を抑制することを示しています。また、各サブセットの細胞について、細胞内タンパク質のin vivo発現量または細胞周期の状態を測定することも可能です。この代表的な細胞周期解析では、マウスにBRDUを腹腔内投与し、30〜60分後に骨髄を採取しました。

CD71およびTERT19の染色に加えて、複製中のDNAへのBRDUの取り込みについて細胞を染色しました。BRDU陽性細胞は細胞周期のS期にあります。間期細胞はBRDU陰性であり、G1期またはG2/M期に分けることができます。DNA7-AADを用いることで、PRO、E、A、BおよびAECの各サブセットから細胞を分取することが可能です。

ここでは、細胞サイズの減少、核の凝縮、およびヘモグロビン発現を反映した褐色の増加を伴う段階的な成熟を示すサイトシン製剤での様子が示されています。最後に、E 13.5胎児肝臓におけるS3サブセットの代表的な細胞周期解析をここに示します。妊娠マウスにBRDUを注射しました。

胎児肝臓を採取し、30〜60分後に固定、透過処理を行い、CD71、TER1-19、およびBRDUに対する抗体で染色しました。S3細胞の細胞周期の状態を解析し、S期細胞をBRDU陽性として定義し、DNA染料7-AADによる染色でDNA量を定量しました。

本稿で述べるサイトメトリーによるアプローチでは、細胞表面マーカーやその他のタンパク質の発現、細胞生存、特異的抗体を用いた細胞シグナル伝達、および細胞周期の状態といった細胞機能を同時に解析することが可能です。これにより、異なる成熟段階にある赤芽球の広範な刺激に対する分子応答や、遺伝子変異の影響を調査することができます。なお、フローサイトメトリーによる成熟サブセットは、細胞表面マーカーの発現と前方散乱光に基づいて定義されることに留意してください。

一般的に、各サブセットの細胞は、幅広いマウスモデルにおいて同様の形態学的赤芽球段階に対応していることがわかりました。ただし、新しいマウスモデルを検討する際には、これを検証することを推奨します。各サブセットから細胞を分取し、その形態を観察することで検証可能です。また、各サブセットの細胞を分取してRNA解析やトランスクリプトーム解析に用いることもできます。分取実験では、細胞への剪断ストレスを最小限に抑えるため、低い分取圧と広いノズル幅を使用してください。

また、各ソート実験後に細胞の純度と生存率を確認することを推奨します。最後に、特定のサブセットの頻度に変化が検出された場合、それがそのサブセット内の細胞数の真の変化によるものか、あるいは他のサブセットの変化によるものかを判断することが重要です。したがって、サブセットの頻度を測定することに加えて、各サブセットの細胞の絶対数を常に測定する必要があります。