Name: げっ歯類で心的外傷後てんかん原のアンダーカットモデルを準備 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-09-15T12:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 58 s
Description: 学ぶ げっ歯類で心的外傷後てんかん原のアンダーカットモデルを準備する方法。カスタム外科デバイスを用いて精度と再現性を向上させ、脳皮質に扇状の病変を作成し、てんかん活動を評価する信頼性の高い動物モデルを構築します。

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この作品は、健康のインディアナ国務省から脊髄や脳傷害研究資金からNIH / NINDS助成4R00 NS 057940、および助成金SCBI 200から12でサポートされていました。

1。アンダーカット手術のためのシンプルなデバイスを作る<ol><li>我々が作成したアンダーカット装置は三つの部分（図1）で構成されています：誘導管の添付ファイルと針を可能にし、手術中に頭蓋窓を介して座っているステンレススチールまたはプラスチック製（1）支持板（2）位置および許可の針の回転で針を保持する誘導管、および先端から約3 mmに90度曲がっている（3）針、および回転および挿入によって移動可能である。 </li><li>支持板を作るために厚さ1〜1.5ミリメートルの一部、7〜10 × 30ミリメートルの長方形ステンレス製または透明プラスチック（1）カット。 1.5インチ22ゲージ（BD会社、＃305156）と1.5インチの25ゲージ（BD会社、＃305127）シリンジの針を準備します。誘導管を作るために、プラスチックの端とその合計の長さが31〜32ミリメートル（2）についてになるように22ゲージの注射針の下針の先端を切断。砂、金属の端を、それが平らで滑らかにする。この誘導管の最後の長さは25ゲージの注射針に比べ約5〜6ミリメートル短くしてください。 </li><li>針は、金属のエッジに対して垂直であることを確認し、支持板の上に誘導管を固定するシアノアクリレート接着剤を使用してください。 </li><li>誘導管に25ゲージ注射針を挿入し、先端（図1）2.5〜3ミリメートルで針を90度曲げる。 </li><li>針の上の端（図1、針の停止）に接着する小さなプラスチック製のチューブで針の垂直方向の移動範囲を調整します。針の最終的な移動範囲は、針を皮質に挿入する方法を深く決定し、P21ラットとP21マウスの1.3〜1.5ミリメートルのための1.6〜1.8ミリメートルでなければなりません。この長さは、異なる種や動物の年齢のために調整する必要があります。 </li><li>曲がった先端（図1針の指標）と同じ方向に針の上端に小さな銅線またはテープの小片を取り付けます。ワイヤーやテープは、アンダーカット手術（図1）中の針の回転角度を示します。 </li></ol> 2。動物の準備<ol><li>すべての手術器具は、ガラスビーズ滅菌器、または70％エタノールで消毒と滅菌、オートクレーブする必要があります。 </li><li>同じ年齢で22日間（P20 - 22）またはCD1マウスに - 私たちは、出生後20歳でのSprague / Dawleyラットを使用してください。マウスやラットの異なる株は、特定のプロジェクトのために使用することができます。 </li><li>ケタミン80 mg / kgとキシラジン8 mg / kgの腹腔内注射したマウスを麻酔。動物は、尾のピンチに応答しない後に手術が開始されます。手術中は、必要に応じて、麻酔薬のカクテルの三分の一元用量のブースター投与量は、元の麻酔の状態を復元するために与えることができます。 </li><li>電気毛のトリマーと動物の頭皮の毛をカット。麻酔中の乾燥からの保護のための動物の眼に眼軟膏の少量を適用します。 70％エタノールに続く10パーセントポビドンヨード溶液を、使用して頭皮を消毒する。 </li><li>安定した固定位置に頭部を保持する定位固定装置の上に動物をマウントします。手術中、私たちは低体温を防ぐために加熱パッドで動物を維持する。 </li><li>ラムダから目の間に伸びる、メスを用いて頭皮上正中前後切開を加えます。わきの皮膚を引っ張ると十分に左頭蓋骨を露出させる止血を使用してください。 </li><li>左頭蓋骨の長方形のカットを確認し、骨膜を掻きにメスを使用。このステップでは、出血を減らし、頭蓋骨にドリルを容易にするでしょう。 </li></ol> 3。アンダーカットを作る<ol><li>露出した頭蓋骨のエリアへの滅菌生理食塩水を少量追加し、その後、血液をきれいにし、エリアを乾燥させるいくつかの綿棒を使用してください。 </li><li>手術用顕微鏡下で、左側の頭蓋骨の中心（約左感覚運動皮質上記）の長方形の溝（ラットでは〜5 × 7 mmの、マウスの4 × 5 mm）を掘削開始。頭蓋骨に生理食塩水の滴を適用すると、掘削を容易にし、熱を放散する。掘削された骨の約2 / 3の深さの後に、過剰な生理食塩水を削除し、Q -ティップで掘削エリアを清掃してください。骨のセンターピースは、鉗子の優しいタッチ時に移動可能になるまで、ゆっくりと慎重に深くドリル。 </li><li>慎重に骨の縁に鉗子の鋭い先端を挿入し、ゆっくりと左半球を公開するために鉗子を持ち上げて、骨の中央部分を削除してください。 </li><li>手術用顕微鏡下で、針の先端とターゲット皮質領域の可視化を維持するために矢状方向に針と正中線への支持プレートに垂直、傾斜デバイス少し尾側アンダーカットデバイスをホールドし、向き。頭蓋窓の真ん中に、上矢状縫合の外側領域に1〜2ミリメートルに針の先端を目指し、大型船の直接侵入を避ける。 </li><li>血管を倹約するように硬膜を介してと軟膜下の水平方向に針を挿入します。アンダーカット装置の底部に座る頭蓋窓の両方のエッジ上に針を皮質表面（図1）に通常の配置されるように。手で頭蓋窓の両方のエッジでデバイスを置くと、大幅に、次の手順の実行中に手ぶれを軽減または排除されます。 PIAの下に針を持ち上げ、その後徐々に針が深く行くことができないまで、皮質間のカットを作成するために下げる。 °離れてVIは、アンダーカットの半円形の白質/深い層を作成するには、正中線から〜135を回転させる。その後、PIAの下に再び針を上げる。後方デバイスを傾け、針を撤回する。 </li><li>それに付随して、上記の手順（ステップ2.5）繰り返すが、ウィンドウの横方向の端で追加の皮質間のカットを作成するように針を回すことなくできます。これにより、より完全な皮質分離が作成されます。 </li><li>保護のための頭蓋窓の上にプラスチックフィルム（6 × 6 mm）の部分を置き、頭皮を縫合。完全に麻酔から回復するまで加熱されたパッドの上に動物を置きます。 </li></ol> 4。代表的な結果： コロナ皮質スライスは、アンダーカット手術の成功を確認するために調製することができる。 &gt; 2週間、手術後の準備のスライスでは、皮質間のとアンダーカットは、顕微鏡の低消費電力の目標（図2）の下に認められるです。部分的に分離された皮質は、通常わずかに薄くなり、てんかん様の活動は、フィールドの潜在的な記録（図3）と皮質スライスの大部分で検出することができます。 対照的に、白質のまたは深く皮質層に大きな穴、病変皮質の間伐劇的な、または上または下白質は、さらなる実験のための脳が使用できなくなるだろうという誤ったカットの形成。 <img src="/files/ftp_upload/2840/2840fig1.jpg" alt="図1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図1"> 図1。アンダーカット装置の構造と応用。導くチューブ（2）ステンレス鋼または透明プラスチックで作られて支持板（1）の上に接着される。注射針（3）先端まで〜3 mmの誘導管や曲がりが挿通されている。針は、プラスチックチューブ製の停止は、針の垂直方向の移動範囲が約1.2 mmとそれぞれP21マウスとラットでの使用のための〜1.5 mmに制限されているように、針の上端に接着される。小さな銅線のセグメントは、曲がった針の方向のための針の指標として、ハンドルの下に締結されている。カットが軟膜表面に平行に行われるようにデバイスを傾けると頭蓋窓のエッジの両方に接触していることに注意してください。 <img src="/files/ftp_upload/2840/2840fig2.jpg" alt="図2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図2"> 図2。アンダーカットスライスの代表画像。 P48ラットにおけるアンダーカットの病変の後二週間を作製したスライスのA.蛍光画像。カット傷は蛍光色素のDIIによって標識した。右側の白い矢印は、皮質間のカットを示しており、底部の矢印は、IV層と白質の間の境界も合格したことをアンダーカットを示している。 <img src="/files/ftp_upload/2840/2840fig3.jpg" alt="図3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図3"> 図3。アンダーカットの脳のスライスからアンダーカットスライス。フィールドの潜在的な録音からフィールドの潜在的な記録は、損傷した皮質組織の興奮を示唆し、てんかん様活性を示した。

<ol><li>Hoffman, S. N., Salin, P. A., Prince, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+neocortical+epileptogenesis+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Chronic neocortical epileptogenesis in vitro.</a> J Neurophysiol. 71, 1762-1773 (1994).</li>
<li>Topolnik, L., Steriade, M., Timofeev, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyperexcitability+of+intact+neurons+underlies+acute+development+of+trauma-related+electrographic+seizures+in+cats+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Hyperexcitability of intact neurons underlies acute development of trauma-related electrographic seizures in cats in vivo.</a> Eur J Neurosci. 18, 486-496 (2003).</li>
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<li>Nita, D. A., Cisse, Y., Timofeev, I., Steriade, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+propensity+to+seizures+after+chronic+cortical+deafferentation+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Increased propensity to seizures after chronic cortical deafferentation in vivo.</a> J Neurophysiol. 95, 902-913 (2006).</li>
<li>Sharpless, S. K., Halpern, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+electrical+excitability+of+chronically+isolated+cortex+studied+by+means+of+permanently+implanted+electrodes%5BTitle%5D)+AND+%22Electroencephalogr+Clin+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">The electrical excitability of chronically isolated cortex studied by means of permanently implanted electrodes.</a> Electroencephalogr Clin Neurophysiol. 14, 244-255 (1962).</li>
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<li>Prince, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epileptogenic+neurons+and+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Neurol%22%5BJournal%5D)">Epileptogenic neurons and circuits.</a> Adv Neurol. 79, 665-684 (1999).</li>
<li>Marin-Padilla, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+neuropathology+and+impact+of+perinatal+brain+damage.+II%3A+white+matter+lesions+of+the+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuropathol+Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Developmental neuropathology and impact of perinatal brain damage. II: white matter lesions of the neocortex.</a> J Neuropathol Exp Neurol. 56, 219-235 (1997).</li>
<li>Jin, X., Prince, D. A., Huguenard, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+excitatory+synaptic+connectivity+in+layer+v+pyramidal+neurons+of+chronically+injured+epileptogenic+neocortex+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Enhanced excitatory synaptic connectivity in layer v pyramidal neurons of chronically injured epileptogenic neocortex in rats.</a> J Neurosci. 26, 4891-4900 (2006).</li>
<li>Li, H., Prince, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+activity+in+chronically+injured%2C+epileptogenic+sensory-motor+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Synaptic activity in chronically injured, epileptogenic sensory-motor neocortex.</a> J Neurophysiol. 88, 2-12 (2002).</li>
<li>Salin, P., Tseng, G. F., Hoffman, S., Parada, I., Prince, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axonal+sprouting+in+layer+V+pyramidal+neurons+of+chronically+injured+cerebral+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Axonal sprouting in layer V pyramidal neurons of chronically injured cerebral cortex.</a> J Neurosci. 15, 8234-8245 (1995).</li>
<li>Avramescu, S., Nita, D. A., Timofeev, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neocortical+post-traumatic+epileptogenesis+is+associated+with+loss+of+GABAergic+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurotrauma%22%5BJournal%5D)">Neocortical post-traumatic epileptogenesis is associated with loss of GABAergic neurons.</a> J Neurotrauma. 26, 799-812 (2009).</li>
<li>Avramescu, S., Timofeev, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+strength+modulation+after+cortical+trauma%3A+a+role+in+epileptogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Synaptic strength modulation after cortical trauma: a role in epileptogenesis.</a> J Neurosci. 28, 6760-6772 (2008).</li>
</ol>

利害の衝突は宣言されません。

アンダーカットモデルは、心的外傷後てんかんを研究するための非常に効率的なシステムです。典型的な手術が終了するのは約20〜30分かかり、誘発または自発的なてんかん様活動二週間手術1月2日後にほとんどの動物からのスライスに記録することができます。さらに重要なことは、このモデルでは、出血、炎症、浮腫、軸索切断や神経細胞死7などの外傷性脳損傷後の変化の側面を模倣している。だけでなく、てんかん様活動は、げっ歯類や他の動物で観察されているだけでなく、てんかん発作は、同等の皮質病変8に苦しむヒトで報告されている。大きな進展は近年の基礎となるメカニズムを解明するためになされている。自発、誘発発作てんかん様放電は、&gt; 2週間病変後の脳切片に記録されており、これらの活動は、ラット皮質層V 1に由来することが見出された。回路の再編成、GABA作動性介在ニューロンと脱抑制の喪失、神経細胞の膜興奮性の増加、および興奮性シナプス結合の増加の証拠はまた、特に皮質層V 2,9-13で、実証されている。 <p class="jove_content...

<table border="1"><tbody><tr><td> 材料名 </td><td> タイプ </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td></tr><tr><td> Foredomマイクロモータキット</td><td>機器の</td><td> Foredom </td><td> K.1070 </td></tr><tr><td> 1.5インチ22ゲージの注射針</td><td>材</td><td> BDの会社</td><td> 305156 </td></tr><tr><td> 1.5インチ25ゲージの注射針</td><td>材</td><td> BDの会社</td><td> 305127 </td></tr><tr><td>シアノアクリレート接着剤</td><td>材</td><td>テッドペラ</td><td> 14450 </td></tr></tbody></table>

げっ歯類で心的外傷後てんかん原のアンダーカットモデルを準備

Preparing Undercut Model of Posttraumatic Epileptogenesis in Rodents

部分的に分離された皮質が（&quot;アンダーカット&quot;）外傷後てんかんの動物モデルである。外科手術は大脳皮質の特定領域は、主に隣接する皮質と1-3皮質下の領域から分離されるように（アンダーカット）の白質の下に感覚運動皮質を切開して行います。手術後2週間以上の待ち時間の後に、てんかん様放電は、げっ歯類1からの脳切片に記録することができ、電気的または行動発作は、ネコやサル4-6と他の種からin vivoで観察することができます。この確立された動物モデルは、生成するために効率的ですし、外傷性脳損傷のいくつかの重要な特徴を模倣しています。しかし、それは技術的にフリーハンドを持つ小型の齧歯類の脳で正確な皮質病変を作るしようと挑戦している。最初にスタンフォード大学1でデビッドプリンスの研究室で確立された手順に基づいて、ここで我々はマウスおよびラットにおけるこのモデルの準備のための手術を実行するための改良手法を提案。我々は単純な手術装置を作ると、より正確で一貫性のある結果を生成するために深さと角度を切るのよりよい制御を得るためにそれを使用する方法を示します。デバイスは、作るのは簡単です、と手順を学ぶために迅速です。この動物モデルの生成は、外傷後てんかん発生のメカニズムに関する研究のための効率的なシステムを提供します。

部分的に分離された皮質が（&quot;アンダーカット&quot;）外傷後てんかんの効率的な動物モデルである。ここでは、新たな外科手術デバイスを作成し、このモデルを生成するために、より正確で一貫性のある病変を作ってそれを使用する方法を示します。

部分的に分離された皮質（アンダーカット）は、外傷後てんかん発生の動物モデルである。手術手順では、...を切断し、

本手順では、ラットにおける外傷後てんかん発生のアンダーカットモデルの作製方法を説明します。まず、アンダーカット手術の精度と一貫性を向上させるための簡易的なデバイスを作製します。次に、動物を手術の準備状態にし、脳にアクセスするための頭蓋窓を頭蓋骨表面に開けます。最後に、アンダーカットデバイスの針を大脳皮質の白質に挿入し、回転させて標的領域に扇形のアンダーカットを作成します。最終的に、電位記録を通じて脳スライスにおけるてんかん様活動を示す結果を得ることができます。この手法の主な利点は、シンプルな特製の手術器具を用いることで、より精密かつ一貫した索状衝突（cord collision）が可能になることです。この動物モデルは、外傷性脳損傷後のてんかん原性に関する重要な疑問を解決するために利用できます。この手法はラットで頻繁に用いられますが、マウスにも適用可能です。一般的に、この手法に不慣れな方は、フリーハンドで齧歯類の大脳皮質にこのような精密な病変を作成させることに困難を感じます。この手術器具は、支持プレート、ガイドチューブ、および先端付近で90度に曲げられた針の3つの部品で構成されています。生後3〜4週齢のラットの手術用アンダーカットデバイスを準備するには、まず、厚さ1〜1.5 mm、サイズ7〜10 × 30 mmの長方形のステンレス鋼または透明プラスチックの断片を切り出します。支持プレートを作成するために、25Gおよび22Gの注射針を用意し、25G針の長さを測定します。次に、22ゲージ針のプラスチック端を切断し、針の全長を測定します。その後、ガイドチューブの最終的な長さが25ゲージ注射針よりも5～6 mm短くなる位置で22ゲージ針を切断します。端を研磨して平らに整えます。シアノアクリレート系接着剤を使用して、針が支持プレートに対して垂直かつ端から均等な位置にあることを確認しながら、ガイドチューブを支持プレートに固定します。25ゲージの注射針をガイドチューブに挿入し、針先から2.5〜3mmの箇所で針を90度に曲げます。最後に、曲げた針先と同じ方向に、小さな銅線または小さなテープ片を針の上端に取り付けます。ワイヤーまたはテープは、アンダーカット手術中における針の回転角を示します。本手順を開始する前に、施設内の動物実験委員会に相談し、以下の手順に必要な承認を得てください。まず、すべての手術器具が承認された方法で滅菌されており、手術のための滅菌領域が確保されていることを確認してください。承認済みのプロトコルに従って動物を麻酔し、尾つまみ試験を行って完全に麻酔がかかっていることを確認します。電気バリカンを使用して、切開部位周辺の頭皮を剃毛します。その後、10%ポビドンヨード溶液で頭皮を消毒し、続いて70%エタノールで消毒します。動物の眼が乾燥するのを防ぐため、眼科用軟膏を塗布します。手術中は、頭部を固定して安定した状態に保つため、動物を脳定位固定装置に装着してください。低体温症を防ぐため、動物をヒートパッドの上に保持することが推奨されます。メスを用いて、ラムダから両眼の間まで、頭皮に正中線に沿った前後方向の切開を加えます。次に、止血鉗子を使用して皮膚を横に避け、頭蓋骨の左側を十分に露出させます。メスを用いて頭蓋骨の左側に長方形の切り込みを入れ、骨膜を掻き出します。この工程により、出血を抑え、頭蓋骨へのドリリングを容易にします。まず、滅菌生理食塩水と数本の綿棒を使用して頭蓋骨を清浄し、血液を除去して患部を乾燥させます。次に、頭蓋骨の左側中央に滅菌生理食塩水を1滴滴下します。次に、頭蓋骨の左側中央に4×5 mmの長方形の溝を作るためにドリリングを開始します。骨の深さの約3分の2までドリリングした後、過剰な生理食塩水を拭き取り、綿棒でドリリング部位を清掃します。ゆっくりと慎重にドリリングを続け、中央の骨片がピンセットで軽く触れただけで動く状態になるまで深く掘り進めます。アンダーカットデバイスを保持したまま、ピンセットで骨片をそっと掴んで骨窓をゆっくりと持ち上げ、左半球を露出させて、中央の骨片を慎重に取り除きます。針を傍矢状方向に、支持プレートを正中線に垂直になるように配置します。太い血管を避けながら、頭蓋窓の中央で、上矢状縫合から外側に1～2 mmの位置に針先を向けます。次に、硬膜を貫通し、ピアの下を通るように針を水平方向に挿入します。血管への損傷を避けるため、アンダーカットデバイスの底部を頭蓋窓の両端にセットし、針が皮質表面に対して垂直になるように配置します。針をわずかに持ち上げて、ピアの下にあることを確認してください。次に、針をゆっくりと下げて、針がそれ以上進まなくなるまで皮質横断的な切開を行います。続いて、針を正中線から遠ざかる方向へ180度回転させ、白質深層第6層に半円形のアンダーカットを作成します。最後に、針がピアの下に位置するまで、再び針を引き上げます。次に、アンダーカットデバイスを後方に傾け、針を抜きます。保護のため、頭蓋窓の上にプラスチックフィルムを貼付します。その後、止血鉗子のクリップを外し、必要に応じて滅菌生理食塩水で頭皮を湿らせ、元の位置に戻します。切開部を縫合して閉じます。その後、動物を脳定位固定装置から外し、麻酔から回復するまでヒートパッドの上に置きます。動物をホームケージに戻した後は、該当するIA iacucプロトコルで規定されている鎮痛処置を必ず行ってください。ここでは、アンダーカット手術の成否を評価するために、処置の2週間後に作製した皮質の冠状切片を示しています。顕微鏡の低倍率対物レンズ下で、経皮質切開およびアンダーカット切開が確認できます。この電位記録により、部分的に隔離された皮質における誘発電位活動が明らかになります。この手法を習得すれば、適切に実施することで約30分で完了させることができます。なお、この処置を試みる際は、手術前に手術器具の使用方法を練習しておくことが重要です。このビデオを視聴することで、げっ歯類における外傷後てんかん原性の未切断モデルの調製方法について、十分な理解が得られるはずです。

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