Name: 強化されたバイオセーフティのためのポリマー複合エコトロピックレンチウイルスによるヒト細胞のトランスダクション (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-07-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 3 s
Description: 学ぶエコトロピックレンチウイルスによるヒト細胞へのトランスダクション法。ポリマー複合化で導入効率を高め、がん遺伝子研究の安全性を向上させる実験プロトコルを解説する。

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このプロジェクトの資金は、再生医療のためのカリフォルニア工科大学によって提供した。

1. レンチウイルスの作製、回収、および凍結保存
<ol>
	<li>本プロトコルを開始する前に、所属機関の安全管理責任者に相談し、推奨される安全ガイドラインに従ってください。</li>
	<li>1日目 ウイルス作製には、健康で増殖速度の速い293T細胞を使用します。細胞を5 x 106 
	10 cmプレートあたりの細胞数。ウイルス作製には、抗生物質を含まない293T培地（10% FBSおよび4 mM L-グルタミン添加高グルコースDMEM）を使用する。</li>
	<li>2日目 午後遅くに、以下の手順で293T細胞にトランスフェクションを行う（記載の数値は10 cmプレート1枚分である）。
すべての試薬を室温に戻す。ピペットで 375 μl OptiMEMをマイクロ遠心チューブに入れ、次に添加し 25 μl 
	Fugene HD。希釈していないFugeneがチューブの壁面に接触しないようにしてください。</li>
	<li>マイクロ遠心チューブ内で、以下を混合する：
		<ul>
			<li>5 μg 転移プラスミド（Slc7a1、ターゲットベクター、または蛍光コントロールベクター）</li>
			<li>3.75 μg パッケージングプラスミド（pCMV-dR8.91またはpsPax2）</li>
			<li>1.25 μg エンベローププラスミド（パントロピック用pMD2.G、エコトロピック用pHCMV-EcoEnv）</li>
			<li>血清不含OptiMEMに 100 μl</li>
		</ul>
	</li>
	<li>2つのチューブを合わせ、混合物を室温で20〜30分間インキュベートする。</li>
	<li>293T細胞の培地を、新鮮な抗生物質不含の293T培地10 mlに交換する。FuGENE/プラスミド混合液をプレートに滴下し、一晩インキュベートする。 37°C, 5% CO22.</li>
	<li>3日目 293T細胞の培地を、抗生物質を含まない新鮮な293T培地10 mlに交換する。293T細胞は接着力が弱く、単層の上に培地を強くピペッティングすると剥がれ落ちる可能性があるため、慎重に操作すること。その後、ウイルス産生のため、加湿インキュベーター内で2日間培養する。</li>
	<li>5日目。 ウイルスを回収し、0.45 $\mu\text{m}$の低タンパク結合フィルターでろ過する。直ちに使用するか、使い切り量ずつ分注して-80°Cで冷凍保存する。80°C凍結保存したパントロピックウイルスおよびエコトロピックウイルスは、それぞれ6か月および1か月の保存後に再タイター測定を行う必要があります。</li>
	<li>導入効率が比較的高い細胞を用い、以下の手順でウイルスのタイターを測定する。新鮮な培地を用いて、蛍光コントロールウイルスを段階希釈（例：1:10、1:100、1:1000）し、細胞に一晩導入する。 6 μg/ml 翌日に新鮮な培地に交換する。導入後、細胞が蛍光タンパク質を発現し始めるまで2日間待ち、FACSを用いて導入細胞の割合を決定する。得られた希釈倍率に基づき、1 mlあたりの形質転換単位（TU）でタイターを算出する。 &lt; 多重導入イベントを最小限に抑えるため、導入効率を15%とする。 
	<img src="/files/ftp_upload/2822/2822eq1.jpg" alt="力価計算式、ウイルス定量式、ウイルス学における数学的解析" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="式 1">
	</li>
</ol>
2. マウスレトロウイルス受容体Slc7a1を用いたヒト標的細胞の導入
<ol>
	<li>ほとんどの細胞が形質導入されるように、感染多重度（MOI）= 2を選択します。HDFなどの形質導入効率が低い標的細胞の場合、より高いMOIが必要になります。我々は、大部分の細胞を形質導入させるために、ウイルス上清を1:2に希釈して使用しています。</li>
	<li>ウイルスと標的細胞の間の静電的相互作用を高めて形質導入効率を向上させるため、6 μg/mlのPBを含む新鮮な培地で希釈したウイルス上清を用いて、標的細胞を一晩形質導入します1。拡散が形質導入効率の制限要因となるため、35 mmプレートあたり1 mlなど、最小限のウイルス量を使用するのが理想的です。</li>
	<li>Slc7a1受容体が十分に発現するように、ウイルスを除去した後、エコトロピックウイルスで形質導入するまで、細胞を少なくとも48時間培養します。</li>
	<li>（オプション）必要に応じて、ブラスチシジンを用いてSlc7a1を発現する安定形質導入細胞を選別することが可能です。事前にブラスチシジンのキルカーブを作成し、形質導入されていないすべての標的細胞を7日間で死滅させる最低有効濃度（一般的に2 – 10 μg/mlの間）を決定しておく必要があります。Slc7a1ウイルスを除去して約2日後、形質導入した細胞をブラスチシジン含有培地に交換します。ブラスチシジン含有培地で7日間培養すると、残ったすべての細胞がレトロウイルス受容体を安定的に発現するため、エコトロピックウイルスによる形質導入が可能になり、また安定Slc7a1発現株として今後の使用のために保存することができます。</li>
</ol>
3. 毒性判定のためのポリマー複合体タイトレーション
<ol>
	<li>1日目。 96ウェルプレートに5000 cells/wellで細胞を播種し、各実験群につき少なくとも3ウェルのトリプリケートを確保する。正常細胞のベースライン値を得るための完全培地中の非導入細胞、およびコントロールとして増殖停止を誘導するための無血清培地中の細胞サンプルを含める。並行して、各実験条件における導入効率を顕微鏡またはFACSで解析するため、適切なフォーマット（24ウェルプレートなど）に細胞を播種する。</li>
	<li>2日目。 MTT解析およびFACS解析の両方用に準備したプレートの細胞に、標的細胞の約40%を導入させるため、MOI 0.5でGFPをコードするウイルスを導入する。最適量を決定するため、さまざまな濃度のCS/PB（例：各成分50, 100, 200, 400, 600, 800 mg/ml）および6 μg/ml PBをテストする。ポリマー複合体は、後述のパート4に従って調製する。</li>
	<li>3日目。 ウイルス含有培地を除去し、新鮮な培地と交換する。プレートを加湿インキュベーターに戻す。</li>
	<li>5日目。 FACSプレートを解析し、各ポリマー濃度における導入効率を決定する。</li>
	<li>6日目。 MTTプレートの全ウェルから培地を除去し、100 μlのMTT溶液（完全培地中の1 mg/ml MTT）と交換する。加湿インキュベーター内で3時間培養し、代謝活性のある細胞のミトコンドリアでMTTが還元されるようにする。</li>
	<li>MTT溶液を除去し、200 mlのMTT溶解液（イソプロパノール中の0.1 N HCl、0.1% Igepal CA-630）と交換する。</li>
	<li>室温で2時間、または紫色のMTTホルマザン沈殿物がすべて溶解するまでインキュベートする。マイクロプレートリーダーを用いて570 nmで吸光度を測定し、690 nmでのバックグラウンド値を差し引く。</li>
	<li>FACSで判定した導入能の最大向上を示し、かつMTTで判定した代謝活性への影響が最小限である最適なポリマー濃度を選択する。HDFの場合、後述の代表的な結果に示されるデータに基づき、100 μg/ml CS/PBを選択した。</li>
</ol>
4. ポリマー複合体形成によるエコトロピック導入
<ol>
	<li>PBおよびコンドロイチン硫酸のストック溶液（水を用いて20 mg/mlに調製）を滅菌フィルターでろ過して調製する。分注し、-20°Cで保存する。</li>
	<li>ウイルス含有上清をマイクロ遠心チューブにピペットで移し、新鮮な培地を用いて目的の最終濃度（例：MOI 2）に希釈する。PBおよびコンドロイチン硫酸（濃度は上記ステップ3で決定）を同量ずつ順次加え、添加ごとにチューブを軽く叩いて混ぜ合わせる。沈殿が形成されるため、ウイルス混合液はすぐに白濁する。複合体を形成させるため、ウイルス混合液を室温で5分間インキュベートする。</li>
	<li>受容体発現ターゲット細胞から培地を除去し、ウイルス混合液に交換して、37°C、5% CO2条件下で一晩インキュベートする。ウイルス混合液を除去した後、細胞表面をPBSで2回洗浄し、ウイルス複合体の除去を促進する。完全に除去する必要はない。残留したポリマー複合体が細胞の健全性に悪影響を及ぼさないことが確認されている。</li>
</ol>
5. エコトロピック形質導入の特異性の検証
<ol>
	<li>エコトロピックウイルスを初めて作製する場合、安全性の観点から、そのウイルスが未修飾のヒト細胞を導入できないことを確認しておくのが賢明です。比較的高い濃度（新鮮な培地でウイルス上清を1〜2倍に希釈したもの）のエコトロピックレンチウイルスを用い、6 μg/mlのPBまたは最適化したCS/PB濃度で、ヒト細胞を一晩導入します。</li>
	<li>ウイルス含有培地を除去し、新鮮な培地と交換します。細胞を2日間インキュベートした後、蛍光ベクターを用いたFACSによる解析、および/または導入遺伝子特異的プライマーを用いたRT-PCRにより、導入遺伝子の発現を確認します。</li>
</ol>
6. 代表的な結果：
図1Aはレンチウイルスの作製工程を、図1Bはマウスレトロウイルス受容体Slc7a1による導入前処理を含む、エコトロピックレンチウイルスを用いたヒト細胞への導入を示している。ウイルスのタイター測定には、Slc7a1を安定的に導入したヒト横紋筋肉腫細胞株（Slc-hRMS）を使用する。導入効率をモニタリングするために蛍光コントロールベクターを使用した場合、通常は次のような結果が得られる。 &gt; 図2Aおよび2Bに示すように、エコトロピックウイルスを用いたSlc-hRMSの導入効率は90%であった。HDFの導入率は、受容体発現のためにブラスチシジンによる選択が行われていないため、一般的に低くなる（図2C）。エコトロピックレンチウイルスのタイターは、Slc-hRMSで測定した場合、一般的にVSV擬似型ウイルスの10〜20%である（図2D）。
1回の凍結融解サイクルにより、エコトロピックウイルスのタイターは16 - 3%減少しますが、これはVSV擬似型ウイルスの1回の凍結融解サイクルにおけるタイター損失と同等でした（p &gt; 0.05）。先行報告2とは異なり、ドライアイスによる急速凍結がウイルスタイターに及ぼす正の効果は見られませんでした。むしろ、ウイルスの入ったチューブを単に-80°Cのフリーザーに入れることで、いずれの擬似型においても融解後のより高いタイターが得られました（データは示さず）。
MTT生存率アッセイにより、標的細胞における増殖停止を感度良く検出することができる。ウイルスおよび最大 800 μg/ml 濃度の CS/PB による導入は、HDF の代謝に影響を与えない（図 3A）。また、ウイルスを用いない CS/PB への曝露も、細胞に対して毒性影響を及ぼさない（データは示さず）。ウイルスとさまざまな濃度の CS/PB を用いて導入した HDF の FACS 解析では、PB 単独の場合と比較して導入効率の向上が認められた（図 3B）。最大の向上は 100 μg/ml の CS/PB で観察され（図 3C）、これは以前に報告された値3よりも数倍低い。したがって、任意の標的細胞型に対して条件を最適化することが重要である。
CS/PBとの複合体形成により、Slc-hRMSにおける観察されたタイターはおよそ3倍向上します（図4A、p &lt; 0.01）。実際には、これにより低ウイルス濃度において高濃度時よりも導入効率へのより大きな効果が得られます（図4B）。これは、高ウイルス濃度における細胞への多重導入および受容体の飽和によるものである可能性が非常に高いと考えられます。
エコトロピックウイルスの導入は、マウスレトロウイルス受容体を発現している細胞に特異的です。未修飾のヒト細胞にエコトロピックウイルスを導入した場合、図5Aに示すように、PBまたはCS/PBのいずれを用いても、非導入のバックグラウンドを超える蛍光は観察されませんでした。顕微鏡観察では、受容体がない状態のHDFでは導入が認められませんでしたが（図5B）、受容体を事前に導入した場合には蛍光を発する細胞が認められました（図5C）。
<img src="/files/ftp_upload/2822/2822fig1.jpg" alt="レンチウイルス作製プロセスの図。293T細胞への導入およびウイルス含有上清の段階を示す。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="図1"> 
図1. ～の模式図 (A) ウイルス製造プロセスおよび (B) マウスレトロウイルス受容体によるヒト細胞の導入、およびそれに続くエクトロピックレンチウイルスの導入。
<img src="/files/ftp_upload/2822/2822fig2.jpg" alt="フローサイトメトリーグラフ、GFP+細胞の割合解析、蛍光顕微鏡写真、ウイルスタイターの棒グラフ。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="図 2"> 
図 2. GFPをコードするエコトロピック・レンチウイルスによるヒト細胞の高効率な導入。細胞には、あらかじめマウスレトロウイルス受容体Slc7a1を導入した。 (A) Slc7a1のためにブラスチサイジン選択を行ったヒト横紋筋肉腫細胞株（Slc-hRMS）において、GFPを導入した群（青）と非導入の群（ピンク）。 (B) エコトロピック・レンチウイルスを導入したSlc-hRMSの蛍光顕微鏡写真（4倍）。 (C) エコトロピックGFPレンチウイルスを導入した群（青）と非導入の群（ピンク）のHDF。エコトロピック・レンチウイルスの導入2日前にSlc7a1を導入した。 (D) Slc-hRMSを用いて測定した、VSV-G擬似型レンチウイルスおよびエコトロピック・レンチウイルスのタイター。
<img src="/files/ftp_upload/2822/2822fig3.jpg" alt="GFP発現に対するポリマー濃度の影響；吸光度、フローサイトメトリー、およびGFP%のグラフ。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="図3"> 
図3. ヒト皮膚線維芽細胞におけるコンドロイチン硫酸/ポリブレン（CS/PB）濃度の最適化。(A) PBのみ、または異なる濃度のCS/PB存在下で導入を行った後の、MTTアッセイによるHDFの生存率測定。(B) FACSにより測定した、異なる濃度のCS/PBによるHDFにおける導入効率の向上。(C) 導入向上の定量化。100 μg/mlのCS/PBで導入効率が最大になることを示している。
<img src="/files/ftp_upload/2822/2822fig4.jpg" alt="遺伝子導入効率対タイター分析、棒グラフおよび散布図、ポリブレン効果の比較。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="図4"> 
図4. エコトロピックレンチウイルスを用いたSlc-hRMSの導入に対する400 μg/ml CS/PBの影響。(A) タイターの向上、および (B) 6 μg/mlのポリブレン単独と比較した導入率の倍率変化。
<img src="/files/ftp_upload/2822/2822fig5.jpg" alt="GFP陽性細胞の分布を示す蛍光顕微鏡像を伴う、フローサイトメトリーによるGFP強度グラフ" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="図5"> 
図5. マウスレトロウイルス受容体Slc7a1が欠損している場合におけるHDFへのエコトロピック導入の欠如。(A) 受容体Slc7a1が欠損している条件下での、未導入（ピンク）およびエコトロピックGFPレンチウイルスを導入した（青）BJヒト線維芽細胞のFACSプロット。エコトロピックGFPレンチウイルスを導入したBJヒト線維芽細胞において、(B) 受容体Slc7a1の事前導入なし、および(C) 受容体Slc7a1の事前導入あり（4X）の場合。

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</ol>

利害の衝突は宣言されません。

モロニーマウス白血病ウイルス（MLV）とその受容体のmSlc7a1に基づいて組換えエコトロピックgammaretrovirusよく研究し、広く利用されていますが、マウス細胞に導入遺伝子を提供するために20年以上に渡って使用されたこと。エコトロピックgammaretrovirusは、ヒトの細胞に癌遺伝子を提供するために最近でも使用されています。細胞のリプログラミングの文脈で、人間の癌遺伝子を保有する両種性ウイルスの発生を避けるためにmSlc7a1の使用は十分に確立されている4,5しかし、レンチウイルスはgammaretrovirus上の大きな利点を提供します。レンチウイルスプレインテグレーション複合体ができるため、難治性の細胞集団、多くの場合、再プログラミングのための望ましい目標である6を含む主要な細胞を、形質導入における非分裂細胞の伝達7 レンチウイルスは、ウイルスのトロピズム、毒性、およびその他のプロパティ8 MLV -シュードエコトロピックのレンチウイルスはマウス細胞、9を形質導入するために使用されているが、ほとんどヒト細胞で使用されていないを変更するためにMLVを含むさまざまな疑似型の数十、、で生産されている。10そこで、ヒトの細胞に細胞の初期化因子を含む、既知または疑われる癌遺伝子を、提供するために、安全で効果的なコスト、および高効率車両としてMLV -シュードエコトロピックレンチウイルスの使用を提案する。 それは、このプロトコルが完全にパントロピックレンチウイルスを生成して使用する必要性を排除しないことに注意することは重要であり、むしろ、このプロトコルは、癌に関連したウイルスで自己接種可能性から研究者を絶縁、パントロピックウイルスからがん遺伝子（s）を分離。タンパク質のmSlc7a1とそのヒト相同体のhSlc7a1は遍在11はアンフォトロピックウイルスに組み込むための比較的低リスクのmSlc7a1を作る、知られている腫瘍形成またはレシピエント細胞の選択的な増殖優位性を付与する能力がないとアミノ酸トランスポーターを発現している。この追加ステップは、必要な生物学的安全性レベルの専用のウイルスまたは組織培養施設を欠いている研究室で特に有用である。 いくつかの状況でそれは完全に直接標的細胞へのプラスミドSlc7a1をトランスフェクトすることによりパントロピックウイルスの使用を排除することも可能ですが、この技術の有用なターゲットとなる多くの細胞はまた、トランスフェクションに難治性です。別の方法として、ブラストサイジン選択して細胞をSlc7a1 -形質分離する能力は、VSV - Gシュードタイプレンチウイルスはエコトロピックウイルスが多数のため、これらの細胞を形質導入する日常的に使用することができる後に受容体発現細胞のストックを生成するために一度だけ使用できることを意味します実験。研究者は関係なく、常にその親和性は、任意のレンチウイルスを操作するためのそれらの機関の安全ガイドラインに従ってください。 このプロトコルで実現さエコトロピックウイルスの力価は、以前の研究と一致で、一般的にVSV -偽型ウイルス、パントロピックウイルスの力価の10-20％、より適度に低くなる。9これらの力価が安定してSlc7a1で形質導入ヒト細胞で測定したので、下エコトロピックウイルスのための観察力価は、標的細胞の受容体遺伝子の多様な発現に部分的に原因である可能性があります。それにもかかわらず、我々のプロトコルに到達ウイルス力価は、いくつかのケースでは、ほとんどのアプリケーションにとっては十分以上であり、細胞の大部分の伝達につながる&gt;細胞の90％。 遠心分離ベー​​スの手法は一般的にウイルス粒子を濃縮するために使用されます。しかしながら、遠心分離は、数時間を必要とする感染性エアロゾルを生成し、ウイルス粒子の大幅な損失につながることができる。12を別の方法として、CS / PBとの複合体がウイルス親和性を変化させることなく伝達を強化するために使用することができる。3このメソッドは急速である（5分ほぼ観測された力価を3倍にしながら、（10 mlのウイルス当たり0.03ドル））と安価。特別な機器や独自の試薬 ​​は不要、と我々は他の細胞株での前作との契約で、CS / PBにHDFSの曝露後に最小の急性毒性を観察している。このプロトコルの13つの潜在的な欠点がいくつか微視的に見えるポリマーの複合体が付着することです。文化の中で数日間のための細胞。我々は、これらの複合体は、細胞への公然と毒性はないが、細胞のプロセスで、より微妙な影響を与えることがあるという可能性を排除できない。 ここでは、安全かつ効率的に発癌因子とヒトの細胞を形質導入するための方法論を記載している。このアプローチでは、iPS細胞を含む癌遺伝子と幹細胞生物学を研究に大変有用であるはず。

<table border="1"><tbody><tr><th>試薬の名前</th><th>会社</th><th>カタログ番号</th><th>コメント</th></tr><tr><td> pLenti6/UbC/mSlc7a1 </td><td> Addgene </td><td> 17224 </td><td>マウスMLV受容体</td></tr><tr><td> pMD2.G </td><td> Addgene </td><td> 12259 </td><td> VSV - Gエンベロープ</td></tr><tr><td>のpCMV - dR8.91 </td><td> D. Trono演習14 </td><td></td><td>パッケージングプラスミド（等価なプラスミドpsPax2がAddgeneから入手可能です、猫。番号12260） </td></tr><tr><td> pHCMV - EcoEnv </td><td> Addgene </td><td> 15802 </td><td>エコトロピック封筒</td></tr><tr><td> FUGW </td><td> Addgene </td><td> 14883 </td><td> GFPコントロールプラスミド</td></tr><tr><td> OPTIMEM </td><td>インビトロジェン</td><td> 31985 </td><td></td></tr><tr><td>トランスフェHD </td><td>ロッシュ</td><td> 04 709 705 001 </td><td></td></tr><tr><td>ヘキサジメトリンブロマイド（ポリブレン） </td><td>シグマアルドリッチ</td><td> H9268 </td><td></td></tr><tr><td>サメの軟骨からのコンドロイチン硫酸ナトリウム塩</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> C4384 </td><td></td></tr><tr><td>ブラストサイジンS </td><td>フィッシャー</td><td> BP 2647100 </td><td></td></tr><tr><td> Methylthiazolyldiphenyl -テトラゾリウムブロマイド（MTT） </td><td>シグマアルドリッチ</td><td> M2128 </td><td></td></tr><tr><td> IGEPAL CA - 630 </td><td>シグマアルドリッチ</td><td> I3021 </td><td></td></tr></tbody></table>

強化されたバイオセーフティのためのポリマー複合エコトロピックレンチウイルスによるヒト細胞のトランスダクション

Transduction of Human Cells with Polymer-complexed Ecotropic Lentivirus for Enhanced Biosafety

幹と腫瘍細胞生物学の研究は、多くの場合、検査技師のための主要な安全性の問題を上げる、もしくはそれが疑われる癌遺伝子とヒト細胞のウイルスの伝達を必要とする。彼らは非分裂細胞を含む多くの細胞型を、形質導入できるため、そのような一般的に使用されるVSV - Gシューのようなパントロピックレンチウイルスは、遺伝子機能を研究するための貴重なツールです。しかし、研究者は、より高い生物学的安全性レベルの処理要件と安全性の問題に起因する癌遺伝子をエンコードするパントロピックウイルスの生産と遠心分離を回避する場合があります。 c - MycおよびSV40ラージT抗原を含むいくつかの強力な癌遺伝子は、誘導多能性幹細胞（IPSC）の生産を高めることが知られている。他のすべての既知のIPSC誘導遺伝的変化（OCT​​4、SOX2、KLF4、NANOG、LIN28、および機能のp53の損失）も癌へのリンクを持っている、だけでなく、比較的高い安全性の懸念から、それらを作る。 これらの癌に関連したウイルスが細胞のリプロ​​グラミングと多能性を研究する上で有用であるが、それらが安全に使用する必要があります。これらの生物学的安全性の問題に対処するために、我々は、コスト削減と簡便な操作で追加の重点を置いて、エコトロピックレンチウイルスによるヒト細胞の形質導入のための方法を示しています。我々は、受容体発現ヒト細胞は、このアプローチの有効性を検証、ウイルスに暴露の90％以上を形質導入する十分に高い力価を持つエコトロピックレンチウイルスを生産している。 レンチウイルスは、多くの場合、超遠心分離によって濃縮されますが、このプロセスには数時間かかりますし、人間の生物医学研究者への感染性エアロゾルを生成することができます。別の方法として、ウイルス粒子は、より安全にコンドロイチン硫酸とポリブレン（CS / PB）との複合体によって細胞上に沈降することができます。この手法は、安定的に無視できる追加の時間とコストで、マウスレトロウイルス受容体を発現する細胞で3倍にする機能的なウイルスの力価を増加させる。ヒト皮膚線維芽細胞（HDFS）の形質導入は、最大限そのポリマー濃度は、目的の標的細胞のタイプのために滴定する必要が示唆し、以前に癌細胞株で報告された最適値に比べ約4倍低いCS / PB濃度を用いて強化されています。そこで、新たな細胞タイプにおけるポリマーの毒性のアッセイにmethylthiazolyldiphenyl -テトラゾリウムブロマイド（MTT）の使用について説明します。私たちは、最小限の急性毒性を示す、ポリマーの錯体形成またはポリブレン（PB、6μg/ ml）での標準用量のいずれかを使用してウイルスの導入後HDFSの同等の生存率を観察。 このプロトコルでは、我々は生物学的安全性のリスクを低減し、伝達率を増加させる、ヒト細胞における癌遺伝子の過剰発現のためのエコトロピックレンチウイルスの使用を説明します。我々はまた、ウイルス粒子のエアロゾル形成遠心分離を回避しながら、伝達を強化するためにポリマーの錯体化の使用を示します。

レンチウイルスは、遺伝子機能を探索するための貴重な研究ツールですが、研究者は、既知または疑われる癌遺伝子をコードしてパントロピックレンチウイルスの産生を回避する場合があります。別の方法として、我々はエコトロピック受容体mSlc7a1を表現するように修正ヒト細胞でのエコトロピックレンチウイルスの使用のためのより安全なプロトコルを提示する。

幹細胞および腫瘍細胞生物学の研究では、既知またはその疑いがある癌遺伝子をヒト細胞にウイルス導入する必要があることが多く、これにより...に対する重大な安全上の問題が生じます。

本実験の全体的な目的は、エコトロピック・レンチウイルスを用いて、がん遺伝子やその他の潜在的に有害な遺伝子をヒト細胞に導入することです。これは、マウスレトロウイルス受容体をコードするパントロピック・レンチウイルスと、目的の遺伝子をコードするエコトロピック・レンチウイルスを作製することで達成されます。まず、細胞にマウスレトロウイルス受容体を導入して形質導入し、エコトロピック・ウイルスの形質導入に対する感受性を持たせます。次に、ポリブレンとコンドロイチン硫酸を用いたポリマー複合体形成により形質導入効率を高め、エコトロピック・ウイルスを用いてがん遺伝子を導入します。蛍光顕微鏡観察および FACS により、エコトロピック・レンチウイルスを用いてヒト細胞が選択的に形質導入された結果が得られます。この手法の既存の方法（ガンマレトロウイルスによる導入など）に対する主な利点は、レンチウイルス粒子が、幹細胞のような非分裂細胞を含む多くの細胞型をより効果的に導入できる点にあります。この方法は、潜在的な癌遺伝子の機能を理解するなど、癌および幹細胞研究の分野における重要な疑問を解決するのに役立ちます。本手順を開始する前に、所属機関の安全責任者に相談し、推奨される安全ガイドラインに従ってください。組織培養フード内で、健常で急速に増殖している2 9 3 T細胞の培養を開始します。無菌条件下で、5 × 10⁶個の2 9 3 T細胞を、抗生物質を含まない10 mLの2 9 3 T培地で再懸濁します。細胞懸濁液を10 cm組織培養プレートにピペッティングし、37 °C、5% CO₂の組織培養インキュベーターで一晩インキュベートします。翌日の午後遅くに、トランスフェクションを開始します。まず、Optumの分注量と、転移パッケージングおよびエンベローププラスミドを回収し、室温まで温めておきます。マイクロ遠心チューブに375 µLのOptumをピペットで分注し、次に25 µLのFUgene HDトランスフェクション試薬を加えます。FUgene試薬は、チューブの壁面に触れないように、培地中に直接ピペッティングしてください。次に、2本目のマイクロ遠心チューブに、5 µgの転移プラスミド、3.75 µgのパッケージングプラスミド、および1.25 µgのエンベローププラスミドを加え、必要量のOptumで全量を100 µLにします。その後、プラスミド混合液の入ったチューブにOptum Fujiを加え、室温で20〜30分間インキュベートします。インキュベートの終了数分前に、293T細胞を含むプレートから培地を非常に緩やかに吸引し、10 mLの新鮮な抗生物質フリー293T培地と交換します。最後に、FU遺伝子プラスミドミックスを10 cmプレートの培地の中に滴下します。プレートを37 °C、5% carbon dioxideに設定した組織培養インキュベーターに入れ、一晩培養します。翌日、プレートから培地を非常に穏やかに吸引し、新鮮な抗生物質不含の2 9 3 T培地と交換します。その後、プレートを組織培養インキュベーターに戻し、さらに2日間インキュベートします。トランスフェクションから3日後、プレートからウイルスを含む培地を吸引し、0.45 µmの低タンパク結合フィルターを用いてろ過します。ろ過後、ウイルスをタイターウイルスに濃縮し、1 mLあたり6 µgのポリブレンを含む新鮮な抗生物質不含培地で蛍光コントロールウイルスの段階希釈を行い、これらの希釈液を用いて適切な細胞株の細胞に導入します。翌日、24ウェルプレートの培地を新鮮な抗生物質不含培地に交換し、細胞に蛍光タンパク質を発現させるため、さらに2日間インキュベーションを継続します。各ウイルス希釈段階における導入細胞の割合を算出します。次に、多重導入イベントを最小限に抑えるため、導入率が15%未満となる希釈段階に基づき、1 mLあたりの形質転換単位（transforming units per milliliter）でタイターを算出します。並行して作製した他の非蛍光性レンチウイルスのタイターは、蛍光性ウイルスのタイターと同程度であると想定されます。標的細胞に導入を行うため、まず、ほとんどの細胞に導入されるように、感染多重度を2より大きく設定します。まず、新鮮な完全培地を用いて、ウイルス上清を必要とされる感染多重度に希釈します。ここに、最終容量が1 mLとなるように、6 µg/mLのpolybreneを添加します。標的細胞を含む35 mmディッシュから培地を吸引し、希釈したウイルス上清を1 mL添加します。必要に応じて、SLC7A1受容体が十分に発現するよう、組織培養インキュベーターで24〜48時間培養します。書面の手順に従い、ブラストサイジンを用いた抗生物質選択を行い、SLC7A1を発現する安定的に導入された細胞を選択します。毒性決定を開始するために、20 mg/mLのコンドロイチン硫酸ストック溶液と、20 mg/mLのPoly brainのストック溶液を水で調製し、滅菌フィルターでろ過します。余剰のストック溶液は、使用時まで-20 °Cで保存することが可能です。次に、ポリマー複合体の毒性を正確に判定するために必要な96ウェル細胞培養の数を決定します。MTTアッセイを用いて、コンドロイチン硫酸とpoly greenの少なくとも6つの濃度を3連（トリプリケート）で試験する必要があります。さらに、未還元細胞および無血清で培養した細胞も含めてください。健康な細胞のベースラインを提供するため、および増殖停止のコントロールとして、それぞれ培地を含める必要があります。必要なウェル数が確定したら、96ウェルプレートの各ウェルに標的細胞を5,000個ずつ播種し、それと並行して、各実験条件における導入効率の顕微鏡観察または定量分析を行うため、24ウェルプレートにも細胞を播種し、両方の細胞セットを一晩培養します。翌日、コンドロイチン硫酸ストック溶液とポリリジンストック溶液をそれぞれ分注します。次に、GFPを発現するウイルスを、6 µg/mLのpoly L-lysineを含む抗生物質不含培地で希釈し、1ウェルあたり約10〜50%の標的細胞を導入するのに十分な感染多重度（MOI）に調整します。各プレートにおいて、各試験条件およびコントロールウェルに必要な量の希釈ウイルスが確保されていることを確認してください。試験する各コンドロイチン硫酸およびpoly L-lysineポリマー濃度を記載したチューブを用意します。次に、各条件につき3連となる十分量のウイルス懸濁液をチューブに分注します。続いて、試験濃度にするために必要な量のコンドロイチン硫酸およびpoly brainストック溶液を、各チューブに順次ピペッティングします。コンドロイチン硫酸とpoly greenを添加した後、すぐにチューブを弾いて混ぜ合わせます。ウイルスとコンドロイチン硫酸ポリグリーンの混合液を室温で5分間インキュベートします。ウイルス沈殿が形成されるため、混合液が白濁することがあります。インキュベーション後、96ウェルプレートの各ウェルから培地を吸引除去します。その後、計画通りにウイルス、コンドロイチン硫酸、ポリグリーンの混合液をウェルに添加します。また、コントロールおよび無血清培地を適切なウェルにピペッティングします。24ウェルプレートについても同様の手順を繰り返し、組織培養インキュベーターで一晩インキュベートします。次に、プレートからウイルスを含む培地を吸引し、新しい培地と交換します。プレートをインキュベーターに戻し、48時間培養します。48時間後、24ウェルプレートを取り出し、各コンドロイチン硫酸およびポリブレインの濃度における導入効率を分析します。翌日、96ウェルプレートのすべてのウェルから培地を吸引し、100 µLのMTT溶液に置換して、加湿インキュベーター内で3時間培養し、代謝活性のある細胞のミトコンドリア内でMTTが還元されるようにします。3時間後、MTT溶液を吸引し、200 µLの溶媒溶液に置換します。プレートを室温で2時間、または紫色のMTTがすべて形成され沈殿が溶解するまでインキュベートします。マイクロプレートリーダーを用いて570 nmで吸光度を測定し、690 nmでのバックグラウンド値を差し引きます。最適なポリマー濃度は、hdfsに対するMTTで測定した代謝活性への影響を最小限に抑えつつ、導入効率を最大に高める濃度として決定されます。100 µg/mLのコンドロイチン硫酸。本手法で決定した最適なポリマー濃度はPoly brainである。まず、SLC7A1受容体発現HDF細胞を播種した35 mmディッシュの必要数にトランスダクションさせるのに十分な量の、100 µg/mLコンドロイチン硫酸Poly greenウイルス上清混合液を調製する。ポリマー複合体を形成させるため、この混合液を5分間インキュベートする。次に、標的細胞を発現しているレセプターから培地を吸引し、ウイルスミックスに交換して、37 °C、5% carbon dioxideで一晩インキュベートします。ウイルスミックスを除去した後、ウイルス複合物の除去を促進するため、細胞表面をPBSで2回洗浄します。残留したポリマー複合物が細胞の健康に悪影響を及ぼすことは観察されていないため、完全に除去する必要はありません。この蛍光顕微鏡画像は、蛍光コントロールベクターを用いて導入効率をモニタリングした際、トロピックウイルスによってSLC7A1を安定的に発現するヒト肉腫細胞に十分な導入がなされたことを示しています。FACS解析による蛍光の定量化では、90%以上の導入効率が示されています。HDFSの導入率は、細胞がブラスト化されておらず受容体発現が選択されていないため、一般的に低くなります。アトロピック・レンチウイルスの力価は、一般的にVSV擬似型ウイルスの10〜20%であり、これらはS-L-C-H-S-Cで測定されました。MTT生存率アッセイにより、ここに示すように、ウイルスと特定の濃度のコンドロイチン硫酸を用いた標的細胞における増殖停止を感度良く検出することが可能です。800 µg/mL までの Poly brain は、HDF の代謝に影響を与えません。ウイルスおよびさまざまな濃度のコンドロイチン硫酸を導入した HDF の Fax 解析の結果です。Poly green は、Poly green 単独と比較して導入効率の向上を示しています。最大増強は100 µg/mLで認められます。コンドロイチン硫酸のポリ脳組織における値は、以前に報告された値よりも数倍低い結果となりました。したがって、任意の細胞型におけるコンドロイチン硫酸との複合体形成について、条件を最適化することが重要です。Poly brainを用いることで、S-L-C-H-S-Cにおいて観察されるタイターがおよそ3倍向上します。実際には、この効果は高濃度のウイルスよりも低濃度のウイルスを用いた場合の方が導入効率に大きく寄与しますが、これは高濃度のウイルスでは複数の細胞が導入され、受容体が飽和するためであると考えられます。トロピックウイルスの導入は、ニューロンレトロウイルス受容体を発現している細胞に特異的です。未改変のヒト細胞にトロピックウイルスを導入した際、蛍光分析および顕微鏡観察において、未還元バックグラウンドを超える蛍光は観察されませんでした。hDFSでは、受容体がない場合は導入が見られませんでしたが、受容体を事前に導入したところ、蛍光を発する細胞が認められました。本手順を実施する際は、ウイルスが改変されたヒト細胞に導入されないことを確認することが重要です。このビデオを視聴することで、ポリマー複合体形成を用いて導入効率を高め、潜在的に有害な遺伝子をヒト細胞に導入するためのトロピックレンチウイルスの使用方法について、十分に理解することができます。

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