ハイスループット酵母プラスミドの過剰発現の画面
2011年7月27日
ここではでプラスミド過剰発現の画面を説明サッカロマイセスセレビシエ、アレイプラスミドライブラリーと液体ハンドリングロボットによるハイスループット酵母の形質転換プロトコルを使用して。
この手順の全体的な目標は、血漿DNAのアレイライブラリーで酵母細胞を形質転換することです。これは、最初に適切な量の酵母細胞を増殖させることによって達成されます。次に、酵母細胞を酢酸リチウムで処理して、DNA形質転換に適した状態にします。
次に、コンピテント電子細胞をDNAと混合して形質転換します。手順の最後のステップは、形質転換体を選択して解析することです。最終的には、酵母スポッティングアッセイや顕微鏡検査を通じて、酵母の表現型に対する血漿DNAの影響を示す結果を得ることができます。
標準的な酵母形質転換などの既存のプロトコルに対するこの技術の主な利点は、多数の異なるプラスミドを自動化された方法で酵母細胞に形質転換できることです。このハイスループット酵母形質転換プロトコルは、10 96ウェルプレート用に設計されていますが、それに応じてスケールアップまたはスケールダウンすることができます。大規模な実験では、成功の鍵はすべてのプレートと試薬を整理しておくことです。
実験が混乱を避けるために進行中であるとき、バイオボットの急速な版の液体の取扱い器はこのプロトコルで使用される アリコートを始めるために、円形の各井戸に配列のイーストプラスミドの図書館からの血漿DNAの5から10マイクロリットル。ボトム96ウェルプレート。覆われていない96ウェルプレートを清潔なベンチのヒュームフード内に一晩置いて乾燥させます。
次に、200ミリリットルの酵母ペプチドデキストロースまたはYPD培地を500ミリリットルのバッフルLin Meyerフラスコにクエリ株で接種し、翌朝振とうしながら摂氏30度で一晩インキュベートします。最適な成長のために、クエリ株を2リットルのYPD培地で0.1のOD600に希釈します。別々の2.8リットルの困惑フラスコで1リットルの文化まで成長します。
フラスコを摂氏30度で4〜6時間振とうし、培養物がOD600が0.8〜1.0に達するまで。酵母培養物がOD600が0.8〜1.0に達したら、遠心分離により細胞を回収します。4本の使い捨て225ミリリットルコニカルチューブに培養液を充填し、卓上遠心分離機で3000RPMを5分間回転させます。
各チューブからS上清を注ぎます。同じチューブにさらに培養物を加え、再び遠心分離し、すべての細胞が回収されるまで必要に応じて繰り返します。各細胞ペレットを50ミリリットルのオートクレーブ蒸留水で洗浄し、Resusはボルテックスして使用します。
細胞を1つの225ミリリットルの円錐管に結合し、3000RPMで5分間回転させます。S上清を取り除いた後、細胞を100ミリリットルの酢酸リチウム溶液で洗浄します。再び 3000 RPM で 5 分間回転します。
SNAを取り出し、セルペレットを70ミリリットルの酢酸リチウム溶液に再懸濁します。ペレットが完全に再懸濁するまで、約30秒間高速でボルテックスします。30°Cで30分間振とうしながらインキュベートします。
次に、β me captoエタノールを0.1モルに添加し、摂氏30度でさらに30分間振とうしながらインキュベートします。30分間のインキュベーション後、2ミリリットルのゆで冷やしたサケ精子DNAを細胞混合物に加えます。細胞混合物をオートクレーブ可能なシングルウェルプレートに注ぎ、下流のピペッティングを妨げる可能性があるため、形成された沈殿物をすべて取り除きます。
バイオボットのラピッドプレートを使用して、事前に調製した4つのウェルの各ウェルに50マイクロリットルの細胞混合物を分注します。 血漿DNAを含む96ウェルプレートは混合しません。細胞のインキュベーション中にプレートを室温で30分間振とうせずにインキュベートします。
200ミリリットルのPEG DMSO酢酸リチウム溶液を準備します。160ミリリットルの50%PEG 33、50 20ミリリットルのDMSOと20ミリリットルの1モル酢酸リチウムを組み合わせます。この溶液は使用直前に調製することが重要です。
それぞれに125マイクロリットルのPEG酢酸リチウムDMSO溶液を追加します。細胞懸濁液を8回吸引して分注することにより、よく混合します。振とうせずに室温で30分間インキュベートします。
次に、乾燥したインキュベーターで15分間、摂氏42度で細胞に熱衝撃を与えます、熱衝撃の後にプレートを積み重ねないでください、96ウェルプレートを収容するために遠心分離アダプターを使用してプレートを回転させます。遠心分離後、廃棄物バケツの上でプレートを反転させてPEG溶液を取り出します。次に、逆さのプレートをペーパータオルで拭きます。
残留液を除去するために、セルはウェルの底に残ります。それぞれに200マイクロリットルの最小限の培地を追加して、細胞をすすぎます。プレートを再びよく回転させます。
廃棄物バケツをひっくり返し、ペーパータオルで吸い取ります。各ウェルに200マイクロリットルの最小限の培地を加え、急速プレートで30°Cで振とうせずに2日間インキュベートします。2日後、形質転換に成功した各細胞の底に小さな細胞コロニーが形成され始めるはずです。
スパッティングアッセイの準備として、まず200マイクロリットルのOSEベースの最小培地を新しいフラットの各ウェルに分注します。ボトム96ウェルプレート。次に。形質転換プレートの各ウェルを、細胞懸濁液をラピッドプレートで8回吸引して分注することにより、混合します。
ラフィノースプレートの各ウェルに形質転換プレートからの5マイクロリットルの細胞混合物を接種し、摂氏30度で1日間インキュベートします。翌日に。それぞれの底に小さなコロニーが存在する必要があります。
フード内でスポッティングアッセイをしっかりと行い、96ボルト、レプリケーター、またはフロッガーをフレーミングで滅菌します。コロニーをフロッガーと混合し、選択的な培地プレートでコロニーを見つけます。スポッティング後、プレートをフード内で5〜10分間乾燥させます。
プレートを摂氏30度で2〜3日間インキュベートします。ここに示されているのは、TDP 43.Toxicityのサプレッサーとエンハンサーを特定するための酵母プラスミドオーバー発現スクリーニングの代表的な結果です。TDP 43は、筋萎縮性側索硬化症またはルー・ゲーリック病の病因に関与しているヒトタンパク質であり、酵母細胞でTDP 43を発現し、凝集および細胞毒性をもたらします。
これらのプレートは、統合されたガラクトース誘導性T DP 43プラスミドを持つコロニーを示し、flex遺伝子ORF発現ライブラリーからのプラスミドでも形質転換されています。ここのコロニーは、株がたまたま赤い色素の蓄積をもたらす突然変異を持っているため、色が赤く見えます。左のプレートにはグルコースが含まれており、T DP 43またはflex遺伝子プラスミドの発現を抑制します。
右のプレートにはガラクトースが含まれており、これによりフレックス遺伝子プラスミドのTDP 43とO Fsの発現が誘導されます。緑色の矢印は、増殖の速さとコロニーの密度が高いことからわかるように、TDP 43の毒性を抑制するプラスミドで形質転換したコロニーを示しています。赤い矢印は、成長が遅く、密度の低いコロニーが示すように、TDP 43の毒性を高めるプラスミドで形質転換されたコロニーを示しています。
このビデオを見た後、血漿DNAの回避ライブラリを形質転換する方法をよく理解しているはずです DNA de 細胞。
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概要
この記事では、高スループット酵母形質転換プロトコルを利用したSaccharomyces cerevisiaeにおけるプラスミド過剰発現スクリーニングについて説明します。このプロセスでは、酵母の表現型への影響を分析するために、プラスミドDNAのアレイライブラリで酵母細胞を形質転換します。
研究の主要構成要素
科学の分野
- 微生物学
- 遺伝学
- 細胞生物学
背景
- プラスミド過剰発現スクリーニングは遺伝子機能の研究に不可欠です。
- Saccharomyces cerevisiaeは遺伝学研究のモデル生物として機能します。
- 高スループット法は遺伝子形質転換の効率を向上させます。
- 酵母の表現型を理解することで、より広範な生物学的プロセスへの洞察が得られます。
研究の目的
- プラスミドDNAで酵母細胞を形質転換し、遺伝子機能を評価すること。
- 高スループット形質転換のために液体処理ロボットを利用すること。
- 形質転換体における表現型の変化を分析すること。
使用した方法
- 酵母細胞を適切な密度まで培養します。
- 細胞をリチウム酢酸で処理して形質転換のためのコンピテンスを誘導します。
- コンピテント細胞をプラスミドDNAと混合して形質転換を行います。
- 形質転換体を酵母スポッティングアッセイと顕微鏡を用いて選択し、分析します。
主な結果
- プラスミドDNAによる酵母細胞の成功的な形質転換。
- 形質転換体の表現型の変化の同定。
- 高スループット法の有効性の実証。
- 酵母における特定の遺伝子の機能的役割に関する洞察。
結論
- プラスミド過剰発現スクリーニングは遺伝子分析のための貴重なツールです。
- 高スループット技術は酵母遺伝学研究の効率を大幅に向上させることができます。
- 結果は遺伝子機能と制御の理解に貢献します。
よくある質問
Executive Industry Relevance
High-throughput yeast plasmid overexpression screens enable systematic identification of genetic modifiers impacting cellular phenotypes relevant to human disease. This scalable approach supports early-stage target validation and mechanistic de-risking by leveraging a well-characterized eukaryotic model. Integration of automated liquid handling accelerates discovery inflection points and portfolio triage in biopharma R&D.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of gene function and pathway involvement in disease-relevant phenotypes.
- Supports identification of genetic suppressors and enhancers for mechanistic de-risking.
- Facilitates functional target validation through systematic gain-of-function screening.
- Provides predictive confidence for prioritizing targets in complex biological systems.
Screening & Assay Development
- Prepares validated yeast systems for downstream high-throughput screening workflows.
- Standardizes assay conditions using automated liquid handling for reproducibility.
- Generates quantitative phenotypic outputs for reliable compound or genetic evaluation.
- Enables scalable screening of thousands of plasmids in parallel for robust data generation.
Translational & Preclinical Research
- Aligns yeast phenotypes with human disease mechanisms for translational continuity.
- Supports identification of genetic modifiers relevant to neurodegenerative disease models.
- Provides a platform for risk-adjusted advancement of targets into preclinical validation.
- Offers predictive de-risking value by modeling aggregation-prone protein toxicity.
Pipeline & Workflow Integration
This high-throughput yeast transformation protocol bridges early discovery and lead identification by enabling systematic genetic screens with direct translational relevance.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification for disease mechanisms.
- Screening: Delivers assay-ready, reproducible yeast models for high-throughput evaluation.
- Analytics: Provides quantitative colony growth and density measurements for comparative analysis.
- Translational Research: Connects yeast-based findings to preclinical disease models when aligned with human protein toxicity.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable, scalable screening capability for diverse phenotypic endpoints.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Enhances standardization, reproducibility, and throughput via automation.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by enabling robust early-stage screens.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of validated targets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in yeast genetics and high-throughput screening protocols.
- Depends on access to liquid handling robotics and 96-well plate infrastructure.
- Necessitates cross-team standardization of assay setup and data analysis.
- Adaptable to various phenotypes but may require optimization for specific readouts.
- Scalability and reproducibility depend on rigorous plate and reagent management.
