HIV感染患者との経験：末梢血中の細菌叢のシーケンシング

末梢血中に移行した細菌叢のシーケンシングについて。HIV感染患者を対象とした我々の経験についてお話しします。私はジュニア・マルティで、イタリアのミラノ大学感染症・熱帯医学クリニックで助教授を務めています。ここでは、HIV感染患者の末梢血から細菌DNAを検出し、シーケンシングする方法について、実験手順を解説します。

健康な胃腸管には多種多様な共生微生物が定着しており、これらが液性免疫および細胞性免疫系の発達に影響を与えています。微生物叢は強力な粘膜バリアによって免疫系から遮断されていますが、感染症、抗生物質治療、術後合併症などの臨床的状況に加え、癌、膵炎、栄養不良の患者においては、胃腸管に変調が生じます。

HIV感染は胃腸バリアの破綻を引き起こし、粘膜免疫の漸進的な不全と、リポ多糖や細菌DNA断片などの細菌バイオプロダクトの全身循環への漏出を招きます。これらは全身性の免疫活性化に寄与します。本ビデオでは、細菌DNAの検出とシーケンシングの実験段階について解説します。演示を行うのは、ミラノ大学感染症・熱帯医学クリニックに所属する感染症フェローのCamilla ti、博士課程学生のEsther me、およびポストドクターのju MariaIです。本実験の目的は、HIV感染患者の末梢血サンプルから細菌種を特定することです。

健康な個体は正常な腸内恒常性を維持しているため、HIV感染者と健康な被験者の両方から全血を使用します。健康な被験者において、移行性マイクロフローラは検出されないと考えられます。患者から全血を採取し、その後プラズマ分離を行います。

次に、PCIC 16 s ribosomal geneの広範囲PCR反応を行うためにDNAを抽出します。PCR産物を得た後、精製、クローニング、およびシーケンシング解析を行います。本実験の最初のステップは、静脈穿刺による採血であり、続いて血漿分離を行います。

EDTA含有チューブに、約 9 mL の全血を採取します。チューブを遠心分離機にかけ、2000 RPM で 10 分間遠心分離します。室温で遠心分離を行うことで、血漿を分離させます。

これから血漿サンプルからDNAを抽出します。無菌状態を保証するため、フード、ピペット、および実験に必要な器具を適切に消毒し、すべての器具をUVライトの下に少なくとも30分間置きます。UVライトを消し、手袋を消毒剤で拭き、数枚のペーパータオルをエタノールに浸して、チップを廃棄するたびにフードの下に配置します。DNA抽出の手順において、ピペットを濡れたペーパータオルで拭いてください。

DNA抽出の準備が整いました。DNAは、製造元の指示に従い、市販のキットを用いて抽出します。簡潔に述べると、350 µLの血漿を2 mLのエンドルフチューブに入れます。

超純水をネガティブコントロールとして使用します。最終濃度1 mg/mLとなるように、リソソームを10 µLサンプルに添加します。その後、サンプルを30分間インキュベートします。

遠心分離後、指示に従って37 °Cで溶液A、クロロホルム、および溶液Bをサンプルに添加します。すると3つの独立した相が現れます。上清を回収してエタノールに添加し、DNAを沈殿させます。その後、分光光度計を用いてDNA濃度を測定します。

次のステップは、PRIC 16 s リボソーム遺伝子を増幅するための広範囲のPCR反応であり、専用の室で実施します。これらの試薬を用いてPCRミックスを調製します。細菌由来の Taq ポリメラーゼによる汚染を避けるため、PCRミックスを 4°C、500 ×g で 30分間遠心分離します。

その後、PCRミックスを分注します。増幅が必要なサンプル数に応じて分注してください。その際、陰性および陽性の反応コントロール用の分注分も含めるように注意してください。

サーモサイクリングは、以下の条件で設定します。94 °Cで5分間。次に、94 °C、55 °C、72 °Cで各1分間を40サイクル繰り返し、最後に72 °Cで10分間処理します。平均所要時間は3時間です。

PCR産物を2% AGROSゲルで可視化します。これはPCR産物を示す2% AGROSゲルです。最初のレーンには100 bpラダーが含まれています。

2番目のレーンはPCR陽性コントロールです。3番目のレーンにはPCR陰性コントロールが含まれています。4番目のレーンはHIV陽性患者からのサンプルを示しており、5番目のレーンは水（ブランク）レーンです。

6番目のレーンは健康な個体からのサンプルと陰性PCR反応を示しています。7番目のレーンには水が含まれています。次のステップはPCRの確認です。

PCR産物を、メーカーの指示に従って市販のキットを用いて精製します。この工程では、フィルターを含む多数のカラムを使用します。PCRの結果を作業シートに記録します。

ここからは、ブルー・ホワイトスクリーン法を用いたクローニングを進めます。これは、ベクターへのDNAライゲーションの成否を検出できる分子生物学的手法です。ベクターはコンピテントセル（細菌）に形質転換されます。

コンピテントセルをxal存在下で培養します。形質転換が成功すれば、細菌コロニーは白色になります。失敗した場合は、コロニーは青色になります。

X-galは、細胞がβ-ガラクトシダーゼ酵素を発現しているかどうかを判定し、大腸菌コロニーの形質転換を可視化するために使用されます。IPTGはβ-ガラクトシダーゼの発現を誘導します。X-galとIPTGを、アンピシリンを含むプレート上に散布し、撹拌します。PCR産物、SALT、およびクローニングベクターを含むクローニングミックスを、製造元の指示に従って調製します。

E coli細胞を氷上で静置します。次に、クローニングミックスを細胞に添加し、ヒートショック処理を行った後、プレートを37°Cで一晩インキュベートします。インキュベーション後、プレート上に白および青のコロニーが形成されます。

白いコロニーはPCR産物が陽性であることを示します。挿入および青いコロニーはPCR産物の挿入が陰性であることを示します。10個の白いコロニーと1個の青いコロニーを選択します。

各コロニーを2 mLの液体LB培地に接種します。アンピシリンを添加した培地で、コロニーを37 °Cで一晩培養します。培養後、一晩成長させたコロニーを用いて、市販のミニプレップキットでプラスミド抽出を行います。

フィルターを含むミニカラムを、次のステップに使用します。プラスミド抽出後、プラスミドを0.7%AROSゲルで視覚化します。これは、ミニプレップ産物を示す0.7%AROSゲルです。最初のレーンには1 kbラダーが含まれています。

2番目のレーンには、青色のコントロールコロニーが含まれています。3番目から12番目のレーンには、白色のコロニーが含まれています。結果をワークシートに記録し、次のシーケンシングステップに進み、プラスミドを増幅させます。

これらの試薬を用いて混合液を作成します。PCR混合液を、増幅が必要なサンプル数に応じて分注します。サーマルサイクリングは、96 °Cで1分間、96 °Cで10秒間、50 °Cで5秒間、60 °Cで4分間という条件でプログラムします。

25サイクルで実施します。平均所要時間は約1時間です。増幅後、PCR産物をフィルター付きカラムを用いて精製します。

精製物をプレートにロードし、それをシーケンサーにセットします。配列決定が完了した後、BLAST解析を行い、各コロニーの細菌種を同定します。98%から100%の相同性を示す配列を持つコロニーを陽性とみなします。

これは、HIV陽性個人の血漿における細菌シーケンシングの例です。我々の結果は、HIV疾患における微生物転移に多種多様な微生物相が関与していることを示しています。これにより、HIV感染患者の全身循環系において、高度な多種微生物叢が存在することが示されました。

HIV陰性の健康な個体における末梢血中の細菌DNAは検出限界以下であり、これはおそらく胃腸管の完全性を反映していると考えられます。現在、私たちの研究は、末梢血中のマイクロフローラが、HIVの免疫病原性の調節、およびおそらく治療への反応において果たす可能性のある役割を理解し、調査することに焦点を当てています。