Name: 鳥類胚のモデルを使用して、がんの転移の定量的解析 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-05-30T22:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 40 s
Description: 学ぶ 鳥類胚の尿嚢膜（CAM）モデルを用いたヒトがん細胞の転移能の定量的評価法。PCRによる解析で転移動態を測定し、がん生物学研究に応用する。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

我々は寛大に受精卵を提供するためのタイソンフーズ社を認識したい。シャナアーノルドは、このプロトコルの撮影の間に尽力した。 Trenisパーマーは、ルースL.キルシュシュタイン国立リサーチサービス賞（F31国立がん研究所）の下に国立衛生研究所によってサポートされていました。この作品は、部分的にJDLとNIH / NCIの助成金＃CA120711 - 01A1とCA120711 - 01A1にAZにCCSRIグラント＃700537によってサポートされていました。

1。 xenograftingために卵を準備する（自然転移） <ol><li>たての敷設受精鶏卵は100 ° F、60％の湿度で10日間回転インキュベーター中でインキュベートする。卵を4回、各時間を回転している。 </li><li>発達10日目に卵は卵のラックに彼らの側に配置されます。ガチョウの首のランプまたは他の適切な光源がairsacが配置されている卵の鈍端に卵の殻の中に光を照らすことによってキャンドル卵をするために使用されます。 </li><li>漿尿静脈が位置し、マークされます。この静脈は、それはいくつかの大きな血管の接合である卵殻の最上部に位置しています。この分岐点で血管がCAMから離れて、低下し、胚に取り付けます。 1センチメートル四角いボックスは、静脈の分岐点から約1cm離れて卵の殻に鉛筆で描かれています。と広場の周りを含むエリアは、ヨウ素に浸した綿棒を使用して洗浄される。 </li><li>シリコンカーバイド砥石（ドレメルの一部＃84922）穴を装備した回転切削工具（ドレメル）を使用することは気嚢に卵の鈍端貫通されています。この同じツールを使用して穴が卵殻膜の短い停止、卵の上に以前に描かれた正方形の中に掘削されている。最後に微細ないが、25ゲージの注射針は、基礎となるCAMを引き裂くように注意して卵殻膜に小さな穴を作るために使用されます。 CAMは、その後airsacの穴に対して置か¼"タイゴンチューブの部分を装着した自動ピペットエイドで作成された穏やかな吸引を用いて正方形の面積の卵殻膜から切り離される。吸引を適用する際に、エアポケットは、角の穴の下にCAMが正常に卵殻から削除されていることを示す必要があります。 CAMが削除された後は、気嚢と漿尿静脈に近い広場に位置する穴の穴は、テープの実験室でのテープの切れ端で封止されている。卵は、その後、腫瘍細胞を移植するのを見越して100 ° F、60％の湿度で静止インキュベーター内に配置されています。シーケンシャル描写するための図1を参照してください。 </li></ol> 2。静脈内注射（実験的転移）のために卵の準備<ol><li>たての敷設受精鶏卵は100 ° F、60％の湿度で12日間の回転インキュベーター中でインキュベートする。卵を4回、各時間を回転している。 </li><li>発達の日の12卵は卵のラックに彼らの側に配置されます。ガチョウの首のランプまたは他の適切な光源がairsacが配置されている卵の鈍端に卵の殻の中に光を照らすことによってキャンドル卵をするために使用されます。 </li><li>漿尿静脈が位置し、マークされます。 0.5センチメートルの長方形で1センチメートルが直接静脈上記の卵の殻に鉛筆で描かれています。と広場の周りを含むエリアは、ヨウ素に浸した綿棒を使用して洗浄される。 </li><li>小さなウィンドウがDremmelのドリルビット（＃118）を使用して描画場所で卵の殻に作成されます。ウィンドウは、その後、ミネラルオイルの低下と透明度でレンダリングされる、基になる卵殻膜を露出するために削除されます。グラフィカル用図5aを参照してください。 </li><li>この時点で、気嚢と漿尿静脈に近い広場に位置する穴の穴は、テープの実験室でのテープの切れ端で封止されている。卵は、その後、腫瘍細胞を注入するのを見越して100 ° F、60％の湿度で静止インキュベーター内に配置されています。 </li></ol> 3。移植または注入のために腫瘍細胞を準備する。 <ol><li> xenograftingの場合は、腫瘍細胞は、トリプシン/ EDTAを使用して培養皿からから切り離されているとリン酸の10倍量で洗浄し、残ったメディア、トリプシン、またはEDTAを除去するために緩衝食塩水（PBS）。 </li><li> IV注射の場合は、培養細胞は非酵素的細胞解離液を用いて分離される、および無血清DMEMで洗浄した。と） </li><li>細胞は血球計でカウントし、移植のために10から40000000細胞/ mlでPBSに再懸濁し、あるいは静脈注射の場合は1万細胞/ mlになるように無血清DMEMに再懸濁する。 </li></ol> 4。新たに露出したCAM（自然転移）に腫瘍細胞を移植<ol><li>卵はインキュベーターから削除され、小さなウィンドウが新しい空気のポケットが形成され、以前に描かれた四角の場所にカットされます。これは最も簡単にカッティングホイール（＃409円形の切断ホイールでドレメルツール）を装備した回転工具を使って行われます。ニードルノーズピンセットは、卵殻の小さなセクションを除去し、配下のCAMを公開するために使用されます。 </li><li>綿棒を（フィッシャーブランド＃23-400-001）を使用してCAMは、5回を摩耗されています。少し血は綿に明らかであろう。すぐにCAMを損傷した後、細胞懸濁液の25μlのは、損傷した領域に配置されます。細胞の最適な数が決定される電子です。mpiricallyが0.5 × 10 5〜1 × 10 6の範囲で指定できます。卵の窓をテープでしっかりと密封され、雛は細胞が沈殿することを可能にするために10〜15分放置されています。 15分後に卵が静止インキュベーターに戻されます。 </li><li>腫瘍は、特定のアプリケーションと使用する腫瘍細胞株の性質に応じて5-8日のために拡張されます。シーケンシャル描写するための図1を参照してください。 </li></ol> 5。腫瘍細胞の静脈内注射（実験的転移） <ol><li>細胞懸濁液の30ゲージのインスリンシリンジ100μLの使用は、各胚の尿膜静脈に注入され、卵が静止インキュベーターに戻し、追加の1-7日のためにそこに残った。 </li><li>異なる時点で、肺または下CAMは、それぞれの胚から採取されると下記のように、腫瘍細胞の検出のために処理した。 </li></ol> 6。収穫腫瘍とひよこの組織<ol><li>解剖領域が用意されています。アッセイは高感度PCR法を用いてヒトのDNAを定量することにより転移性細胞を検出します。それは、外来DNAの混入を防止することが非常に重要です。解剖は、専用エリアで行われ、解剖を通してのツールは、それぞれの動物の間にクリーンアップされます。解剖の過程で、サンプルのクロスコンタミネーションを防止するために、ツールの3つの別個のセットが使用されています：卵を切断するための一組、一次腫瘍を除去するための一組と内臓を除去するための一組を。また、4つの洗浄容器は、各動物betweenツールのすすぎシーケンシャルに使用されます。シーケンスにこれらの洗浄は次のとおりである：1）蒸留水、2）蒸留水、3）塩素系漂白剤、及び4）70％エタノール。 </li><li>卵は、静止インキュベーターから除去し、動物を麻酔し、安楽死させる15分間氷上に配置されます。ウィンドウは、腫瘍が見えてくるように開かれます。卵殻の一部を除去することにより大きなウィンドウを開くと、必要な場合があります。原発性腫瘍は、CAMから切除秤量し、組織学のために処理されます。 </li><li>ひよこは等しい半分に放射状に殻をカットすることで卵殻から削除されます。胚は、カットのシェルからデカントし、クリーンアップ重量ボートの胸の側に転送されます。動物は、ツールの新鮮な、きれいなセットを使用して切開されています。動物は、胸骨を切開によって開かれます。胚が開いたら、右または左葉から肝の部分が収集されます。内部器官はその後砂嚢に接続されている食道を軽く引っ張り、臓器を接続viseraを切断して除去される。肺がカット収集するためには胸郭は胸のプレートが分離されていると心が削除される開かれます。この時点では、肺の四辺の周囲にカットすることが可能です（ヘッドに最も近い上部胸郭、気管に沿って横隔膜と右側の近く下部に沿って左側）。一貫性を保つため、同じ肺は各動物で収集されます。収穫された組織サンプルは、後で使用するために-20℃で保存されている、またはDNAの分離のためにすぐに処理することができます。 </li></ol> 7。ゲノムDNAの分離および定量的PCR解析<ol><li>ゲノムDNAは、SYBRグリーンエキス- N - Ampの組織PCRキット（Sigma - Aldrich社カタログ＃XNATRG）を使用して、組織から抽出されます。抽出されたDNAは、きれいなエッペンドルフチュー​​ブに移し、-20℃で保存するか、すぐに使用することができます。その後のPCR反応で使用する前にヌクレアーゼフリー水でDNAを1:50に希釈することが重要です。また、DNAは標準的なDNA抽出プロトコール（ザイルストラら 、2002）の任意の数を使用して抽出することができます。 </li><li>人間のDNAをヒトのALUシーケンスのための定量的PCRの特定を使用して、ニワトリ組織で検出される。 ALU -特異的プライマーを用いた定量的PCRをExract - N - AmpのキットからSYBRグリーン増幅を使用して実行されます。 PCRキットは、SYBRグリーン、バッファー、塩のdNTPs、TaqポリメラーゼおよびJumpStart Taq抗体を含む2倍の反応ミックスが付属しています。反応ミックスは、各プライマーの0.4μMで、15μlの最終容量で構成されています。 1:50に希釈抽出したDNAを使用するほとんどのインスタンスは、定量的なデータを提供するために、しかし、テンプレートDNAの最適量は経験的に最適化する必要があります。ニワトリGAPDHのプライマーは、PCRがALUの配列について以下の条件の下で実行される内部コントロールとして使用されています：95℃ポリメラーゼの活性化95℃30サイクルで2分間のC℃で30秒、63℃の30秒30秒のため、72 ° CチキンGAPDHの反応条件は、ALUのために説明したものと同一であるしかしそれは、40サイクルのPCRを拡張する必要があるかもしれません。 </li><li>転移の定量分析は、（SchmittgenとLivak、2008対照群と実験群を比較するΔΔCT法を使用して実行されます。ザイルストラら 、2。002）。あるいは、標準曲線は、エキス- N -アンプキット（ザイルストラら 、2002）を用いて抽出されたヒト腫瘍細胞の希釈系列を使用して生成することができます。統計学的有意差はStudentのt検定または対照群と実験群の分散分析を用いて評価されます。 </li></ol> 8。代表的な結果： <img src="/files/ftp_upload/2815/2815fig1.jpg" alt="図1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図1"> 図1。ニワトリ胚転移モデル。重要なステップの断面のモデルの外観を示すA）4つのパネルの図：1。インキュベーションの10日後。 CAMは、ほぼ最大サイズに達しました。動脈と静脈は、卵の上にリフト尿膜静脈とはっきりと表示されます。 2。すぐに卵の殻に2つの穴を掘削後の卵：airsacに1つ、尿膜静脈の接続点に隣接する1。 3。軽度の真空後の外観は、airsacを避難し、CAMを削除するために使用されています。腫瘍細胞（青）がドロップされたCAMに適用されます。 4。接木腫瘍細胞が成長させた後、ニワトリ胚からの組織とともに腫瘍を分析用に採取されるB）モデルのシリアル描写：1。卵をインキュベートする。2。尿膜静脈の位置をマーキング。、3。卵殻に穴をあける。4。 CAMを削除。、5。移植腫瘍細胞。、6の開口部を切断。腫瘍細胞を適用する。、7。組織を収集する前に氷の上に卵を冷却する。、8。成長の7日後に腫瘍を収穫。 <img src="/files/ftp_upload/2815/2815fig2.jpg" alt="図2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図2"> 図2。CAMの腫瘍の組織学。担癌漿尿膜から採取した組織はホルマリン、切片で固定し、トリクローム染色で処理した。 CAM上の成長の7日後A）HEp3腫瘍。 BとCが示す腫瘍と間質の両方から拡大された領域を示しています。 D）法線CAM。 <img src="/files/ftp_upload/2815/2815fig3.jpg" alt="図3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図3"> 図3。転移の定量的な縦分析 。ハイまたはロー転移能（HEp3 M（高）と、それぞれHEp3 M（低））と頭頸部癌HEp3のためのバリアントはアルミPCRを使用して発信する能力について分析した。 10匹は7日間の期間中、各時点で分析した。これらのサンプルは標準曲線に対して定量化し、続いて＃組織をcells/50mgとして表した。 <img src="/files/ftp_upload/2815/2815fig4.jpg" alt="図4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図4"> 図4。転移を阻害する抗体1A5で処理した動物の自然転移細胞の抑制 。腫瘍は日- 10胚のCAMに適用される5 × 5 HEp3細胞を用いて形成した。 half動物は抗CD151抗体1A5で処理した腫瘍細胞を適用した3日後。腫瘍を有する動物からの肺は、二日後に採取し、定量的リアルタイムALU PCRを行った。逆にchGAPDHの定量的リアルタイムPCRは、宿主のゲノムDNA（ΔΔCT法を定量的に二つのグループ（B）を比較するために使用されたのと同等の量の存在を確認するために使用されていました。 <img src="/files/ftp_upload/2815/2815fig5.jpg" alt="図5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図5"> 図5。転移カスケードで逮捕、成長、および脈管内への評価 。逮捕、成長率、および管内の速度：基本的に、二次臓器への転移は、三つの側面の貢献によって定義されます。これらは、実験的転移（）と自然転移（B）の組み合わせを用いて定量することができます。実験的転移（）セルの数が2時間後の注射を検出したとして逮捕が定義されているを使用する。逮捕された細胞の生存と成長は、細胞数24注射後の変化として決定されます。成長は日3月7日の間に増殖の速度として定義されています。管内は、（B）数intravasated細胞は、6日目に転移性の負担の現在の成長が予測値を超えると7日目に転移性の負担の存在として定義されている自然転移を用いて決定されます。 <img src="/files/ftp_upload/2815/2815fig6.jpg" alt="図6" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図6"> 図6。 CAMでの転移の可視化拡大 。 GFPを発現するHEp3細胞は、発達12日目に静脈内注射した。 1日目、3日と5日に卵を屠殺され、CAMのセクションは、蛍光実体顕微鏡で画像化した。濃い緑色の背景には卵の殻によって作成され、血管系は黒線で表示されており、腫瘍細胞は、明るい緑色の斑点として表示されます。

<ol><li>Ghiso, A. guirre, Kovalski, J. A., K,, Ossowski, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+dormancy+induced+by+downregulation+of+urokinase+receptor+in+human+carcinoma+involves+integrin+and+MAPK+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Tumor dormancy induced by downregulation of urokinase receptor in human carcinoma involves integrin and MAPK signaling.</a> J Cell Biol. 147, 89-104 (1999).</li>
<li>Chambers, A. F., Shafir, R., Ling, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+model+system+for+studying+metastasis+using+the+embryonic+chick%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+research%22%5BJournal%5D)">A model system for studying metastasis using the embryonic chick.</a> Cancer research. 42, 4018-4025 (1982).</li>
<li>Chambers, A. F., Wilson, S. M., Tuck, A. B., Denhardt, G. H., Cairncross, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+metastatic+properties+of+a+variety+of+mouse%2C+rat%2C+and+human+cells+in+assays+in+nude+mice+and+chick+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vivo%22%5BJournal%5D)">Comparison of metastatic properties of a variety of mouse, rat, and human cells in assays in nude mice and chick embryos.</a> In Vivo. 4, 215-219 (1990).</li>
<li>Deryugina, E. I., Zijlstra, A., Partridge, J. J., Kupriyanova, T. A., Madsen, M. A., Papagiannakopoulos, T., Quigley, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unexpected+effect+of+matrix+metalloproteinase+down-regulation+on+vascular+intravasation+and+metastasis+of+human+fibrosarcoma+cells+selected+in+vivo+for+high+rates+of+dissemination%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Unexpected effect of matrix metalloproteinase down-regulation on vascular intravasation and metastasis of human fibrosarcoma cells selected in vivo for high rates of dissemination.</a> Cancer Res. 65, 10959-10969 (2005).</li>
<li>Hahn-Dantona, E., Ramos-DeSimone, N., Sipley, J., Nagase, H., French, D. L., Quigley, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+proMMP-9+by+a+plasmin%2FMMP-3+cascade+in+a+tumor+cell+model.+Regulation+by+tissue+inhibitors+of+metalloproteinases%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+N+Y+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Activation of proMMP-9 by a plasmin/MMP-3 cascade in a tumor cell model. Regulation by tissue inhibitors of metalloproteinases.</a> Ann N Y Acad Sci. 878, 372-387 (1999).</li>
<li>Kim, J., Yu, W., Kovalski, K., Ossowski, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Requirement+for+specific+proteases+in+cancer+cell+intravasation+as+revealed+by+a+novel+semiquantitative+PCR-based+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Requirement for specific proteases in cancer cell intravasation as revealed by a novel semiquantitative PCR-based assay.</a> Cell. 94, 353-362 (1998).</li>
<li>Leong, H. S., Steinmetz, N. F., Ablack, A., Destito, G., Zijlstra, A., Stuhlmann, H., Manchester, M., Lewis, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+imaging+of+embryonic+and+tumor+neovasculature+using+viral+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Intravital imaging of embryonic and tumor neovasculature using viral nanoparticles.</a> Nat Protoc. 5, 1406-1417 (2010).</li>
<li>Lewis, J. D., Destito, G., Zijlstra, A., Gonzalez, M. J., Quigley, J. P., Manchester, M., Stuhlmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viral+nanoparticles+as+tools+for+intravital+vascular+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Viral nanoparticles as tools for intravital vascular imaging.</a> Nat Med. 12, 354-360 (2006).</li>
<li>Ossowski, L., Reich, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+malignant+phenotype+of+a+human+carcinoma+conditioned+by+growth+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Changes in malignant phenotype of a human carcinoma conditioned by growth environment.</a> Cell. 33, 323-333 (1983).</li>
<li>Schmittgen, T. D., Livak, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analyzing+real-time+PCR+data+by+the+comparative+C%28T%29+method%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Analyzing real-time PCR data by the comparative C(T) method.</a> Nat Protoc. 3, 1101-1108 (2008).</li>
<li>Testa, J. E., Brooks, P. C., Lin, J. M., Quigley, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eukaryotic+expression+cloning+with+an+antimetastatic+monoclonal+antibody+identifies+a+tetraspanin+%28PETA-3%2FCD151%29+as+an+effector+of+human+tumor+cell+migration+and+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Eukaryotic expression cloning with an antimetastatic monoclonal antibody identifies a tetraspanin (PETA-3/CD151) as an effector of human tumor cell migration and metastasis.</a> Cancer Res. 59, 3812-3820 (1999).</li>
<li>Zijlstra, A., Lewis, J., Degryse, B., Stuhlmann, H., Quigley, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Inhibition+of+Tumor+Cell+Intravasation+and+Subsequent+Metastasis+via+Regulation+of+In+Vivo+Tumor+Cell+Motility+by+the+Tetraspanin+CD151%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">The Inhibition of Tumor Cell Intravasation and Subsequent Metastasis via Regulation of In Vivo Tumor Cell Motility by the Tetraspanin CD151.</a> Cancer Cell. 13, 221-234 (2008).</li>
<li>Zijlstra, A., Mellor, R., Panzarella, G., Aimes, R. T., Hooper, J. D., Marchenko, N. D., Quigley, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+quantitative+analysis+of+rate-limiting+steps+in+the+metastatic+cascade+using+human-specific+real-time+polymerase+chain+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">A quantitative analysis of rate-limiting steps in the metastatic cascade using human-specific real-time polymerase chain reaction.</a> Cancer Res. 62, 7083-7092 (2002).</li>
</ol>

利害の衝突は宣言されません。

ひよこCAMは、癌の生物学および転移性の進行のさまざまな側面を研究するモデル系として何十年も使用されています。転移能力の原則の評価休眠の分析を含むグループの様々なことで、このモデルで実行されている（アギーレGhiso ら 、1999;。オソウスキと帝国、1983）、組織のリモデリング（Deryugina ら 、2005;。ハーンDantona ら 、1999）、および転移（ザイルストラら 、2008;。。ザイルストラら 、2002）。。それがため、その使いやすさ、異種移植片を受け入れるためにその能力の癌の生物学にとって非常に魅力的なモデルであり続け、そしてその低コスト（Chambers ら 、1982;。Chambers ら 、1990。）。人間固有のアルミベースの定量的PCR（。。Kim ら 、1998;ザイルストラら 、2002）を使用して我々はヒトcpidermoid癌細胞株HEp3の転移性播種（図3）を分析する能力を実証する。さらに、我々は転移抑制抗体1A5を使用して治...

<table border="1"><tbody><tr><th>試薬の名前</th><th>会社</th><th>カタログ番号</th><th>コメント（省略可能） </th></tr><tr><td> 1Xダルベッコ改変イーグル培地（DMEM） </td><td>インビトロジェン</td><td> 11995073 </td><td></td></tr><tr><td>ダルベッコのリン酸緩衝食塩水（D - PBS）（1X）、液体</td><td>インビトロジェン</td><td> 14190250 </td><td> pH7.4の</td></tr><tr><td> EDTA 4NA、液体とトリプシン、0.05％（1X） </td><td>インビトロジェン</td><td> 25300054 </td><td></td></tr><tr><td>スポーツマンハッチャー</td><td>ベリーヒル</td><td> 1550HA </td><td rowspan="2">これらのインキュベータは、最も容易に利用可能の一部です。しかし、ビデオは別の機器が表示されます。 </td></tr><tr><td>スポーツマンインキュベーター</td><td>ベリーヒル</td><td> 1502EA </td><td></td></tr><tr><td>ドレメルロータリーツール</td><td>ドレメル</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ドレメルのカットオフホイールありません。 36 </td><td>ドレメル</td><td> 409 </td><td></td></tr><tr><td>ポータブルピペットエイド</td><td>フィッシャー</td><td> 1368115E </td><td></td></tr><tr><td>綿は、アプリケーターのチップソー</td><td>フィッシャー</td><td> 23-400-001） </td><td></td></tr><tr><td>受精卵</td><td>様々な</td><td></td><td>多くの異なるベンダーを使用することができます。卵は約35〜55グラムにする必要があります。それらは年齢36〜55週になるはず産む鶏。 </td></tr><tr><td>血球計</td><td> Hausserサイエンティフィック、VWR </td><td> 15170-090 </td><td></td></tr><tr><td>光ファイバ顕微鏡の照明</td><td> Amscope </td><td> HL250 - AY </td><td> 150W </td></tr><tr><td> 25ゲージの針</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> SYBRグリーンエキス- N - Ampの組織PCRキット</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> XNATRG </td><td></td></tr></tbody></table>

鳥類胚のモデルを使用して、がんの転移の定量的解析

Quantitative Analysis of Cancer Metastasis using an Avian Embryo Model

転移癌細胞が原発腫瘍から発信時には、周囲の組織に侵入し、遠隔臓器に転移する。転移は、多くの組織の種類、スパン可変の期間を含む、しばしばそれが困難な調査と定量化すること、臓器の深部に発生する可能性がある複雑なプロセスです。さらに、転移プロセスの有効性は、それが困難な腫瘍細胞の挙動の一つの側面の寄与を評価すること転移カスケードに複数のステップに影響されます。結果として、転移アッセイは頻繁に転移を研究するために、必ずしも現実的なコンテキストを提供するために、実験動物で行われます。残念ながら、これらのモデルは、彼らの複雑な生理機能によってさらに複雑です。ニワトリ胚の漿尿膜（CAM）、腫瘍細胞のxenograftingに受け入れている卵の殻の下にある血管に富んだ超胚組織のアクセシビリティのために、転移を研究するために多くの制限を克服する生体モデル内で一意です。 （図1）。また、ニワトリ胚は自然に免疫不全であるため、CAMは簡単に正常細胞と腫瘍の両方の組織の生着をサポートしています。最も重要なことは、鳥類のCAMは、正常に増殖、浸潤、血管新生、および微小環境の改造を含め、ほとんどのがん細胞の特性をサポートしています。これは、癌の転移につながると新たな潜在的な治療への転移性癌の応答を予測するために経路の調査のためのモデルは非常に便利です。種特異的アルバリPCRによる播種細胞の検出は、定量的に25セルのように少数で保菌している臓器に転移を評価することが可能になります。ヒト類表皮癌細胞株（HEp3）を使用して我々は、ニワトリの肝臓、肺など遠くの臓器にがん細胞の自然転移を分析するためにこのモデルを使用してください。また、ALU - PCRのプロトコルを使用して我々は、転移の個々の要素として管内、逮捕、血管外漏出、および植民地化を分析し、定量するためのツールと​​して、アッセイの感度と再現性を示しています。

定量的PCRを用いて、我々は十分に確立されたニワトリCAMモデルは定量的に遠隔臓器へのヒト腫瘍細胞の転移を分析するために使用できる方法を示します。

転移の間、がん細胞は原発腫瘍から離脱し、周囲の組織に浸潤し、遠隔臓器へと広がります。転移は複雑な...

本手順の全体的な目的は、絨毛尿膜（CAM）を異種移植モデルとして使用し、がん細胞の転移能を定量的に評価することです。まず、受精卵をCAMが成熟するまで培養します。次に、腫瘍細胞をCAMに静脈内注入、または局所的に異種移植します。実験的に定義された時間間隔の後、組織を回収して分析し、ヒト特異的PCRを用いてヒトアレル配列による転移量を定量して結果を解析します。私はトレント・パルマーです。アンドレ・ジルストラ博士の研究室の大学院生です。私は異種移植および自然転移モデルについて実演します。一方、指導教官のZilstra博士は、静脈内投与および実験的転移モデルについて実演します。既存のモデルに対するこの手法の主な利点は、実験者が定量的研究を迅速かつ容易に行える点にあります。ヒト腫瘍細胞の転移を研究する場合、実験者は約120匹の動物を用いて、2週間という短期間でプロトコルの開始から完了までを行うことができます。鶏胚はアクセスが容易であり、操作もしやすいため、このシステムは他のin ovoアプリケーションへ容易に拡張できます。我々は過去数年間にわたってこれを実現しており、それらは別のJoVEバーティカルの主題となっています。産みたての受精鶏卵を、1時間に4回転卵する回転式インキュベーターで10日間 incubation します。10日目に、卵をエッグラックの上で横向きにし、気室がある卵の鈍端側から卵殻に向けて強い直接光を照射します。ここで、胚血管の分岐点を確認します。卵を長軸方向に20度以内で回転させることで、最も容易に特定できます。血管が殻から離れる点を可視化するため、心静脈の分枝点から1 cm離れた位置に、1 cm四方の正方形を描きます。次に、ヨウ素を浸した綿棒で正方形の周囲を清浄します。シリコンカーバイド砥石を装着したドレメルを使用し、まず卵の鈍端から気室に向かって穴を開け、次に正方形の内部に、卵殻膜の手前で止めるようにして穴を開けます。次に、先端に細いバーがついた25ゲージの針を慎重に使用し、卵殻膜を後方に引き剥がします。正しく行えば、下層のcamが裂けることなく、下層の膜からcamを分離させることができます。1/4インチのTigonチューブを装着した自動ピペットエイドを使用してください。気室の穴に緩やかな吸引をかけ、正方形の下にエアポケットができていることを確認し、成功したか判断します。卵殻膜の破砕中にカムが損傷した場合、カムは明らかに落下しません。卵を回転させて気室を吸引すると、殻のすぐ下に見える空気が、損傷したカムの中および下に引き込まれます。カムが脱落した後の卵は使用できません。2つの穴をラボテープで塞ぎ、卵を定置式インキュベーターに戻します。これで卵は異種移植が可能な状態になります。まず、キセノグラフト用の腫瘍細胞を調製します。最初に、trypsin EDTAを用いて培養皿から細胞を剥離させます。次に、ヘモサイトメーターで細胞密度を測定し、PBSを用いて1 mLあたり10〜40 million cellsの濃度で再懸濁して、細胞の調製を完了させます。フードとドレメルツールをエタノールで滅菌した後、インキュベーターから卵を取り出します。卵殻の上部に窓を開け、綿棒を使用して、損傷部位を5回軽く擦ります。綿棒にわずかに血液が付着していることが確認できれば十分です。直ちに、10万から100万個の細胞を含む細胞懸濁液 25 µL を注入してください。次に、ウィンドウをラボテープで密封し、細胞を10〜15分間静置させます。15分後、卵を定温インキュベーターに戻し、腫瘍を5〜8日間成長させます。セクション2で示した方法と同じインキュベーションを用いて、12日目の卵を回収します。卵を光源の前に置き、脈管（corry veinおよびtoic vein）を確認し、その脈管の直上に印を付けます。1 cm × 0.5 cmの枠線を描き、ヨードに浸した綿棒でその領域をきれいに拭きます。次に、ドリルビットを取り付けたドレメル（dremel）を使用して、長方形の範囲に卵殻の小さな窓を開けます。卵殻の窓を慎重に取り除き、下層の膜を露出させます。露出した膜にミネラルオイルを1滴滴下し、透明にします。インキュベーターから卵を取り出し、30ゲージのインスリン注射針を使用します。各胚のauic静脈に細胞懸濁液100 µLを注入します。次に、露出した膜の上にラボ用テープを貼り、卵を静止インキュベーターに戻して1〜7日間保持します。次節で説明するように、腫瘍細胞を検出するために肺または下腔を採取します。この手順のステップは、解剖専用のエリアで、DNAとの接触機会を極限まで排除した状態で実行することが不可欠です。サンプルの相互汚染を防ぐため、解剖の開始前および解剖の間には、卵の切断用、原発腫瘍の摘出用、および内臓の摘出用の3つの独立した器具セットを使用してください。各器具セットは、漂白剤で1回、70% ethanolで1回、そして二回蒸留水で2回洗浄してください。卵を定温インキュベーターから取り出し、氷上に15分間置きます。動物を麻酔および安楽死させるため、腫瘍が見えるようにウィンドウを開けます。腫瘍を完全に露出させるには、ウィンドウを広げる必要がある場合があります。次に、CAMから原発腫瘍を切り出します。清潔な器具を使用して腫瘍を計量し、組織学的に処理します。続いて、臓器の採取に進みます。まず、卵殻から雛を取り出します。卵殻を放射状に等分に切り、切り口から雛胚をデカンテーション（傾注）して取り出してください。また、パンチツールを用いて卵殻の両側からCAM（絨毛膜尿膜）を2片ずつ採取し、エッペンドルフチューブに入れます。雛をウェイングボートに胸側を上にして移します。清潔な解剖道具セットを使用し、腹部と胸骨を切開して腹腔を開き、胚を露出させます。まず、右葉または左葉のいずれかから肝臓の一部を採取します。次に、臓器を繋いでいる内臓を切除しながら、慎重に臓器を取り出します。片方の肺を選択し、肋骨から切り離すためにその四辺を切り取ります。一貫性を保つため、各動物から同一側の肺を採取してください。採取した臓器をすぐに処理できない場合は、-20 °Cで保存してください。ゼノグラフトHep3腫瘍の摘出後、組織学的解析を行った。これはHep3腫瘍のトリクローム（TRM）染色像である。腫瘍の明瞭な分葉状構造の中に、間質成分がはっきりと認められる。GFPを発現するHep3細胞を静脈内投与し、蛍光顕微鏡で観察した結果がここに示す。IV投与の1日後には、散在する個々の腫瘍細胞のみが観察される。投与から3日後には、細胞数が増加し、転移細胞の小さなコロニーが形成されていることが明確にわかる。移植後7日間にわたる転移レベルは、ヒトALU配列に対するリアルタイムPCRを用いて定量化した。本日実演した手法は、定量的価値の高いハイエンドモデルです。習得すれば、実験者は1時間あたり約30匹の個体をセットアップでき、さらに、発生後の鳥類胚モデルを用いることで、2週間の期間内で転移を定量的に分析することが可能です。この手法により、がん生物学分野の研究者は、天然の免疫不全モデルを用いて転移を定量的に分析できるようになりました。

quantitative-analysis-of-cancer-metastasis-using-an-avian-embryo-model

Research

JoVE Journal

Medicine

医学

このビデオでは、トランスジェニックゼブラフィッシュ胚の周辺領域への乳がん細胞送達のためのマイクロインジェクション方法を説明しています。インキュベーション後、蛍光顕微鏡で胚を可視化し、がん細胞の浸潤、播種、転移を観察します。...

zPDX-侵襲性の解析:ゼブラフィッシュ胚異種移植片における転移性がん細胞の侵襲性挙動の調査

このビデオでは、ニワトリの絨毛尿膜にがん細胞を移植してin...

ニワトリ絨毛尿膜ベースのがんモデリング:がん細胞の腫瘍形成と転移を研究するためのIn Ovoモデル

このビデオは、がん細胞をニワトリ絨毛尿膜血管系に静脈内注射してCAMがん転移モデルを生成する手順を示しています。注入された細胞は、最終的に散在する単一がん細胞コロニーを形成し、がんの浸潤と転移の研究を可能にします。...

ニワトリ絨毛尿膜血管系への癌細胞の静脈内注射:癌の浸潤と転移を研究するための絨毛膜膜癌モデルを確立する手順

ここでは、腫瘍細胞代謝のリアルタイムモニタリングと、転移のin vivoニワトリ胚絨毛膜-尿膜(CAM)モデルを組み合わせて、腫瘍細胞をDNA損傷化学療法に感作する能力について、新規の抗がん標的/薬剤を評価するために使用されます。...

がん薬感の有効性を評価<em&gt;インビトロ</em&gt;と<em&gt;インビボ</em

ここでは、侵襲的な行動を調査し、それぞれ、ヒト乳癌細胞の脈管内および血管外漏出の可能性を評価するために、二つの異なる注射部位、 すなわち、卵黄周囲のスペースとキュビエのダクトを使用して異種移植ゼブラフィッシュモデルを記述します。...

胚ゼブラフィッシュにおけるヒト乳癌細胞の浸潤挙動

転移性透明細胞腎細胞癌は、徹底的な前臨床調査のための包括的な動物モデルのない疾患である。このプロトコルは、この疾患の2つの新しい動物モデルを示している:異所的に移植されたマウスモデルと鶏絨毛アラント膜モデルは、いずれも臨床症例に似た肺転移を示す。...

マウス腎臓と鶏絨毛性膜に確立された転移性透明細胞腎細胞癌モデルの比較

我々は、婦人科および泌尿器科癌細胞株および患者由来腫瘍の生着のための代替、移植可能なインビボモデルとして鶏絨毛アラント膜モデルを提示する。...

生体内における鶏絨毛性膜モデルを用いて婦人科癌と泌尿器科癌を研究する

記述されたアプローチは、実験的な尾静脈転移アッセイと生体内生動物イメージングを組み合わせることで、肺の転移数と大きさの定量に加えて、乳癌転移の形成と増殖をリアルタイムでモニタリングすることを可能にする。...

尾静脈転移アッセイとリアルタイムインビボイメージングの併用による乳癌転移性コロニー形成と肺の負担の定量化

癌細胞の静脈内注射は転移研究でよく用いられるが、転移性腫瘍の負担は分析が難しい。本明細書において、転移の尾静脈注入モデルを示し、生じる転移性肺腫瘍の負担を分析する新しいアプローチを含む。...

腫瘍細胞の横尾静脈注入後の肺転移の病理学的解析

これは、抑制剤または癌転移のドライバーをスクリーニングするための効果的な方法です。発現ライブラリーを用いて細胞を導入し、鶏絨毛管内膜血管構造中に注入して転移性コロニーを形成する。浸潤性の減少または増加を有するコロニーは、切除、拡張、再注入して表現型を確認し、最後に、ハイスループットシーケンシングを用いて分析する。...

迅速かつ定量的なチック絨毛管内膜モデルを用いた転移性調節因子の発見

癌細胞の転移能を評価するためのCAM-Delamアッセイは、比較的速く、簡単で、安価である。この方法は、転移形成を調節する分子機構を解明し、薬物スクリーニングに使用することができる。ヒト腫瘍サンプルを分析するための最適化されたアッセイは、パーソナライズされたがん治療のための臨床方法となり得る。...

がん細胞の層間剥離および浸潤能を定量化することによって転移特性をスコアリングするCAM-Delamアッセイ

学ぶ 鳥類胚の尿嚢膜（CAM）モデルを用いたヒトがん細胞の転移能の定量的評価法。PCRによる解析で転移動態を測定し、がん生物学研究に応用する。

鳥類胚のモデルを使用して、がんの転移の定量的解析

さらに動画を探す