盲腸結紮穿刺手順

こんにちは。テンプル大学微生物学・血液学部のDena博士の研究室に所属しているMiguel Toscanoです。本日は、C 57 Black 6マウス系統を用いて、iCal塞栓および穿刺モデルを構築する方法をご紹介します。当研究室では、ヒトの敗血症を模倣するためにこのモデルを使用しています。

基本的に、このモデルは血清を穿刺して糞便物質を腹腔内に放出させ、多菌種性敗血症を誘発することで、免疫反応を増悪させるものです。このモデルでは、多くの臓器やさまざまな細胞型に不可逆的な損傷が生じ、最終的に動物を死に至らしめる可能性があります。

それでは始めましょう。マウスの麻酔についてです。最初のステップは、腹腔内注射による動物の麻酔です。

ケタミンとキシラジンの1:1混合液を用います。マウスに噛まれるのを防ぎ、またマウスを傷つけないように、片手で尾を掴みます。もう一方の手で、マウスを床に押し付けます。

次に、マウスの後頭部をつかみ、動物を仰向けにして腹部を露出させます。29ゲージのインスリン用注射器を用いて、腹腔内に麻酔剤を20から30 µL注入します。処置に向けたマウスの準備として、マウスの後方を保持し、尾または脚で固定しながら腹部の毛を剃ります。

マウスに痛みの感受性がないことを確認し、その後、腹部を消毒します。まずベタジン溶液で洗浄し、続いてイソプロピルアルコール拭き取りシートで1分間以上拭き取ります。開腹術の実施：開腹術を行うため、ピンセットで腹部中央の皮膚を持ち上げ、長さ約1 cmの小さな切開を加えます。

次に、会陰部を挙上し、さらに小さな切開を加えて腹腔を露出させます。曲線鉗子を用いて腹膜を保持します。腹膜を通して盲腸を導き出し、盲腸を特定して露出させます。

腹部の上に配置します。ここから結紮を行います。これは重要な工程です。

モデルの重症度を決定するために、処置の程度を調整することができます。結紮範囲を広げることで、マウスにはより軽度の敗血症が誘導されます。結紮を盲腸の末端に近い位置で行えば軽度、中央で行えば中等度、回盲瓣に近い位置で行えば重症の敗血症となり、処置の重症度は死亡率に反映されます。

回盲弁は絶対に結紮しないでください。次に、絹縫合糸を用いて二重結節でしっかりと結紮し、穿刺を行います。盲腸を保持し、結紮部位の近くに慎重に穿刺を行い、さらに盲腸の端に近い位置にもう一つの穿刺を行います。盲腸の膜は柔らかいため、非常に簡単に穿孔します。

異なる太さの針を使用し、1回または2回の穿刺を行うことで、モデルの重症度を調節することも可能です。ここで示す単回または2回穿刺法は、従来の貫通穿刺法に代わる手法です。単回または2回穿刺法を用いる利点は、盲腸を圧迫した際に排出される糞便量をより適切に制御できることです。

盲腸を両指で保持し、ゆっくりと押し出して少量の糞便を採取します。開腹部を閉じる前に、腹膜を持ち上げて盲腸を慎重に腹腔内に戻します。

盲腸を誤って突き刺さないよう、細心の注意を払ってください。鉗子を使用する際は、大きめの鉗子の使用を推奨します。ここで腹腔を閉鎖します。シルク縫合糸を用い、確実に閉鎖されていることを確認することが非常に重要です。

創傷の一端から開始し、結節を作ります。前の穿刺部位のループの下にシルクを通し、反対側まで縫合を繰り返します。皮膚を閉鎖するには、専用の器具を用いてMitchell創傷クリップまたはリフレックスクリップを使用します。

創部が確実に閉鎖されるまで、必要に応じて十分な数のクリップを留置します。あらかじめ温めておいた生理食塩水1 mLを皮下注射し、マウスを蘇生させます。25Gの針を用いてこの輸液蘇生を行うことで、敗血症の過動態期が誘導され、処置が完了します。

マウスを赤外線ヒートランプの下に置くか、あるいはマウスが麻酔から回復するまでヒートパッドの上に置きます。ケージの床に餌と水を与え、疾患の兆候がないか8〜12時間ごとに動物を観察してください。術後鎮痛のため、ブプレノルフィンを皮下注射します。

別の鎮痛剤としてトラマドール（T.Tramadol）を使用します。敗血症の徴候および症状には、発熱、嗜眠、被毛の乱れ、勃起、下痢、肩をすくめるような姿勢（ハドリング）、および倦怠感があります。重症の動物は体温が著しく低下し、苦痛を避けるためにほとんど動かなくなります。

この段階で安楽死させてください。以上が、鎌状結紮および点状モデルの作製方法です。本手順のデモンストレーションがお役に立ち、動物実験を開始される前の研究に有用な情報となれば幸いです。結紮の長さ、針の太さ、穿刺回数を調整して、実験における適切な重症度を確立するために、トレーニングには高齢の個体または未使用の個体を使用することを強く推奨します。

それでは、失礼いたします。