強化されたバイオセーフティのためのポリマー複合エコトロピックレンチウイルスによるヒト細胞のトランスダクション

本実験の全体的な目的は、エコトロピック・レンチウイルスを用いて、がん遺伝子やその他の潜在的に有害な遺伝子をヒト細胞に導入することです。これは、マウスレトロウイルス受容体をコードするパントロピック・レンチウイルスと、目的の遺伝子をコードするエコトロピック・レンチウイルスを作製することで達成されます。まず、細胞にマウスレトロウイルス受容体を導入して形質導入し、エコトロピック・ウイルスの形質導入に対する感受性を持たせます。次に、ポリブレンとコンドロイチン硫酸を用いたポリマー複合体形成により形質導入効率を高め、エコトロピック・ウイルスを用いてがん遺伝子を導入します。蛍光顕微鏡観察および FACS により、エコトロピック・レンチウイルスを用いてヒト細胞が選択的に形質導入された結果が得られます。

この手法の既存の方法（ガンマレトロウイルスによる導入など）に対する主な利点は、レンチウイルス粒子が、幹細胞のような非分裂細胞を含む多くの細胞型をより効果的に導入できる点にあります。この方法は、潜在的な癌遺伝子の機能を理解するなど、癌および幹細胞研究の分野における重要な疑問を解決するのに役立ちます。本手順を開始する前に、所属機関の安全責任者に相談し、推奨される安全ガイドラインに従ってください。

組織培養フード内で、健常で急速に増殖している2 9 3 T細胞の培養を開始します。無菌条件下で、5 × 10⁶個の2 9 3 T細胞を、抗生物質を含まない10 mLの2 9 3 T培地で再懸濁します。細胞懸濁液を10 cm組織培養プレートにピペッティングし、37 °C、5% CO₂の組織培養インキュベーターで一晩インキュベートします。

翌日の午後遅くに、トランスフェクションを開始します。まず、Optumの分注量と、転移パッケージングおよびエンベローププラスミドを回収し、室温まで温めておきます。マイクロ遠心チューブに375 µLのOptumをピペットで分注し、次に25 µLのFUgene HDトランスフェクション試薬を加えます。FUgene試薬は、チューブの壁面に触れないように、培地中に直接ピペッティングしてください。

次に、2本目のマイクロ遠心チューブに、5 µgの転移プラスミド、3.75 µgのパッケージングプラスミド、および1.25 µgのエンベローププラスミドを加え、必要量のOptumで全量を100 µLにします。その後、プラスミド混合液の入ったチューブにOptum Fujiを加え、室温で20〜30分間インキュベートします。インキュベートの終了数分前に、293T細胞を含むプレートから培地を非常に緩やかに吸引し、10 mLの新鮮な抗生物質フリー293T培地と交換します。

最後に、FU遺伝子プラスミドミックスを10 cmプレートの培地の中に滴下します。プレートを37 °C、5% carbon dioxideに設定した組織培養インキュベーターに入れ、一晩培養します。翌日、プレートから培地を非常に穏やかに吸引し、新鮮な抗生物質不含の2 9 3 T培地と交換します。

その後、プレートを組織培養インキュベーターに戻し、さらに2日間インキュベートします。トランスフェクションから3日後、プレートからウイルスを含む培地を吸引し、0.45 µmの低タンパク結合フィルターを用いてろ過します。ろ過後、ウイルスをタイターウイルスに濃縮し、1 mLあたり6 µgのポリブレンを含む新鮮な抗生物質不含培地で蛍光コントロールウイルスの段階希釈を行い、これらの希釈液を用いて適切な細胞株の細胞に導入します。翌日、24ウェルプレートの培地を新鮮な抗生物質不含培地に交換し、細胞に蛍光タンパク質を発現させるため、さらに2日間インキュベーションを継続します。

各ウイルス希釈段階における導入細胞の割合を算出します。次に、多重導入イベントを最小限に抑えるため、導入率が15%未満となる希釈段階に基づき、1 mLあたりの形質転換単位（transforming units per milliliter）でタイターを算出します。並行して作製した他の非蛍光性レンチウイルスのタイターは、蛍光性ウイルスのタイターと同程度であると想定されます。

標的細胞に導入を行うため、まず、ほとんどの細胞に導入されるように、感染多重度を2より大きく設定します。まず、新鮮な完全培地を用いて、ウイルス上清を必要とされる感染多重度に希釈します。ここに、最終容量が1 mLとなるように、6 µg/mLのpolybreneを添加します。

標的細胞を含む35 mmディッシュから培地を吸引し、希釈したウイルス上清を1 mL添加します。必要に応じて、SLC7A1受容体が十分に発現するよう、組織培養インキュベーターで24〜48時間培養します。書面の手順に従い、ブラストサイジンを用いた抗生物質選択を行い、SLC7A1を発現する安定的に導入された細胞を選択します。

毒性決定を開始するために、20 mg/mLのコンドロイチン硫酸ストック溶液と、20 mg/mLのPoly brainのストック溶液を水で調製し、滅菌フィルターでろ過します。余剰のストック溶液は、使用時まで-20 °Cで保存することが可能です。

次に、ポリマー複合体の毒性を正確に判定するために必要な96ウェル細胞培養の数を決定します。MTTアッセイを用いて、コンドロイチン硫酸とpoly greenの少なくとも6つの濃度を3連（トリプリケート）で試験する必要があります。さらに、未還元細胞および無血清で培養した細胞も含めてください。

健康な細胞のベースラインを提供するため、および増殖停止のコントロールとして、それぞれ培地を含める必要があります。必要なウェル数が確定したら、96ウェルプレートの各ウェルに標的細胞を5,000個ずつ播種し、それと並行して、各実験条件における導入効率の顕微鏡観察または定量分析を行うため、24ウェルプレートにも細胞を播種し、両方の細胞セットを一晩培養します。翌日、コンドロイチン硫酸ストック溶液とポリリジンストック溶液をそれぞれ分注します。

次に、GFPを発現するウイルスを、6 µg/mLのpoly L-lysineを含む抗生物質不含培地で希釈し、1ウェルあたり約10〜50%の標的細胞を導入するのに十分な感染多重度（MOI）に調整します。各プレートにおいて、各試験条件およびコントロールウェルに必要な量の希釈ウイルスが確保されていることを確認してください。試験する各コンドロイチン硫酸およびpoly L-lysineポリマー濃度を記載したチューブを用意します。

次に、各条件につき3連となる十分量のウイルス懸濁液をチューブに分注します。続いて、試験濃度にするために必要な量のコンドロイチン硫酸およびpoly brainストック溶液を、各チューブに順次ピペッティングします。コンドロイチン硫酸とpoly greenを添加した後、すぐにチューブを弾いて混ぜ合わせます。

ウイルスとコンドロイチン硫酸ポリグリーンの混合液を室温で5分間インキュベートします。ウイルス沈殿が形成されるため、混合液が白濁することがあります。インキュベーション後、96ウェルプレートの各ウェルから培地を吸引除去します。

その後、計画通りにウイルス、コンドロイチン硫酸、ポリグリーンの混合液をウェルに添加します。また、コントロールおよび無血清培地を適切なウェルにピペッティングします。24ウェルプレートについても同様の手順を繰り返し、組織培養インキュベーターで一晩インキュベートします。

次に、プレートからウイルスを含む培地を吸引し、新しい培地と交換します。プレートをインキュベーターに戻し、48時間培養します。48時間後、24ウェルプレートを取り出し、各コンドロイチン硫酸およびポリブレインの濃度における導入効率を分析します。

翌日、96ウェルプレートのすべてのウェルから培地を吸引し、100 µLのMTT溶液に置換して、加湿インキュベーター内で3時間培養し、代謝活性のある細胞のミトコンドリア内でMTTが還元されるようにします。3時間後、MTT溶液を吸引し、200 µLの溶媒溶液に置換します。

プレートを室温で2時間、または紫色のMTTがすべて形成され沈殿が溶解するまでインキュベートします。マイクロプレートリーダーを用いて570 nmで吸光度を測定し、690 nmでのバックグラウンド値を差し引きます。最適なポリマー濃度は、hdfsに対するMTTで測定した代謝活性への影響を最小限に抑えつつ、導入効率を最大に高める濃度として決定されます。

100 µg/mLのコンドロイチン硫酸。本手法で決定した最適なポリマー濃度はPoly brainである。まず、SLC7A1受容体発現HDF細胞を播種した35 mmディッシュの必要数にトランスダクションさせるのに十分な量の、100 µg/mLコンドロイチン硫酸Poly greenウイルス上清混合液を調製する。ポリマー複合体を形成させるため、この混合液を5分間インキュベートする。

次に、標的細胞を発現しているレセプターから培地を吸引し、ウイルスミックスに交換して、37 °C、5% carbon dioxideで一晩インキュベートします。ウイルスミックスを除去した後、ウイルス複合物の除去を促進するため、細胞表面をPBSで2回洗浄します。残留したポリマー複合物が細胞の健康に悪影響を及ぼすことは観察されていないため、完全に除去する必要はありません。

この蛍光顕微鏡画像は、蛍光コントロールベクターを用いて導入効率をモニタリングした際、トロピックウイルスによってSLC7A1を安定的に発現するヒト肉腫細胞に十分な導入がなされたことを示しています。FACS解析による蛍光の定量化では、90%以上の導入効率が示されています。HDFSの導入率は、細胞がブラスト化されておらず受容体発現が選択されていないため、一般的に低くなります。アトロピック・レンチウイルスの力価は、一般的にVSV擬似型ウイルスの10〜20%であり、これらはS-L-C-H-S-Cで測定されました。MTT生存率アッセイにより、ここに示すように、ウイルスと特定の濃度のコンドロイチン硫酸を用いた標的細胞における増殖停止を感度良く検出することが可能です。

800 µg/mL までの Poly brain は、HDF の代謝に影響を与えません。ウイルスおよびさまざまな濃度のコンドロイチン硫酸を導入した HDF の Fax 解析の結果です。Poly green は、Poly green 単独と比較して導入効率の向上を示しています。

最大増強は100 µg/mLで認められます。コンドロイチン硫酸のポリ脳組織における値は、以前に報告された値よりも数倍低い結果となりました。したがって、任意の細胞型におけるコンドロイチン硫酸との複合体形成について、条件を最適化することが重要です。

Poly brainを用いることで、S-L-C-H-S-Cにおいて観察されるタイターがおよそ3倍向上します。実際には、この効果は高濃度のウイルスよりも低濃度のウイルスを用いた場合の方が導入効率に大きく寄与しますが、これは高濃度のウイルスでは複数の細胞が導入され、受容体が飽和するためであると考えられます。トロピックウイルスの導入は、ニューロンレトロウイルス受容体を発現している細胞に特異的です。

未改変のヒト細胞にトロピックウイルスを導入した際、蛍光分析および顕微鏡観察において、未還元バックグラウンドを超える蛍光は観察されませんでした。hDFSでは、受容体がない場合は導入が見られませんでしたが、受容体を事前に導入したところ、蛍光を発する細胞が認められました。本手順を実施する際は、ウイルスが改変されたヒト細胞に導入されないことを確認することが重要です。

このビデオを視聴することで、ポリマー複合体形成を用いて導入効率を高め、潜在的に有害な遺伝子をヒト細胞に導入するためのトロピックレンチウイルスの使用方法について、十分に理解することができます。