Name: ハイスループット酵母プラスミドの過剰発現の画面 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-07-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 57 s
Description: 学ぶ ハイスループット酵母プラスミド変換法。Saccharomyces cerevisiaeを用いた自動化スクリーニングで、神経変性疾患タンパク質の毒性修飾遺伝子を同定する効率的なプロトコルを解説します。

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この作品は、ジョンズホプキンス大学でALS研究のためのパッカードセンター（ADG）、NIHのディレクターの新イノベーター賞1DP2OD004417 - 01（ADG）、NIH R01 NS065317（ADG）、リタアレン財団奨学生賞からの助成金によって支えられて。 ADGは、ピュー慈善財団がサポートしている医歯薬学総合研究でピュー学者です。

1。酵母の形質転換のための準備このプロトコルは、10、96ウェルプレート用に設計されていますが、それに応じて上または下に拡張することができます。我々は、このプロトコルは、変換のラウンドあたり20以上の96ウェルプレート用にうまく動作しないことがわかりました。全体の変換手順は（ステップI.3から）約8時間かかります。 <ol><li> BiorobotのRapidPlate液体ハンドラ付き丸底96ウェルプレートの各ウェルに酵母FLEXGene ORFのライブラリーからのアリコットプラスミドDNAの5 -10μL（100 ng /μLの）。場所は乾燥して一晩クリーンベンチドラフト内で96ウェルプレートを発見。我々は、CENと2μ酵母プラスミドと同様の形質転換効率を発見した。 </li><li> 500mLにバッフル付き三角フラスコ内のクエリ株と酵母ペプトンデキストロース（YPD）メディア（10グラム/ L酵母エキス、20グラム/ Lペプトン、20グラム/ Lグルコース）の200mLのを接種する。 （200rpm）し振とうしながら30℃で一晩インキュベートする。必要な場合、選択培地はまた、これらのスターター培養に使用することができます。 </li><li>次の朝は、YPDの2LでOD 600 = 0.1をクエリ菌株を希釈する。 30 ° C（200回転）の文化がOD 600 = 0.8から1.0に達するまでに4〜6時間振とうする。最適な成長のために、独立した2.8 Lバッフル付きフラスコに2つの1Lの文化で育ったの。必要に応じて、選択培地は、YPDの代わりに使用できます。 </li></ol> 2。酵母の変換<ol><li>遠心分離により細胞を回収。卓上遠心機で5分間、3000rpmの（〜1800 × g）で（エッペンドルフ5810R）で酵母培養液とスピンを持つ4つの使い捨ての225mLコニカルチューブを埋める。上清を捨て、すべてのセルが収穫されるまで繰り返す。 </li><li>オートクレーブした蒸留H 2 Oの200mLので細胞を洗浄振ったり、ボルテックスして細胞ペレットを再懸濁します。 one 225mLコニカルチューブに細胞を組み合わせる。 5分間3000rpmの時にスピン。上清を取り除く。 </li><li> 0.1MLiOAc/1XTE溶液（0.1M LiOAc、10mMのトリス、1mMのEDTA、オートクレーブ蒸留水のpH 8）を準備する。 100mLの0.1MLiOAc/1XTEで細胞を洗浄。 5分間3000rpmの時にスピン。上清を取り除く。 </li><li> 70mL 0.1M LiOAc/1xTEで再懸細胞ペレット。ペレットが完全に再懸されていることを確認すると/またはボルテックス振る。 </li><li> 30分（200rpm）し、30℃で振盪しながらインキュベートする。 </li><li> 0.1Mにβ-メルカプトエタノールを追加。 30分（200rpm）し、30℃で振盪しながらインキュベートする。注：β-メルカプトエタノールに敏感な酵母株を使用している場合、このステップは省略することができます。我々は、このステップが成功した変換のために不可欠ではないことを発見した、しかしそれは、形質転換効率を向上させます。 </li><li> 15分間超音波処理したサケ精子DNA（10mg/mL）の2mLのを沸かし、次に氷上で冷やします。 </li><li>細胞混合物にゆでサケ精子DNAの2mLのを追加。注意：沈殿物は、細胞の混合物にサケ精子DNAの添加により形成することがあります。 pipetmanと200μlの先端を使用して、慎重にこれは下流のピペッティングを妨害する可能性があるため、フォームの沈殿物を取り除く。 </li><li> BioRobotのRapidplateを使用して96ウェルプレートの各ウェルに細胞混合物のアリコート50μLは、（また、マルチチャンネルピペットを使用することができます）。混ぜて使用しないでください。 </li><li>振盪せずに30分間室温でインキュベートする。 </li><li> 40パーセントPEG-3350/10％DMSO/0.1M LiOAc（50％PEG - 3350、20mlのDMSO、20mlの1M LiOAcの160mL）の200mLの準備。使用直前に溶液を調製します。 </li><li>各ウェルにPEG / LioAc / DMSO溶液の125μLを追加。 RapidPlateで8回吸引し、細胞懸濁液を分注して混ぜる。 </li><li>振盪せずに30分間室温でインキュベートする。 </li><li>熱ショックで42セル℃で乾燥したインキュベーターで15分間。プレートを積み重ねないでください。注：我々は、この熱ショックのステップが成功した変換のために不可欠ではないことを発見した。特定の酵母菌株（例えば、温度感受性変異株）については、熱ショックは有害です。我々は以前に1分に熱ショック時間を短縮していると正常にこのプロトコルを使用してypt1温度感受性突然変異を保有する酵母株を形質転換することができた。 </li><li> 96ウェルプレートに対応するために遠心アダプターを使用して、5分間2500rpm（〜1100 × g）でプレートを回転させる。廃棄物のバケット上に反転板でのPEG溶液を除去。残液を除去するためにペーパータオル上で逆さプレートをブロット（細胞がウェルの底に残ります）。 </li><li> RapidPlateで各ウェルに（例えばSD / - 裏）最少培地の200μLを加えることによって細胞をすすいでください。 </li><li> 5分間2500rpmで板を回転し、反転以上廃棄物のバケツやペーパータオルでブロッティングにより上清を取り除く。 </li><li> RapidPlateで各ウェルに最少培地の200μL（例えばSD / - 裏）を追加します。 </li><li>振盪せずに2日間、30℃でインキュベートする。 2日後、細胞の小さなコロニーがうまくうまく変換された各の下部にあるフォームを開始する必要があります。 </li></ol> 3。アッセイをスポッティング<ol><li>の各ウェルにラフィノースベースの最少培地（例えばSRAF /浦）の200μLを分注する新しい平底96ウェルプレート。 </li><li> Rapidplateで8回吸引し、細胞懸濁液を分注することによって形質転換プレートの各ウェルを混ぜる。 </li><li>形質転換プレートから細胞混合物の5μLとSRAFプレートに接種する。 </li><li>一日のために30℃でインキュベートする。小さなコロニーは、1日後に各ウェルの底に存在すべきである。 </li><li> SD / -裏とSGal /浦フードのプレート上のスポットのコロニー。炎によって96ボルトレプリケータ（フロッガー）を滅菌する。選択培地プレート上にスポッティングする前にフロッガーを持つコロニーを混ぜる。スポッティング後、プレートを5〜10分間フード内で乾燥させます。 </li><li> 2〜3日間30℃でインキュベートする。 </li></ol>写真デジタルカメラとプレート、そして視覚的にクエリひずみ毒性が増強されるコロニー（遅い成長/密度の低いコロニー）または抑制を（速く成長/より緻密なコロニー）を見つけるためにSGal /浦プレート上のコロニーの成長を比較する。 4。代表的な結果： <img src="/files/ftp_upload/2836/2836fig1.jpg" alt="図1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図1"> TDP - 43毒性の抑制およびエンハンサーを同定するために図1。酵母プラスミド過剰発現の画面。 TDP - 43は、筋萎縮性側索硬化症（ルーゲーリッグ病）の病因に関与しているヒトタンパ​​ク質である。 TDP - 43の細胞質凝集体は、ALS患者17の脳と脊髄の神経細胞に蓄積されます。凝集と細胞毒性18の酵母細胞の結果におけるTDP - 43を表現する。我々は、TDP - 43毒性19,20のメカニズムを定義するには、このモデルシステムを使用している。示すように私たちの酵母TDP - 43毒性の修飾子画面から板のrepesentative例です。これらのプレートはFLEXGene ORF発現ライブラリーからのプラスミドで形質転換した統合型ガラクトース誘導TDP - 43プラスミドともあるコロニーが表示されます。左側のプレートは、TDP - 43またはFLEXGeneプラスミドの発現を抑制するグルコースを、含まれています。右側のプレートは、TDP - 43の発現とFLEXGeneプラスミドのORFを誘導するガラクトースが含まれています。緑の矢印は、TDP - 43の毒性を抑制することをプラスミドで形質転換コロニーを示している。赤い矢印は、TDP - 43の毒性を増強することをプラスミドで形質転換コロニーを示している。

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<li>Johnson, B. S., McCaffery, J. M., Lindquist, S., Gitler, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+yeast+TDP-43+proteinopathy+model%3A+Exploring+the+molecular+determinants+of+TDP-43+aggregation+and+cellular+toxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">A yeast TDP-43 proteinopathy model: Exploring the molecular determinants of TDP-43 aggregation and cellular toxicity.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 6439-6444 (2008).</li>
<li>Elden, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ataxin-2+intermediate-length+polyglutamine+expansions+are+associated+with+increased+risk+for+ALS%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Ataxin-2 intermediate-length polyglutamine expansions are associated with increased risk for ALS.</a> Nature. 466, 1069-1075 (2010).</li>
<li>Johnson, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TDP-43+is+intrinsically+aggregation-prone%2C+and+amyotrophic+lateral+sclerosis-linked+mutations+accelerate+aggregation+and+increase+toxicity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">TDP-43 is intrinsically aggregation-prone, and amyotrophic lateral sclerosis-linked mutations accelerate aggregation and increase toxicity.</a> J Biol Chem. 284, 20329-20339 (2009).</li>
<li>Cooper, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alpha-synuclein+blocks+ER-Golgi+traffic+and+Rab1+rescues+neuron+loss+in+Parkinson%27s+models%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Alpha-synuclein blocks ER-Golgi traffic and Rab1 rescues neuron loss in Parkinson's models.</a> Science. 313, 324-328 (2006).</li>
<li>Gitler, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beer+and+Bread+to+Brains+and+Beyond%3A+Can+Yeast+Cells+Teach+Us+about+Neurodegenerative+Disease%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosignals%22%5BJournal%5D)">Beer and Bread to Brains and Beyond: Can Yeast Cells Teach Us about Neurodegenerative Disease?</a> Neurosignals. 16, 52-62 (2008).</li>
<li>Gitler, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alpha-synuclein+is+part+of+a+diverse+and+highly+conserved+interaction+network+that+includes+PARK9+and+manganese+toxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Alpha-synuclein is part of a diverse and highly conserved interaction network that includes PARK9 and manganese toxicity.</a> Nat Genet. 41, 308-315 (2009).</li>
</ol>

利害の衝突は宣言されません。

ここでは、酵母における高スループットプラスミド過剰発現の画面を実行するためのプロトコルを提示する。このアプローチは、多くの異なる細胞の表現型の遺伝的修飾のための迅速かつ公平な審査が可能になります。このアプローチを使用して、研究者は数週間のうちに酵母ゲノムのかなりの部分を選別できます。この公平なアプローチは、以前の調査結果に基づいて予測されていない可能性が修飾子の識別、することができます。私たちは、人間の神経変性疾患のタンパク質19,21-23の集約に関連付けられている毒性の修飾子を識別するためにこのアプローチを使用している。しかし、により他の細胞プロセスを研究するためにこのプロトコルの適応性に、このプロトコルは、重要な生物学的な質問の広い範囲に対処する研究者にも有用でしょう。例えば、我々はまた、重金属や酸化的ストレスを含む環境ストレスへの適応に関与する遺伝子と経路を識別するためのこのスクリーニングのアプローチが有用な発見した。ここでは、1つのプラスミドライブラリ、酵母FLEXGeneライブラリ9日に焦点を当てている。しかし、また、これらの画面6,8を使用することができる利...

<table border="1"><tbody><tr><th>試薬の名前</th><th>会社</th><th>カタログ番号</th></tr><tr><td> BioRobot RapidPlate </td><td>キアゲン</td><td> 9000490 </td></tr><tr><td> 96ボルトレプリケータ（フロッガー） </td><td> V＆Pサイエンティフィック</td><td> VP404 </td></tr><tr><td> FLEXGene ORF図書館</td><td>プロテオミクスの研究所、ハーバードメディカルスクール</td><td></td></tr><tr><td>卓上遠心機</td><td>エッペンドルフ</td><td> 5810R </td></tr><tr><td> 500mLにバッフルフラスコ</td><td> Bellco </td><td> 2543〜00500 </td></tr><tr><td> 2.8Lトリプルバッフルフェルンバッハのフラスコ</td><td> Bellco </td><td> 2551〜02800 </td></tr><tr><td> 100μLRapidplateピペットチップ</td><td> Axygen </td><td> ZT - 100 - RS </td></tr><tr><td> 200μLRapidplateピペットチップ</td><td> Axygen </td><td> ZT - 200 - RS </td></tr></tbody></table>

ハイスループット酵母プラスミドの過剰発現の画面

High-throughput Yeast Plasmid Overexpression Screen

出芽酵母、 サッカロマイセスセレビシエは 、ヒトの疾患への直接的な関連性を有するものを含む多くの重要な細胞プロセス、の基本的なメカニズムを定義するための強力なモデルシステムです。で、短い世代時間と十分に特徴付けゲノムから、酵母のモデルシステムの主要experimental利点は、特定のプロセスに関与する遺伝子と経路を同定する遺伝子スクリーニングを実行する機能です。 30年間にわたってこのような遺伝子スクリーニングは、細胞周期、分泌経路、および真核細胞生物学1-5の多くの高度に保存された側面を解明するために使用されている。ここ数年では、酵母菌株とプラスミドのいくつかのゲノムワイドライブラリは6-10生成されている。これらのコレクションは、現在の利得と機能喪失型のアプローチ11-16を使用して遺伝子機能の系統的な尋問を可能にする。ここでは、5500酵母プラスミドのアレイライブラリを使用して、プラスミド過剰発現の画面を実行するために液体ハンドリングロボットによるハイスループット酵母の形質転換プロトコルを使用するための詳細なプロトコルを提供しています。我々は、凝集が発生しやすい人間の神経変性疾患のタンパク質の蓄積に関連付けられている毒性の遺伝的修飾を識別するために、これらの画面を使用している。ここで紹介する手法は、関心のある他の細胞の表現型の研究に迅速に適用可能であり。

ここではでプラスミド過剰発現の画面を説明<em&gt;サッカロマイセスセレビシエ</em&gt;、アレイプラスミドライブラリーと液体ハンドリングロボットによるハイスループット酵母の形質転換プロトコルを使用して。

出芽酵母であるSaccharomyces cerevisiaeは、多くの重要な細胞プロセスの基礎的なメカニズムを定義するための強力なモデルシステムであり、...

本手順の全体的な目的は、プラスミドDNAのアレイライブラリーを用いて酵母細胞を形質転換することです。まず、適切な量の酵母細胞を培養し、次に酢酸リチウムで処理することで、DNA形質転換に対するコンピテント細胞を作成します。次に、コンピテント細胞とDNAを混合し、形質転換を行います。本手順の最終ステップは、形質転換体の選択および解析です。最終的に、酵母スポットアッセイや顕微鏡観察を通じて、プラスミドDNAが酵母の表現型に及ぼす影響を示す結果を得ることができます。標準的な酵母形質転換などの既存のプロトコルと比較した本手法の主な利点は、多数の異なるプラスミドを自動化された形式で酵母細胞に形質転換できる点にあります。このハイスループット酵母形質転換プロトコルは96ウェルプレート10枚分を想定して設計されていますが、必要に応じてスケールアップまたはスケールダウンが可能です。より大規模な実験を行う場合、成功の鍵はすべてのプレートと試薬を整理して管理することです。混乱を避けるため、本プロトコルでは実験開始後、Biobot ラピッドプレートリキッドハンドラーを使用します。まず、アレイ酵母プラスミドライブラリ由来のプラズマDNAを、ラウンドボトム96ウェルプレートの各ウェルに 5 ～ 10 µL ずつ分注します。96ウェルプレートをカバーせず、クリーンベンチ内のドラフトフードに入れ、一晩乾燥させます。次に、500 mLのバッフル付きLin Meyerフラスコに入れ、200 mLの酵母ペプトンデキストロース（YPD）培地にクエリストレインを接種し、30 °Cで振盪しながら一晩インキュベートします。翌朝、最適な増殖を得るため、2 LのYPD培地を用いてクエリストレインをOD 600 = 0.1まで希釈します。別々の2.8 Lバッフル付きフラスコを用いて、1 Lまでの培養液を増殖させます。培養液のOD 600が0.8から1.0に達するまで、フラスコを30 °Cで4～6時間振盪します。酵母培養液のOD 600が0.8から1.0に達したら、遠心分離により細胞を回収します。使い捨ての225 mLコニカルチューブ4本に培養液を満たし、卓上遠心機を用いて3000 RPMで5分間遠心分離します。各チューブからS上清を捨てます。同じチューブにさらに培養液を加え、再び遠心分離を行い、すべての細胞を回収するまで必要に応じてこの操作を繰り返します。各細胞ペレットを50 millilitersのオートクレーブ滅菌蒸留水で洗浄し、ボルテックスで再懸濁します。細胞を1本の225 mLコニカルチューブにまとめ、3000 RPMで5分間遠心分離します。上清を除去した後、100 mLのリチウムアセテート溶液で細胞を洗浄します。再び3000 RPMで5分間遠心分離します。SNAを除去し、細胞ペレットを70 millilitersのリチウムアセテート溶液で再懸濁します。ペレットが完全に再懸濁されるまで、高速で約30秒間ボルテックスします。30 degrees Celsiusで30分間、振盪しながらインキュベートします。次に、0.1 Mのbeta me capto ethanolを加え、30 °Cでさらに30分間振盪しながらインキュベートします。30分間のインキュベーション後、煮沸して冷却したサーモン精子DNA 2 mLを細胞混合液に加えます。細胞混合液をオートクレーブ可能なシングルウェルプレートに注ぎ、その後、後続のピペッティングの妨げになる可能性があるため、形成された沈殿物をすべて取り除きます。Biobot rapid plateを用い、あらかじめ準備した血漿DNAを含む4枚の96ウェルプレートの各ウェルに、細胞混合液を50 µLずつ分注します。この際、混合しないでください。細胞のインキュベーション中、プレートを室温で30分間、振盪せずに静置します。PEG DMSO酢酸リチウム溶液を200 milliliters調製します。50% PEG 33,50を160 milliliters、DMSOを20 milliliters、1 molar酢酸リチウムを20 milliliters混合します。この溶液は、使用直前に調製することが重要です。それぞれに125 µLのPEGリチウムアセテートDMSO溶液を加えます。細胞懸濁液を8回ピペッティングして十分に混ぜ合わせます。室温で30分間、振盪せずにインキュベートします。次に、乾燥インキュベーター内で細胞を42 °Cで15分間ヒートショックさせます。ヒートショック後、プレートを重ねないようにしてください。96ウェルプレートに対応した遠心機アダプターを使用して、プレートを遠心分離します。遠心分離後、プレートを廃棄バケツの上で反転させてPEG溶液を除去します。その後、反転させたプレートをペーパータオルで吸い取ります。残留液体を除去するため、細胞をウェルの底に残します。各ウェルに200 µLの最小培地を加え、細胞を洗浄します。プレートを再度遠心分離します。廃棄バケツの上に倒して上清を除去し、ペーパータオルで吸い取ります。各ウェルに最小培地 200 µL を加え、プレートインキュベーターを用いて 30 °C で2日間、振盪せずに培養します。2日後、形質転換に成功した各ウェルの底に、小さな細胞コロニーが形成され始めます。Spattingアッセイの準備として、まず新しい平底96ウェルプレートの各ウェルに、OSEベースの最小培地を200 µLずつ分注します。次に、ラピッドプレートを用いて細胞懸濁液を8回吸引・分注し、形質転換プレートの各ウェルを混合します。ラフィノースプレートの各ウェルに、形質転換プレートから細胞混合液を5 µLずつ接種し、30 °Cで1日間インキュベートする。翌日、各ウェルの底に小さなコロニーが形成されているはずである。スポットアッセイはクリーンベンチ内で行います。96ピンレプリケーターまたはフロッガーを火炎滅菌します。フロッガーを用いてコロニーを混合し、選択培地プレートにスポットします。スポット後、プレートをクリーンベンチ内で5～10分間乾燥させます。プレートを30 °Cで2〜3日間インキュベートします。ここに示しているのは、TDP-43の毒性のサプレッサーおよびエンハンサーを特定するための酵母プラスミド過剰発現スクリーニングの代表的な結果です。TDP-43は、筋萎縮性側索硬化症（ALS）またはルーゲリッグ病の発症に関与しているヒトタンパク質であり、酵母細胞内でTDP-43を発現させると凝集と細胞毒性が引き起こされます。これらのプレートには、ガラクトース誘導性の T DP 43 プラスミドを組み込み、さらに flex 遺伝子 ORF 発現ライブラリー由来のプラスミドを形質転換したコロニーが表示されています。ここでは、赤色色素が蓄積する変異をこの株が持っているため、コロニーが赤色に見えます。左側のプレートにはグルコースが含まれており、これにより T DP 43 または flex 遺伝子プラスミドの発現が抑制されています。右側のプレートにはガラクトースが含まれており、これによりflex遺伝子プラスミドにおけるTDP 43およびO Fsの発現が誘導されます。緑色の矢印は、成長が速くコロニーの密度が高いことから、TDP 43の毒性を抑制するプラスミドが形質転換されたコロニーを示しています。赤色の矢印は、成長が遅くコロニーの密度が低いことから、TDP 43の毒性を増強するプラスミドが形質転換されたコロニーを示しています。このビデオを視聴することで、細胞由来の血漿DNAのアボイドライブラリを構築する方法について十分に理解することができます。

high-throughput-yeast-plasmid-overexpression-screen

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

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ハイスループット酵母プラスミドの過剰発現の画面

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