Name: マウスモデルにおける乳腺の発達と機能の評価 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-07-21T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 51 s
Description: 学ぶマウス乳腺の発達評価法。解剖・染色により上皮組織の形成を解析し、オキシトシン刺激による筋上皮細胞の収縮と乳汁射出機能を評価します。遺伝子変異の影響を解明する発生生物学の重要手法です。

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これらの研究は、DWLにCIHRとCBCRA補助金によって賄われた。 IPは、CIHR - STP、FRSQとCIHRから奨学金によって賄われていた。 MKGSはOGSとCIHR - STPの奨学金によって賄われていた。著者らは、マウスの繁殖との彼の援助のためにケビンバーに感謝。

1。乳腺の解剖<ol><li> CO 2吸入を使用して、マウスを安楽死させる。それは解剖がより困難にレンダリングする、乳腺の周りの血液の蓄積の首と、結果に大きな血管に損傷を与える可能性があるので、可能であれば、頸椎脱臼を避けてください。しかし、他の基準がそのようなオキシトシンの血中濃度として、同じマウスで評価される場合は、代替の安楽死の方法は、これはあなたのIACUCによって評価しなければならないのに、必要な場合があります。 </li><li>ホイルに包んで、発泡スチロールに、その背中の上でマウスを配置し、四肢に広がる。しっかりと16から20ゲージの針（図1A）を使用して、すべての四肢を固定する。 </li><li> 70％エタノールで寛大にマウスをスプレーしてください。 </li><li>鉗子を使用して、正中線で腹部の皮膚を引き上げ、鋭いはさみと小さな切開を行います。 </li><li>腹部や胸部の空洞（図1B）をパンクチャ回避しながら切開から始めて、動物の首に皮膚をカット。 </li><li> "Yの形"（図1B）、その結果、正中切開に前足で皮膚を切り取ります。リア手足の皮膚と同じ方法（図1B）をカット。 </li><li>静かにマウスの側面に腹部と胸部の皮膚剥離、止血鉗子を使用する。必要に応じて、穏やかに論理積組織をカット。 </li><li>皮膚の下側に接続されている乳腺を公開し、16〜20ゲージの針を使用して、発泡スチロールにスキンを修正。進むと時間（図1C）で片側を完了します。 </li><li>鉗子を使用して、静かに動物の背骨に向かって外側から開始し、関心と腺や小さな鋭いはさみと皮膚の間のカットの乳腺を持ち上げます。あなたが慎重にカットを確認して、皮膚や筋肉のない部分が腺に残らないように。すべての乳腺（図1）はこのプロトコルを使用して削除されますが、腹部乳腺（＃4）全体のマウント用に最適ですできます。 2番と3番目の腺は、いくつかの櫛筋肉を持っており、それらが全体のマウントおよび組織学のために使用することができますが、それらはすべての分析に適していない可能性があります。 </li></ol> 2。全体のマウント<ol><li>解剖前に少なくとも一日は、1リットルの三角フラスコ中で20分間蒸留水と沸騰の500mlのアルミニウム硫酸カリウムのカルミンおよび2.5Gの1gを溶解することによってカルミンのミョウバン溶液を調製。水で500 mlに最終的な音量を調整します。ワットマン濾紙を通して濾過し、防腐剤としてチモールの少量（数粒）を追加します。冷蔵。染色した後、カルミンのミョウバンのソリューションは、株式のボトルに戻って注ぎ、数週間にわたって何度も再利用することができます。色が薄くなると新鮮な溶液を作る。 </li><li>マウス（ステップ1）から乳腺を切除した後、スライドガラス上に直接それを広げる。 その場の形で元のを維持し、可能な限りそれを平らにしてみてください。適切にストレッチするときに腺がうまくスライド上に残ることでしょう。 </li><li> jar内の室温ではドラフト内で4時間、カルノア固定液（6時03分01秒100パーセントエタノール、クロロホルム、氷酢酸）で、スライドで、それを浸漬することによって腺を修正。他の人が十分であると思われる2時間を使用していることに注意してください。また、腺はまた、4℃で一晩固定することができます。 </li><li> 15分間70％エタノールで洗う。その後、瓶からエタノール溶液の半分を除去してのddH 2 Oで置き換えることによってそれを水に徐々に再水和する5分間インキュベートする。 3回繰り返します。各5分間、エタノールと水の風呂 - 、 - 35％ - 15％あるいは、70％を使用してください。 </li><li> 5分間蒸留水ですすいでください。 </li><li>室温で一晩カルミンのミョウバンで染色。それは染色は腺の厚さに応じて時間がかかる可能性があることに留意すべきである。 </li><li> 、再利用と徐々にキシレンに5分ごとにと明確なために、またはそのようなヒストグラムをクリアのような非毒性の代替のシリアルエタノール浴（50％、70％、95％、100％）によって染色した組織を脱水して染色カーミンのミョウバンを削除します。一晩。脱水とクリアどちらも厚い試料でより長いインキュベーションが必要になる場合があります。 </li><li>サリチル酸メチルの乳腺を浸し。画像が撮影できるようになるまで乳腺はドラフト内でサリチル酸メチルに保管することができます。 </li><li>画像はライトテーブルの上にスライドを配置することにより、（可能な場合は、"マクロ"機能を使用）三脚上に位置する通常のデジタルカメラでドラフト内で撮影することができます。高倍率のための解剖顕微鏡を使用してください。また、乳腺は、画像が十分に薄いマウントを提供する任意のイメージングプラットフォームで化学ドラフト外で撮影することを可能にする（ステップ2.7の後）などPermountなどのメディアに取り付けることができます。 </li><li>全体のマウントを使用して乳腺の発達を定量化するために、このようなダクトの部分に沿って分枝の数（またはサイド支店）などの測定、主ダクトの長さ、または脂肪組織の領域への上皮の比率を評価することができます。最後に、写真の説明書の後にtation、乳腺の全体のマウントは、切片と、従来の組織染色用パラフィンに埋め込むことができます。 </li></ol> 3。オキシトシン誘発の射乳<ol><li>それらが供給された直後にダムから子犬を区切ります。アッセイを実行する前に1時間を待つ。 </li><li>動物からそれらを削除せずに、母を犠牲にし、前に説明したように乳腺を公開する（ステップ1.1から1.8）。 </li><li>トランスファーピペットを使用して、均等に直接興味の乳腺にPBSまたはオキシトシンのソリューションのいずれかをドロップすることでアッセイを開始します。用量の大きいスペクトルを使用することができます。〜8 pg / mlの（生理的用量は）一般的に使用されます。しかし、高い非生理的な投与量は（最大1 mg / ml）を遺伝子組み換えマウスモデルにおける応答がないことを保証するために使用することができます。この手順では、それは射乳（オキシトシンの露出）をテストするコントロール（PBSにさらされる）と反対側のように片側を使用して、胸部（＃2-3）腺を使用することをお勧めします。 </li><li> 1分間インキュベートし、慎重に転送ピペットでそれを吸引することによってソリューションを削除する。ダクトへのミルクのエントリは、ビデオテープの録音によって、またはPBSまたはオキシトシン曝露前と後の画像を取ることによって監視できます。 </li></ol> 4。代表的な結果： 良い全体のマウントでは、乳腺がきちんと広がっていると上皮のダクトは簡単に（図2A）観測されています。腺が十分に広がっていない場合は固定液に入れたとき、それは部分的にまたは完全にスライドから持ち上げることができる。腺は、（図2B）、ハードと使用できなくなります。同様に、腺がよく解剖されていない場合、どちらかの上皮の一部が欠落して（図2C）や皮膚の部分を残りや腹部の筋肉は、腺の分析（図2D）と干渉することができます。 オキシトシンアッセイのために、それはあらゆる機会に、同じ時間のためのダムから哺乳仔を分離することが重要です。この方法では、あなたは牛乳やミルクの少量が前にオキシトシン曝露にダクトに存在しないことが確認されますが、また十分な母乳が筋上皮の収縮（図3A）によりダクトに放出することができる肺胞に存在すること。子犬があまりにも早く削除されると、牛乳は肺胞にし（図3B）を監視することは困難オキシトシンの効果をレンダリングするダクトに蓄積することができます。また、実験は子犬を除去した後早すぎるが実行されている場合、ミルクは肺胞に蓄積する時間がないし、筋上皮細胞のオキシトシン誘発性収縮は、（図3C）が観察されるダクトに十分なミルクのリリースをトリガしません。 <img src="/files/ftp_upload/2828/2828fig1.jpg" alt="図1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図1"> 図1マウスの乳腺の解剖。四肢（）でその背中の上でマウスをピン。腹から首への最初の皮膚を切り取ります。次に、点線（B）で示すように、各肢に腹の中心から垂直切開を行います。優しくピール動物の側の皮膚や乳腺（C）を公開し、それを固定する。 <img src="/files/ftp_upload/2828/2828fig2.jpg" alt="図2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図2"> 図2。マウス乳腺の全体のマウント。上皮管（矢印）とリンパ節（矢印）が容易に腺のうまく広がる乳腺の全体のマウント＃4（）で観察されています。悪い広がる乳腺が（B）が使用できなくなる、スライドから切り離さと崩壊になることがあります。不適切に摘出した乳腺のいずれか（D）、残りの足りない部分（C）または筋肉や皮膚の部分を持つことができます。 2番と3番目の腺が筋肉を櫛歯しているが、依然として全体のマウントまたは組織学的に使用することができることに注意してください。 <img src="/files/ftp_upload/2828/2828fig3.jpg" alt="図3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図3"> 図3。オキシトシン誘発の射乳がオキシトシンの曝露（）以下の（矢印）上皮のダクトで観察することができます。しかし、ダクトはすでに子犬、オキシトシン曝露後のダクトの牛乳のさらなる蓄積（矢印）の授乳最後の後の待ち時間の不適切に長い期間のためにアッセイの開始時に牛乳（矢印）で満たされている場合には難しい観察（B）。また、子犬授乳後の短い潜伏期間が適切にオキシトシン曝露（C）の後にダクト（矢印）で観察される肺胞に牛乳の十分な蓄積のために許可されません。画像は、数値のカメラ（サイバーショット、ソニー）を使用して、オキシトシン曝露の前後に採取した。 <img src="/files/ftp_upload/2828/2828fig4.jpg" alt="図4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図4"> 図4全体の取付けとオキシトシン治療アッセイの概略図。

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</ol>

利害の衝突は宣言されません。

乳腺の発達と機能は密接にオーケストレーションされています。変異マウスは、腺のアーキテクチャ13,12を評価する必要性を強調する乳腺の発達と機能を損なうことができる遺伝子の変異を抱くことができる。乳腺の発達のすべての段階でこの資料に記載したように全体を取付けを行うことができます。典型的には、上皮の開発は思春期（〜6週齢）の途中でと2,10思春期（〜10〜12週齢）の後に、思春期（〜4週齢）の開始時に評価される。これらの段階で、ダクト分岐、末端のつぼみとダクトの長さの数の量は、腺の発達14,15の程度を定量化するために決定することができます。同様に、alveologenesis（妊娠中の肺胞の開発）は、通常、妊娠中に2〜3点で決定され、授乳と退縮時に発生する構造的な変化は、全体のマウント腺の準備16で観察し、定量することができる。しかし、妊娠後期や授乳中のマウスからの全マウントの定量化は、組織の密度のために困難になる可能性があります。それは特にそれらのステージ12に対して、組織学的分析と全体のマウントを組み合わせることをお勧めします...

<table border="1"><tbody><tr><th>試薬</th><th>会社</th><th>カタログ番号</th></tr><tr><td>カーマイン</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> C1022 </td></tr><tr><td>アルミニウムカリウムの硫酸</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> A6435 </td></tr><tr><td>チモール</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> T0501 </td></tr><tr><td>メチルサリチル酸</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> M6752 </td></tr><tr><td>オキシトシン</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> O3251 </td></tr></tbody></table>

マウスモデルにおける乳腺の発達と機能の評価

Evaluation of Mammary Gland Development and Function in Mouse Models

人間の乳腺には、15〜20葉で構成されて乳首における分岐ダクトシステムの開口部に分泌するミルクその。これらのローブは分泌肺胞と収束ダクト1から作られたターミナルダクト小葉単位の数で構成そのものです。マウスでは、同様のアーキテクチャは、ダクトと肺胞が結合組織の間質内に散在されている妊娠で観察される。マウス乳腺上皮は細胞の2つの層、基底膜2の範囲で示される筋上皮細胞の外側の層に囲まれた管腔細胞の内側の層から構成されるダクトのシステムのようなツリーです。出生時に、唯一のrudimental膵管ツリーには、主ダクト15〜20支店で構成される、存在しています。ホルモン3,4,5の影響を受けて、約4週齢の思春期の開始時に枝の伸長と増幅の開始、、。 10週間で、間質のほとんどは、妊娠2日まで各性周期に分岐し、回帰のサイクルを受けることになるダクトの複雑なシステムに侵略されている。妊娠の開始時に、開発の第2段階は、肺胞6,7と呼ばれるブドウの形をしたミルクの分泌構造を形成する上皮の増殖と分化と、始まります。分娩に続いて、泌乳期間全体を通して、牛乳は内腔の分泌細胞で産生され、肺胞の内腔内に格納されています。仔の授乳によって誘発される神経反射によって刺激されたオキシトシン放出は、、牛乳はそれが子犬8〜使用可能になった乳首にダクトを介して輸送されるので、肺胞の周りやダクトに沿って筋上皮細胞の同期した収縮を誘発する。乳腺の発達、分化および機能はしっかりと画策し、必要とする、間質および上皮間だけでなく、上皮9,10,11内筋上皮および管腔細胞間の相互作用だけでなく、されています。これにより、これらの相互作用に関与する多くの遺伝子の変異は、妊娠初期、妊娠後期に分化し、授乳12,13につながる分泌活性化の間に思春期や肺胞形成時にどちら管伸長が損なわれる可能性があります。この記事では、我々はマウス乳腺を細かく分析し、全体のマウントを使用して開発を評価する方法について説明します。我々はまた、生体外オキシトシンベースの機能アッセイを用いて筋上皮の収縮と射乳を評価する方法を示します。乳腺の発達と機能に関する遺伝子変異の効果は、このように変異体と野生型コントロールマウスではこれら2つの手法を実行することにより、 その場で決定することができる。

このメソッドは、マウスから乳腺の発達と機能を細かく分析し、評価する方法について説明します。射乳がオキシトシンベースの筋上皮細胞の収縮アッセイを用いて評価される間に切除された乳腺を全部マウントを使用して開発の度合いを評価されています。

ヒトの乳腺は15〜20個の葉（lobe）で構成されており、それらが乳頭に開口する分岐管系に乳汁を分泌します。これらの葉は、それ自体が……

この手順の全体的な目的は、野生型および変異型マウスにおける乳腺の発達を評価することです。まず、マウスを解剖して乳腺を露出させます。次に、乳腺を適切に採取し、ガラススライド上に広げます。次に、染色の結果を用いて上皮の発達程度を分析します。最後に、オキシトシン曝露時の筋上皮細胞の収縮について分析を行います。最終的に、得られた結果から、乳腺管と肺胞が適切に形成されているか、およびオキシトシン曝露によって筋上皮細胞の収縮が誘導され、乳汁が排出されるかを確認します。この手法は、遺伝子変異やノックアウトが乳腺の形態や機能に及ぼす影響など、乳腺の発達と分化に関する重要な疑問の解決に役立ちます。この手法を視覚的に提示することで、乳腺の適切な摘出を確実にします。ホールマウント法とオキシトシンを用いたアッセイのいずれにおいても、十分に調製された乳腺が必要となるためです。腺の摘出が不適切であると、一部の上皮管が消失したり、皮膚や筋肉組織などの不要な組織が混入したりする可能性があります。摘出の少なくとも1日前に、CalMin 1gと硫酸アルミニウムカリウム 2.5gを蒸留水 500mLに溶解させ、CalMin alum溶液を調製しておきます。1Lのフラスコ内で溶液を20分間煮沸し、最終的に水を加えて500mLに調整します。溶液をWhatmanろ紙でろ過し、保存剤としてチオールを数粒加えます。その後、染色して溶液を冷蔵保存します。炭酸ミョウバン溶液はストックボトルに戻し、数週間にわたって繰り返し使用することができます。色が薄くなった場合は、新しく調製してください。記憶腺の解剖を開始するために、二酸化炭素吸入によりマウスを安楽死させます。頸部の主要な血管を損傷し、乳腺周囲に血液が蓄積して、アルミホイルで包んだポリスチレンフォーム上での解剖が困難になる可能性があるため、可能な限り頸椎脱臼は避けてください。マウスを仰向けに置き、4肢を広げます。16から20ゲージの針を用いて、4本の肢をしっかりと固定します。ピンセットを用いて、マウスに70% ethanolを十分にスプレーします。腹部正中線の皮膚を上に引き上げ、鋭いハサミで切り口から小さな切開を加えます。腹腔または胸腔を穿刺しないように注意しながら、動物の頸部まで皮膚を切開します。前肢の皮膚を正中切開線まで切開し、Y字形にします。後肢の皮膚についても同様に切開します。止血鉗子を使用します。必要に応じて、マウスの腹部および胸部の皮膚をそっと側方に剥がします。結合組織を慎重に切除します。16～20ゲージの針を用いて皮膚をポリスチレンフォームに固定し、皮膚の裏側に付着している乳腺を露出させます。ピンセットを用いて、乳腺を1つずつ解剖します。目的の乳腺を慎重に持ち上げ、小型の鋭い鋏を用いて、外側から動物の脊椎方向に向かって乳腺と皮膚の間を切断します。皮膚や筋肉の断片が乳腺に残らないよう、慎重に切り出してください。このプロトコルを用いてすべての乳腺を摘出できますが、ホールマウントには第4腹側乳腺が最適です。マウスから乳腺を摘出した後、そのままガラススライド上に広げてください。可能な限り平らに広げてください。元のin situ形状を維持することで、腺がスライドガラスにしっかりと密着します。ドラフトチャンバー内で適切に伸展させた後、スライドガラスをカルノ固定液の入った瓶に浸して、腺を固定してください。室温で4時間固定します。あるいは、腺組織を4°Cで一晩固定しても構いません。次に、組織を70% ethanolで15分間洗浄します。次に、ジャー内のエタノール溶液の半分を取り除き、二回蒸留水に置き換えることで、徐々に再水和させます。5分間インキュベートします。この操作を3回繰り返し、二回蒸留水で5分間すすぎます。その後、翌日に室温で一晩、腺をカーボンアラムで染色します。カーボンアラム染色液を除去して再利用に回し、染色した組織を5分ずつの連続的なエタノール浴で徐々に脱水します。次に、キシレンで一晩組織を透明化し、透明化後、乳腺をサリチル酸メチルに浸します。画像撮影の準備が整うまで、サリチル酸メチルはドラフトチャンバー内で保持してください。乳腺の発達は、乳管の一部に沿った分岐または側枝の数を数えることで定量化でき、また、主乳管の長さや上皮組織と脂肪組織の面積比を評価することも可能です。乳腺の発達と機能を評価するために用いられる2つ目のアッセイでは、乳腺にオキシトシンを投与し、上皮管への射乳を評価します。このアッセイを行うには、授乳直後の幼獣を母獣から離乳させ、母獣を1時間隔離しておく必要があります。次に、母獣を屠殺し、乳腺の摘出法で説明した通りに乳腺を露出させます。ただし、それらは動物の体内に残しておきます。転送ピペットを使用して、PBSまたはオキシトシン溶液を3～5 mL、目的の乳腺に均等に滴下してアッセイを開始します。この手順では、片側を対照群とし、もう一方の側で射乳をテストすることで、胸腺を使用することが推奨されます。腺組織を1分間インキュベートし、トランスファーピペットで慎重に吸引して溶液を除去します。ビデオ録画またはPBSまたはオキシトシン曝露前後の画像撮影により、乳管へのミルクの流入をモニタリングします。以下はマウスの記憶例です。適切に展展された乳腺全体において、矢印で示された上皮管と、矢印頭で示されたリンパ節が容易に観察できます。乳腺の展展が不十分な場合、スライドから剥がれたり潰れたりして、使用不能になることがあります。適切に摘出されていない乳腺では、一部が欠損していたり、筋肉や皮膚の断片が残っていたりすることがあります。オキシトシンに曝露させた後、去勢されたアヒルにおいて、オキシトシン誘発性の射乳が観察されます。しかし、幼い仔の最後の授乳後、潜伏期間が不適切に長かったために乳管にすでに乳汁が充満している場合、オキシトシン曝露後の乳管におけるさらなる乳汁の蓄積を観察することは困難です。逆に、授乳後の潜伏期間が短いと、乳腺の解剖後にオキシトシン曝露によって乳管内で適切に観察できるほどの十分な乳汁が肺胞に蓄積されません。ホールマウント標本の作成やオキシトシン誘発性の射乳の評価を行う代わりに、乳腺を凍結し、凍結切片を作成して、乳腺に存在する任意のタンパク質を免疫標識することができます。あるいは、腺を溶解してウェスタンブロッティングに供することも可能です。これら2つの評価法を併用することで、主要遺伝子を欠損させた、あるいは遺伝子に突然変異を導入した数多くのマウスモデルを用いて、腺の発達、分化、および機能に関する根本的な課題に取り組むことができました。

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マウスモデルにおける乳腺の発達と機能の評価

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