マウスモデルにおける乳腺の発達と機能の評価

この手順の全体的な目的は、野生型および変異型マウスにおける乳腺の発達を評価することです。まず、マウスを解剖して乳腺を露出させます。次に、乳腺を適切に採取し、ガラススライド上に広げます。

次に、染色の結果を用いて上皮の発達程度を分析します。最後に、オキシトシン曝露時の筋上皮細胞の収縮について分析を行います。最終的に、得られた結果から、乳腺管と肺胞が適切に形成されているか、およびオキシトシン曝露によって筋上皮細胞の収縮が誘導され、乳汁が排出されるかを確認します。この手法は、遺伝子変異やノックアウトが乳腺の形態や機能に及ぼす影響など、乳腺の発達と分化に関する重要な疑問の解決に役立ちます。

この手法を視覚的に提示することで、乳腺の適切な摘出を確実にします。ホールマウント法とオキシトシンを用いたアッセイのいずれにおいても、十分に調製された乳腺が必要となるためです。腺の摘出が不適切であると、一部の上皮管が消失したり、皮膚や筋肉組織などの不要な組織が混入したりする可能性があります。摘出の少なくとも1日前に、CalMin 1gと硫酸アルミニウムカリウム 2.5gを蒸留水 500mLに溶解させ、CalMin alum溶液を調製しておきます。

1Lのフラスコ内で溶液を20分間煮沸し、最終的に水を加えて500mLに調整します。溶液をWhatmanろ紙でろ過し、保存剤としてチオールを数粒加えます。その後、染色して溶液を冷蔵保存します。

炭酸ミョウバン溶液はストックボトルに戻し、数週間にわたって繰り返し使用することができます。色が薄くなった場合は、新しく調製してください。記憶腺の解剖を開始するために、二酸化炭素吸入によりマウスを安楽死させます。

頸部の主要な血管を損傷し、乳腺周囲に血液が蓄積して、アルミホイルで包んだポリスチレンフォーム上での解剖が困難になる可能性があるため、可能な限り頸椎脱臼は避けてください。マウスを仰向けに置き、4肢を広げます。

16から20ゲージの針を用いて、4本の肢をしっかりと固定します。ピンセットを用いて、マウスに70% ethanolを十分にスプレーします。腹部正中線の皮膚を上に引き上げ、鋭いハサミで切り口から小さな切開を加えます。

腹腔または胸腔を穿刺しないように注意しながら、動物の頸部まで皮膚を切開します。前肢の皮膚を正中切開線まで切開し、Y字形にします。後肢の皮膚についても同様に切開します。

止血鉗子を使用します。必要に応じて、マウスの腹部および胸部の皮膚をそっと側方に剥がします。結合組織を慎重に切除します。

16～20ゲージの針を用いて皮膚をポリスチレンフォームに固定し、皮膚の裏側に付着している乳腺を露出させます。ピンセットを用いて、乳腺を1つずつ解剖します。目的の乳腺を慎重に持ち上げ、小型の鋭い鋏を用いて、外側から動物の脊椎方向に向かって乳腺と皮膚の間を切断します。

皮膚や筋肉の断片が乳腺に残らないよう、慎重に切り出してください。このプロトコルを用いてすべての乳腺を摘出できますが、ホールマウントには第4腹側乳腺が最適です。マウスから乳腺を摘出した後、そのままガラススライド上に広げてください。

可能な限り平らに広げてください。元のin situ形状を維持することで、腺がスライドガラスにしっかりと密着します。ドラフトチャンバー内で適切に伸展させた後、スライドガラスをカルノ固定液の入った瓶に浸して、腺を固定してください。

室温で4時間固定します。あるいは、腺組織を4°Cで一晩固定しても構いません。次に、組織を70% ethanolで15分間洗浄します。

次に、ジャー内のエタノール溶液の半分を取り除き、二回蒸留水に置き換えることで、徐々に再水和させます。5分間インキュベートします。この操作を3回繰り返し、二回蒸留水で5分間すすぎます。

その後、翌日に室温で一晩、腺をカーボンアラムで染色します。カーボンアラム染色液を除去して再利用に回し、染色した組織を5分ずつの連続的なエタノール浴で徐々に脱水します。次に、キシレンで一晩組織を透明化し、透明化後、乳腺をサリチル酸メチルに浸します。画像撮影の準備が整うまで、サリチル酸メチルはドラフトチャンバー内で保持してください。乳腺の発達は、乳管の一部に沿った分岐または側枝の数を数えることで定量化でき、また、主乳管の長さや上皮組織と脂肪組織の面積比を評価することも可能です。

乳腺の発達と機能を評価するために用いられる2つ目のアッセイでは、乳腺にオキシトシンを投与し、上皮管への射乳を評価します。このアッセイを行うには、授乳直後の幼獣を母獣から離乳させ、母獣を1時間隔離しておく必要があります。次に、母獣を屠殺し、乳腺の摘出法で説明した通りに乳腺を露出させます。

ただし、それらは動物の体内に残しておきます。転送ピペットを使用して、PBSまたはオキシトシン溶液を3～5 mL、目的の乳腺に均等に滴下してアッセイを開始します。この手順では、片側を対照群とし、もう一方の側で射乳をテストすることで、胸腺を使用することが推奨されます。

腺組織を1分間インキュベートし、トランスファーピペットで慎重に吸引して溶液を除去します。ビデオ録画またはPBSまたはオキシトシン曝露前後の画像撮影により、乳管へのミルクの流入をモニタリングします。以下はマウスの記憶例です。適切に展展された乳腺全体において、矢印で示された上皮管と、矢印頭で示されたリンパ節が容易に観察できます。

乳腺の展展が不十分な場合、スライドから剥がれたり潰れたりして、使用不能になることがあります。適切に摘出されていない乳腺では、一部が欠損していたり、筋肉や皮膚の断片が残っていたりすることがあります。オキシトシンに曝露させた後、去勢されたアヒルにおいて、オキシトシン誘発性の射乳が観察されます。

しかし、幼い仔の最後の授乳後、潜伏期間が不適切に長かったために乳管にすでに乳汁が充満している場合、オキシトシン曝露後の乳管におけるさらなる乳汁の蓄積を観察することは困難です。逆に、授乳後の潜伏期間が短いと、乳腺の解剖後にオキシトシン曝露によって乳管内で適切に観察できるほどの十分な乳汁が肺胞に蓄積されません。ホールマウント標本の作成やオキシトシン誘発性の射乳の評価を行う代わりに、乳腺を凍結し、凍結切片を作成して、乳腺に存在する任意のタンパク質を免疫標識することができます。

あるいは、腺を溶解してウェスタンブロッティングに供することも可能です。これら2つの評価法を併用することで、主要遺伝子を欠損させた、あるいは遺伝子に突然変異を導入した数多くのマウスモデルを用いて、腺の発達、分化、および機能に関する根本的な課題に取り組むことができました。