マウス卵母細胞のマイクロインジェクション、成熟および倍数性評価

本手順の全体的な目的は、実験的操作後の減数分裂第二分裂中期卵細胞を評価することである。まず、性成熟したプライミング済み雌マウスから十分に成熟した卵細胞を回収する。次に、目的のタンパク質を摂動させるために選択した物質を卵細胞にマイクロインジェクションし、in vitroで減数分裂第二分裂中期まで成熟させる。続いて、マントロ（mantro）で処理して卵細胞における染色体スプレッディングを誘導し、単極紡錘体を形成させる。

最終的に、これらの結果により、免疫蛍光染色および共焦点顕微鏡を用いて卵子の倍数性状態を記述することができます。この手法は、流動性へと導く分子メカニズムの解明など、生殖生物学および染色体分離分野における重要な疑問への回答に寄与します。マイクロインジェクションの手法は、文章では伝えにくいステップが複数あるため習得が困難であり、本手法を視覚的に提示することが極めて重要です。各マウスから単離される胞状卵胞の数を最大化するため、性成熟した雌マウスの腹腔内に5 IUの妊畜用ヒト絨毛性ゴナドトロピンを注射します。

PMSG投与から約48時間後、マウス1匹あたり3 mLの回収培地を37 °Cで加温して平衡化させます。培養液1 mLを少なくとも1時間平衡化させます。ペトリ皿にそれぞれのマイクロドロップを作成し、ミネラルオイルで被覆します。

次に、培養液が入ったディッシュをインキュベーターに、回収用培地が入ったディッシュをスライドウォーマーに置きます。マウスを安楽死させ、卵巣を摘出して、あらかじめ温めておいた回収用培地を入れた時計皿に移します。

1 mLのインスリン用注射器を用いて卵巣をディッシュに固定し、結束させた27Gの針で数回穿刺して、胞状卵胞から卵子を放出させます。解剖顕微鏡下で、口操作式のガラスピペットを用いて卵丘細胞複合体を回収します。この際、大きな胞状卵胞のみを回収し、より小さい前胞状卵胞や裸卵子は回収しないでください。

卵母細胞の直径よりわずかに大きい小型ピペットを用いて、複合体をあらかじめ調製した回収培地の一滴に移行させます。複合体から卵丘細胞を除去します。除卵丘卵母細胞をより大きなピペットで、培養培地の一滴に移行させます。

操作の前に、インキュベーター内で卵母細胞を少なくとも1時間回復させます。メカニカルプラーを用いてホウケイ酸ガラスキャピラリーチューブを延伸し、注入用ピペットを作成します。1ウェルチャンバースライドからメディアチャンバーを取り出します。

マイクロインジェクションプラットフォームを作成するには、5 µLの回収用培地のドロップを、0.5 µLのSIR N-A-C-R-N-Aまたはモルフォリノオリゴヌクレオチド注入材のドロップにできるだけ近づけて配置し、ミネラルオイルで覆って顕微鏡ステージに置きます。注入用ピペットと保持用ピペットをホルダーにセットし、回収用培地のドロップ内に配置します。ピコインジェクターと防振台に接続されている窒素タンクのバルブを開きます。

培地で満たす際、インジェクションピペットの先端をホールディングピペットに軽く当てて開放します。インキュベーターから5〜10個のoocyteを、プラットフォーム上の回収培地ドロップに移動させます。次に、pico injectorのパラメータを注入量5〜10 picolitersに設定し、「clear」を押します。

注入針を材料滴に移動させて充填します。その後、注入針を培地滴に戻します。ホールディングピペットを用いて卵母細胞を捕捉し、注入針、卵母細胞、ホールディングピペットをx軸に沿って一直線に並べます。

より高い倍率で、核を避けるように注意しながら、注入ピペットを卵母細胞に挿入します。細胞膜を貫通したら、「inject」を押して注入し、その後針を抜き、卵母細胞を放して、この操作を繰り返します。すべての卵母細胞への注入が完了したら、それらをインキュベーターに戻し、通常12から24時間までの任意の時間、培養液中で保持します。

次に、細胞を数滴のCZBで洗浄し、オイル下のCZBマイクロドロップに移行させ、減数分裂第二分裂の中期まで成熟させるため16時間インキュベートします。外周リングに水を入れた器官培養ディッシュのウェルに、100 µMのMastriを含む750 µLのCZBを入れます。卵細胞をMastri添加CZBの数滴で洗浄した後、器官培養ディッシュに移行し、1時間インキュベートします。

PBSで調製した2%パラホルムアルデヒドを含む時計皿に入れ、室温で20分間卵を固定します。次に、卵をブロッキング溶液に移し、室温で15分間の透過処理を行うまで4°Cで保存します。その後、多量のブロッキング溶液で数回洗浄します。

残りの手順は、加湿チャンバー内で遮光した96ウェルプレートの蓋の上で行います。室温にて、卵子を25 µLのブロッキング溶液のドロップに移し、15分間置きます。次に、セントロメアを標識するため、1:40に希釈したCrest抗血清を含むブロッキング溶液のドロップに卵子を移し、少なくとも1時間インキュベートします。

次に、ブロッキング溶液を3滴ずつ順に流して洗浄し、それぞれ15分間インキュベートします。卵をfluoro four結合抗体を含むブロッキング溶液の滴に移し、1時間インキュベートします。2回洗浄し、染色体を検出するためにブロッキング溶液を加えます。

cytx greenとブロッキング溶液を1:5,000に希釈した溶液でインキュベートし、5 µLのVector Shieldを用いてサンプルを封入します。卵子が潰れるのを防ぐため、カバーガラスの角が当たる予定の位置に、少量のワセリンを4点配置します。カバーガラスを載せ、マニキュアで封止し、共焦点顕微鏡で処理するまで4 °Cのスライドボックスで保存します。100x対物レンズを用いてイメージングし、Z平面で0.4 µmステップでキャプチャし、中期領域全体をイメージングして、NIHのImage Jなどのイメージングソフトウェアを用いて中心体数をカウントします。正常倍数のマウス卵子には20対のキネトコアが含まれており、この正常倍数の中期II卵子のZ投影図では、合計40個のスポットが観察されます。DNAは緑色に、キネトコアは赤色に染色されています。

矢印は、微量注入処置後にキネトコア番号17および18で重複していることを示す2つの異なるクロマチド腕を指しています。目的タンパク質の摂動が減数分裂の成熟や発育能にどのように影響するかといった追加の疑問に答えるために、ウェスタンブロッティング、リアルタイムPCR、紡錘体構成および染色体整列の評価、体外受精などの他の手法を実施することができます。このビデオを視聴することで、すべての部位を操作し、中期2期のPLOを評価する方法について十分に理解できるはずです。