Name: 微小循環の生体内イメージングのためのマウス精巣挙筋の準備 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-06-10T12:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 19 s
Description: 学ぶマウス精巣挙筋の生体内イメージング法。麻酔下の雄マウスで微小循環を可視化し、血流と酸素供給の制御機構を解明する。心血管研究における細胞レベルの動態解析に有用です。

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著者らの研究室では、健康補助R37 - HL041026、R01 - HL086483とR01 - HL056786（SSS）と米国公衆衛生局からF32 - HL097463とT32 - AR048523（PB）での国民の協会によってサポートされています。

1。マウスボード、筋肉の台座、本体のウェッジと灌流液<ol><li>マウスボード：透明な長方形のプレキシグラス板は（6"ワイドX 8"長いX 3 / 16"厚さ）顕微鏡のステージに収まるように作られています。"麻酔マウスがの手術の準備中に確保されている場所にマウスボード"が精巣挙筋。 </li><li>筋肉の台座：透明なシラスティックゴム台座は、メーカー° Sの指示にしたがって混合してSylgard 184、から調製される。便利な金型は15 mm厚× 50 mmの直径の直径使い捨てペトリ皿で​​す。 Sylgardのブロックは、かみそりの刃（図1Cを参照してください。）で所望の形状にカットされます。透明な防水シリコーン接着剤の薄層は、マウスボードにSylgardのブロックを保護するために使用されます。役に立つヒント：時間のための真空チャンバ内で脱ガス、ペトリ皿にSylgardを注入後の気泡を除去し、透明性を向上させる。 Sylgardのための時間が50 ° Cで数時間のために実験室のオーブンに皿を置くことによって短縮された硬化、脱気の後。 </li><li>体のくさびと加熱プラットフォーム：マウスの​​下にと台座に対する位置付けウェッジ（2"X 4"X 15 °）は、その原点から台座を介して精巣挙筋を拡張容易前方に体を傾斜させる。表面にアルミのプラットフォームを組み込むことにより、導電性の熱を提供します。プラットフォームは、DC電源装置（図1A）に接続された抵抗によって加熱される。プラットフォームの温度をキャリブレーション〜40 ° C〜37食道温度を維持℃にそうでない場合は、ランプからの輻射熱が使用されます。 </li><li>ピン。台座の精巣挙筋を確保するために、ピンは"L"の形に曲げられている0.15ミリメートルの昆虫ピンから調製される。 </li><li>生理食塩水（PSS）。製剤は、超高純度（MΩ18.2）H 2 Oで調製された重炭酸塩-緩衝PSSで連続的に（灌漑）灌流されていますストック溶液は20倍、最終的な作業濃度で調製し、0.2μmのフィルターを通して滅菌する。 4℃で保存した場合、ストック溶液は、数週間のための良いまま重炭酸塩とは別に塩を準備し、実験当日に希釈してこれらを組み合わせて使用​​すると、重炭酸カルシウムの沈殿を防ぐことができます。株式の塩の溶液（ミリモル/ Lで）で構成されています：2638のNaCl、94のKCl、40 MgS0 4、23.4 CaCl 2を 。株式の炭酸は360のNaHCO 3です。実験日に、それぞれのソリューションは、メスフラスコで最終容量（通常は特定の実験のための2リットル）に運ばれ、〜37℃の水浴に入れ5％CO 2でPSSを平衡化/ガス分散器を用いて〜15分間95％のN 2〜7.4にpHを調整し、沈殿を防ぐことができます。 PSSは、5％CO 2 /実験を通して95％のN 2で連続的にバブリングする。最終的な作業溶液組成は、（ミリモル/ Lの）です：132のNaCl、4.7 KClを、1.2 MgS0 4、2のCaCl 2、18のNaHCO 3。 </li></ol> 2。麻酔と手術の準備<ol><li>動物実験用の委員会の承認に続いて、少なくとも12週齢の雄マウスが使用されます。マウスは、腹腔内（ip）注射を介してペントバルビタールナトリウム（60 mg / kg）で麻酔です。拘束チューブは最初の注射の間は、マウスを確保するための有用証明する。外科的処置および実験的なプロトコルを通じて、麻酔は必要に応じてサプリメント（最初の注射の10-20％は、ip）（;つま先や尾のピンチに撤退の反応によって示される毎に30〜60分）によって維持されています。ヒント：注入が過剰摂取の可能性を軽減する前に滅菌生理食塩水にペントバルビタール10 mg / mlのを希釈。 </li><li>マウスはすぐに最初の注射後に保温されている必要がありますので、麻酔は、体温調節が損なわれます。加熱プレートの上に（換気アルミバスケット）は、金属製のフレームにマウスを置く（〜37 ° Cに校正された）うまく動作します。また、熱のランプは、マウスから適切な距離でそれを配置することに注意しながら使用することができます。麻酔の適切なレベルを（つま先やテールピンチに撤退の欠如）が達成されるまでマウスを5〜10分を監視する必要があります。補足投与量は15〜20分後に必要になることがあります。患者になると、特に肥満や老齢動物で、過剰摂取を避けるために慎重に進めるのが最善です。 </li><li>髪の毛は、慎重にそれぞれの領域を削って下腹部、腰、陰嚢と脚から削除されます。特に注意が特に精巣挙筋を傷つけるだろう陰嚢と精巣への外傷を避けるために注意する必要があります。新鮮アルコール綿棒で抜け毛を削除します。 </li><li>膀胱がいっぱいになっている場合には、腹壁を通って小さなブドウのように感じるでしょう。実験中にクレの準備に排尿からマウスを防ぐために穏やかな圧力を使用して膀胱を空にします。キムワイプはcollecに効果のスポンジです。トン尿。 </li><li>その足は台座をまたいでくさびの上に横たわる、その背中にマウスを合わせます。各足に結び付けられて絹の縫合糸は、（4-0または5-0）台座に対して、その股間にマウスを保護するためのテザーを提供します。胸に緩く置かれたとウエッジに固定されたテープの部分は、全体のボディの位置を維持します。顕微解剖用はさみと角度の鉗子を用いて実体顕微鏡を通して見ながら外科手術が行われます。 </li></ol> 3。オープン精巣挙筋の手術の準備<ol><li>ピンは、陰嚢の頂部（左側または右側）を介して配置され、皮膚の緊張を置く台座に固定されています。 PSS（34〜35 ° C）で灌流は、術野を介して開始され、曝露された組織は、暖かく湿った保つために解剖していても維持されます。陰嚢と真空ラインの他の隣の隣の一端に配置さ芯は（キムワイプで作られた）排水PSSを削除します。シリコーンシーラントのビーズプレキシグラス板に付着し、完全にウェッジと台座を囲むには、顕微鏡にPSS漏れを防ぐために効果的な予防策として、吸い出されていないすべてのPSSを収集する"堀"の役割を果たします。 </li><li>切開は、陰嚢の腹側表面に沿って行われます。睾丸が腹腔内に精巣挙筋によって撤回されている場合は、下腹部で穏やかな圧力は、嚢に睾丸を指示します。睾丸を覆う精巣挙筋の表面は、この時点で識別する必要があります。陰嚢皮膚と精巣挙筋の間に結合組織は、慎重に周囲の組織から精巣挙筋を解放するために削除されます。 </li><li>陰嚢皮膚を穏やかに台座の近位端の後ろに後退し、ピンとそれぞれの側に固定されています。精巣挙筋の表面の外面は、結合組織がクリアされます。解剖の水和物の結合組織中に連続灌流、可視性と除去を容易にする。 </li><li>精巣挙筋の頂点を介してピンが縦張力の下に配置するために使用されます。縦切開は、血管供給の中断を最小限に抑えるために取ら細心の注意を払って筋肉の腹側表面を介して行われます。準備の周囲の近くに血流のダイナミクスは、この組織損傷14で変更されます。そのため、最小限に抑えるためにこれらは、イメージングおよび生理学的研究に使用されるデータの収集、準備の中心付近の血管に影響を与えます。 </li><li>精巣挙筋は、睾丸の下にある精巣上体に薄い靭帯によって接続されている。片側に睾丸を反映して慎重に精巣上体から分離されているこの靭帯を、公開します。精巣挙筋の頂点付近で精巣上体に接続する小型の動脈と静脈です。鉗子とそれらを引くことが離れて出血を最小限に抑えるとの間でこれらの血管を閉塞する。睾丸、精巣上体、精巣動脈と静脈は、関連する鼠径脂肪パッドと一緒に（精巣摘出術）、（4-0または5から0絹縫合糸）近位に連結し、切断して破棄されます。また、睾丸を優しく腹腔内に押し戻さと綿またはキムワイプの一部を保持することができます。精巣摘出術は腹腔内に戻って睾丸を押すと組織することが可能外傷を避けるために提供しています。我々は手順7,15のいずれかを使用してクレマスター微小循環の準備の質の顕著な違いを（3.8節を参照）見つかっていない。 </li><li>精巣挙筋の外部表面は、残りの結合組織がクリアしてから、台座の表面に放射状に広がっている。エッジはそのまま微小循環と横紋筋の平らなシートを作成するために5〜6箇所にピン（1.4項を参照）で固定されています。 </li><li>完成した製剤は、連続的に灌流（3〜5 ml /分、34 ° C）と30分間平衡化、生体顕微鏡のステージに転送されます。 </li><li>クレマスターの準備の整合性はいくつかの基準に従って評価されます。最小限の外科的外傷による自発的な血管運動神経性緊張は、細動脈と細静脈の接着白血球の不足で活発なフローで示されます。応答準備中の最も敏感なインデックスは、5〜10分間の灌流液の酸素含有量を高めるために細動脈の収縮です。この、21％O 2でそれを平衡化することによって行われます（対5％O 2、1.5節を参照して、すべて5％CO 2、バランスN 2）。細動脈における白血球の存在、毛細血管を流れる赤血球の有無、および/または白血球細静脈に蓄積し、周囲の組織は、組織の損傷や炎症の徴候です。 </li></ol> 4。精巣挙筋の微小循環の生体内イメージング<ol><li>生体イメージングは​​、オリンパスMVX10ステレオズームプラットフォームに基づいてカスタム顕微鏡で実行されます。 MVX10顕微鏡本体明視野（ケーラー）イメージングのための透視（ハロゲンランプ）とし、蛍光イメージングのための落射照明（水銀灯）を装備したMVX10ハイブリッドスタンドにマウントされています。落射照明を使用して、GCaMP2は35分の520 nmで収集されたエミッションと30分の472 nmで励起される。パーソナルコンピュータ上でパイパーコントロールソフトウェア（SPI）を介して、XR/Mega-10激化、デジタルカメラ（SPIスタンフォードフォトニクス株式会社）を用いて、画像はMV PLAPO 2XCレンズ（オリンパス開口数= 0.50）を介して取得されます。このシステムでは、視野（FOV）の観測されたフィールドは、22ミリメートル× 18ミリメートル〜553μmからX 442ミクロンを変化させることができます。 </li><li>生体内イメージング実験が完了すると、麻酔マウスは頚椎脱臼に続くペントバルビタールの過剰投与で安楽死されています。 </li></ol> 5。代表的な結果<img src="/files/ftp_upload/2874/2874fig1.jpg" alt="図1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図1"> マウス精巣挙の準備の生体内イメージングのための図1。マウスボード。 A）アルミプラットフォームとボディウェッジは（黄色のプラスチックで絶縁）底部から見た。プラットフォームの下面に固定された発熱抵抗体は熱伝導を提供しています。 B）加熱プラットフォームは、プラスチック製のくさびにかかっている。 C）身体のウェッジは、手術と生体顕微鏡のステージへの後続の転送用のプレキシガラスのボード上に配置されます。 Sylgard台座は赤い矢印で示されています。防水シリコーンのビーズは、顕微鏡に滴下からそれを防止する、生体内の手順の間に漏出する可能性のあるソリューションを含むように全体の準備を取り囲んでいる。 <img src="/files/ftp_upload/2874/2874fig2.jpg" alt="図2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図2"> 図2。広視野イメージングのためのカスタムMacroZoom顕微鏡。 ）XR/Mega-10 ICCDカメラ（スタンフォードフォトニクス）とMVX10顕微鏡本体（オリンパス）は、三眼鏡ポートに取り付け。顕微鏡本体のB）クローズアップビュー。 （A）ズームコントロール（0.63〜6.3X）、（b）のフィルタホイール、（c）の画像ダブラ（25倍光学倍率とNA = 0.50）。明視野（ケーラー）照明（コンデンサーNA = 0.55、作動距離= 27 mm）のC）サブステージのコンデンサー。 <img src="/files/ftp_upload/2874/2874fig3.jpg" alt="図3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図3"> 図3は、マウス精巣挙の準備を完了。暖かいビニール被覆アルミニウムプラットフォーム（黄色）上の仰臥位で麻酔マウス。体の位置は、テープで固定されています。精巣挙筋は、透明なシラスティックゴムの台座の上に放射状に広げ、端部に固定されます。灌流液は、プラスチック製のドリッパー（白矢印）を介して近位端に導入される。真空ライン（白矢印）は、キムワイプの芯を経由してソリューションを削除します。二つのマイクロピペットは、組織内のそれらの先端に位置し表示されます。参照電極（銀線）は、精巣挙筋の下端に固定されています。 <img src="/files/ftp_upload/2874/2874fig4.jpg" alt="図4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図4"> 図4。内皮にGCaMP2を表現する細動脈のネットワークを視覚化するための倍率の範囲を図示。 A））蛍光とB明視野像は、ビデオモニタ上で総合倍率= 42Xのために3.2倍の光学倍率で撮影。 [ビューのフィールド（FOV）= 4375 X 3470程度]。スケールバー= 500μmの。この倍率で作業する任意位置でのマイクロピペットの配置を容易にします。総合倍率のための6.4xはの光学倍率で撮影したC）蛍光およびD）明視野像= 83X（FOV = 2,200 × 1759μmの）。スケールバー= 200μmの。総合倍率については12.6Xの光学倍率で撮影したE）蛍光とF）明視野像= 165X（FOV = 1,100 X 885ミクロン）。スケールバー= 100μmの。 G）の画像ダブラ、光学倍率= 25.2Xと。スケールバー= 50μmの。

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</ol>

動物に関わるすべての手順およびプロトコルは、ミズーリ大学の動物実験委員会によって承認され、 実験動物の管理と使用に関する国立衛生研究所のガイドと一致して行った。 このビデオ記事の生産は、スタンフォードフォトニクスによって後援されています。

ここでは、 生体内で微小循環を観察するためにマウスのオープン精巣挙筋の準備方法を説明します。この手順は、まずラット4に記載の&quot;オープン&quot;クレマスターの準備の後にモデル化されています。練習すれば全体の外科的処置は1時間以内で完了することができます。この準備の多様性は、実験操作のさまざまなことができ、容易に同様の方法で研究する実験モデルのさまざまなを可能にする、ハムスターだけでなく、ラットに適応される。製剤は、雄の動物との測定値に制限されて筋肉14のエッジ付近の損傷領域を避け、組織の中心に向かってなされるべきである。また、圧力と流量分布が精巣挙筋の相互接続の船が16をカットしているときに変更されている間に、微小血管の応答性と再現性のデータ収集に適して残っている、ことを認識すべきである。精巣挙筋の微小循環を可視化するために主な制約は、特にラットでもハムスターで、成熟した動物と大きさの増加などの結合組織の蓄積です。さらに、動物が脂肪を取るにつれて、それは、ペントバルビタールは親油性であり、脂肪組織に吸収されるので、麻酔を制御することがより困難になる。続行するための最良の方法は、動物° S体温が〜37に維持されることを保証する一方で、患者であることによって℃に露出しながら組織は、PSSで連続的に灌漑されている。

<table border="1"><tbody><tr><th>試薬またはデバイスの名前</th><th>会社</th><th>カタログ番号</th><th>コメント</th></tr><tr><td>塩化ナトリウム</td><td>フィッシャー</td><td> S642 - 212 </td><td></td></tr><tr><td>塩化カリウム</td><td>シグマ</td><td> P9541 </td><td></td></tr><tr><td>硫酸マグネシウム</td><td>シグマ</td><td> M2643 </td><td></td></tr><tr><td>塩化カルシウム</td><td>シグマ</td><td> C1016 </td><td></td></tr><tr><td>重炭酸ナトリウム</td><td>フィッシャー</td><td> S233 </td><td></td></tr><tr><td>ネンブタールナトリウム溶液</td><td>ルンドベック</td><td> NDC 67386-501-55 </td><td>また、ペントバルビタールナトリウムとも呼ば</td></tr><tr><td>温度コントローラ</td><td>ワーナーインスツルメンツ</td><td> TC - 344B </td><td>代替：調節可能な12V DC電源</td></tr><tr><td>シリーズ20プラットフォームヒーターキットRH - 2 </td><td>ワーナーインスツルメンツ</td><td> 64から0274 </td><td>特注のアルミ板が必要です</td></tr><tr><td>メガ- 10カメラ</td><td>スタンフォードフォトニクス</td><td> XR/Mega-10 </td><td></td></tr><tr><td> MVX10 </td><td>オリンポス</td><td></td><td></td></tr><tr><td> MV PLAPO 2XCレンズ</td><td>オリンポス</td><td></td><td></td></tr><tr><td> MVX10ハイブリッドスタンド</td><td>リーズ</td><td> LBX -ハイブリッド</td><td></td></tr><tr><td>パイパーコントロールソフトウェア</td><td>スタンフォードフォトニクス</td><td></td><td>メガ- 10カメラのためのプログラム</td></tr><tr><td>ステレオ顕微鏡</td><td>ニコン</td><td> SMZ645 </td><td></td></tr><tr><td>防水シリコーンシーリング材（クリア） </td><td>ゼネラルエレクトリック</td><td> 47970〜72643 - LW​​5000 </td><td>他の透明なシリコーンシーラントでも動作する</td></tr><tr><td> 60 × 15ミリメートルシャーレ</td><td>フィッシャー</td><td> 08から757 - 13A </td><td></td></tr><tr><td> Sylgard </td><td>ダウコーニング</td><td> 184 </td><td></td></tr><tr><td>顕微解剖用はさみ</td><td>ファイン科学ツール</td><td> 15003〜08 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>デュモン鉗子</td><td>ファイン科学ツール</td><td> ＃45分の5 </td><td></td></tr><tr><td> GPミリポアエクスプレスプラスメンブレン</td><td>ミリポア</td><td> SCGPT05RE </td><td></td></tr><tr><td> Minutiens虫ピン</td><td>アウステルリッツ</td><td> Mサイズ0.15ミリメートル</td><td></td></tr><tr><td>コンパクトペットトリマー</td><td>ウォールクリッパーコーポレーション</td><td>モデル9966 </td><td>それぞれの使用後に清掃してください</td></tr></tbody></table>

微小循環の生体内イメージングのためのマウス精巣挙筋の準備

The Mouse Cremaster Muscle Preparation for Intravital Imaging of the Microcirculation

体全体に、恒常性の維持は、酸素と副産物代謝の除去との併用栄養素の一定の供給を必要とします。このバランスは、すべての組織や器官全体の血管供給の最小の枝を包含する微小循環を介して血液の運動によって達成される。密接に実質細胞に関連付けられている毛細血管の多数に流入酸素血液の分布と大きさを制御するネットワークを形成する動脈から動脈の枝。毛細血管は、組織細胞と血液供給の間に拡散交換のための大きな表面積を提供しています。小静脈は毛細管の流出物を収集し、それらが心臓に向かって非酸素化血液を戻すように収束する。リアルタイムでこれらのプロセスを観察するには、生活の微小循環を可視化し、操作するための実験的アプローチが必要です。 ラットの精巣挙筋は、最初に組織学と電子顕微鏡死後1,2を使用して炎症を研究するためのモデルとして使用されました。露出無傷のラットの精巣挙筋のin vivoでの報告の最初は、反射光3を使用して血管作用薬に微小血管の反応を調べた。しかし、焦点を絞った照明の筋肉と不足の曲率は、本製剤の有用性を制限。大きな突破口は、筋肉を開いて睾丸からそれを切り離すと複合顕微鏡4で透視のための平らなシートとして放射状に広がって伴いました。ラット5とハムスター6の微小循環の生理機能を研究する貴重な準備であることが示されているが、マウス7の精巣挙筋は、微小血管の機能8-11と細胞間のリアルタイム画像処理の制御に関与する細胞経路を解剖に特に役立っています12シグナリング。 睾丸が鼠径管13を通って降りるように精巣挙筋は、内部の斜めや横方向の腹の筋肉から導出されます。と精巣の温度を維持する：それはサポート（クレマスター=サスペンダーギリシャ語）に提供しています。ここで説明したように、精巣挙筋は、優れた光学分割のための薄い平らなシートとして調製される。マウスが安定した体温と麻酔の面で維持したまま、手術の準備は、生理食塩水で連続して、それを灌漑しながら、周囲の組織や精巣から筋肉を解放シラスティックゴムの透明な台座の上に拡散し、虫ピンでエッジを確保する関係。現在のプロトコルは、細動脈内皮細胞でGCaMP2を発現するトランスジェニックマウスを利用しています。 GCaMP2は遺伝的に符号化された蛍光カルシウム指示薬の分子の12です。広視野イメージングと激化電荷結合素子カメラは、細動脈内皮におけるカルシウムシグナルのin vivo試験で有効。

組織の準備を可視化し、生活の微小循環の実験的操作のために説明されています。麻酔雄マウスでは、薄く、非常に血管形成精巣挙筋は細動脈、毛細血管と細静脈を含む微小血管のネットワークを研究する生体顕微鏡検査用に準備されています。この製剤は、容易にラットとハムスターに適合されている。

全身において、恒常性を維持するためには、代謝産物の除去と並行して、酸素と栄養素を絶えず供給する必要があります。

この手順の全体的な目的は、麻酔をかけた雄マウスの生体微小循環を研究するために、精索挙筋を処置することです。この手術は、陰嚢の腹側を切開することから始まります。除毛後、次のステップとして、周囲の組織から精索挙筋を露出させ、分離させます。次に、精巣摘出術を行い、組織を透明な台座の表面に放射状に広げます。この標本を顕微鏡で観察することで、クレマスター筋内の微小循環をイメージングできます。最終的に、健康状態や疾患モデルにおいて、また実験的な操作に対する反応として、生体システム内で血流と酸素供給が実際にどのように制御されているかを示す結果を得ることができます。この手法は、微小循環に重点を置いた心血管医学研究における基本的な疑問を解決するために利用できます。特に、生体内のシステムにおいて、細胞レベルで血流と酸素供給がどのように調節されるかについて検討することが可能です。この手法を用いることで、マウスの微小循環におけるin vivoでの機能に関する知見を得ることができます。本手法は、ハムスターやラットなどの他のげっ歯類モデルにも適用可能です。顕微鏡下でマウスを固定するために、いくつかの新しい器具を準備する必要があります。まず、顕微鏡のステージに適合する透明な長方形のアクリル製ボードを作成します。次に、ペトリ皿に注いだSylgard 180 4を用いて、透明なペデスタルを作成します。厚さを15 mmに調整するため、注いだSylgardを真空チャンバー内で1時間脱気します。気泡を取り除き透明度を高めるために、脱気したSylgardを50 °Cのオーブンで約4時間硬化させます。硬化後、台座を上部が丸みを帯びた五角形に切り出します。次に、透明な防水シリコン接着剤を薄く塗り、台座ブロックを長方形のプレキシガラス板に固定し、シリコンを一晩硬化させます。続いて、マウスを台座に固定するための楔形のプラットフォームを作製します。ウェッジプラットフォームはアクリル樹脂製にすることができ、試料を保温するためにヒートランプを使用できます。あるいは、プラスチック製のウェッジにアルミニウムを取り付けることも可能です。この場合、DC電源に接続された抵抗加熱素子を用いてアルミニウムを加熱します。最後に、実験当日に超純水を用いて炭酸緩衝PSSを調製します。塩類を実験当日に混合することで、重炭酸塩の沈殿を防ぐことができます。PSSを37°Cのウォーターバスで保持し、ガスディスパーサーを用いて、窒素ガス中の5%二酸化炭素ガスで15分間PSSを平衡化させます。これによりpHが約7.4に調整され、塩の沈殿がさらに防止されます。成マウスを麻酔後、下腹部、腰部、陰嚢および脚の被毛を注意深く剃毛します。下層にある精索筋を傷つけないよう、陰嚢と精巣の周囲は特に注意して行ってください。新しいアルコールスワブで浮き毛を取り除きます。膀胱が充満しているか確認してください。充満している場合は、腹壁越しに小さなブドウのような感触があるため、排尿させて空にします。キムワイプの先端を陰茎の横に当て、軽く圧力をかけながら尿を回収します。次に、マウスを仰向けにし、脚がガードペデスタルの両側にくるようにウェッジプラットフォーム上に配置し、鼠径部をペデスタルに押し当てて固定します。この姿勢を維持するため、胸部にテープを緩めに貼り、プラットフォームに固定します。陰嚢嚢の頂点から台座に向けてピンを固定し、陰嚢の皮膚に緊張をかけた状態で手術を開始します。次に、解剖の間中、手術野にPSSを絶えず灌流させます。流出するPSSを除去するため、キムワイプの一端を陰嚢嚢の横に、もう一端を吸引管の横に配置します。角度付きピンセットで皮膚を保持しながら、マイクロディセクション用鋏を用いて、精巣が精索挙筋によって腹腔内に引き込まれている場合は、陰嚢の腹側面に沿って垂直に切開します。下腹部に軽く圧力をかけることで、精巣を陰嚢内へと誘導します。次に、精巣を覆っている精索挙筋の表面を確認し、筋肉と陰嚢皮膚の間の結合組織を注意深く除去します。кремаステロイド筋（精索挙筋）を露出させるため、陰嚢の皮膚を台座の近位端の後方へそっと牽引し、両側で固定します。ピンを用いて、筋肉の外表面から結合組織を取り除きます。кремаステロイド筋の頂点にピンを刺して張力をかけ、腹側表面に沿って非常に慎重に縦切開を加えます。この際、血管系の損傷を最小限に抑えるようにしてください。クリーマスタース（精巣挙筋）は細い靭帯で精管上皮（EPIs）に接続しています。精巣の下側で、精巣を片側に寄せます。これにより、精管上皮から慎重に分離されたこの靭帯を露出させます。提精筋の頂点付近に、副精巣に繋がる一対の小さな動脈と静脈があります。これらの血管を鉗子で挟み、出血を最小限に抑えるために引き離します。次に、近位の鼠径脂肪パッドを含めて精巣摘出術を行い、精巣、副精巣、精巣動脈および静脈を結紮します。その後、それらを切断して廃棄します。精索挙筋に残っている結合組織を取り除き、台座の表面に放射状に広げます。端を5〜6本のピンで固定し、微小循環が維持された横紋筋の平坦なシートを作成します。完成した標本を、34°Cに連続的に維持された生体内顕微鏡のステージに載せ、実験的操作やデータ収集の前に30分間平衡化させます。明視野照明とエピ照明を備えたカスタム顕微鏡を用い、明視野照明下で精索標本のデジタル画像を撮影しました。蛍光下では、筋肉を42倍、83倍、165倍の倍率で観察しました。また、展開後には、筋肉を42倍、83倍、165倍、330倍の倍率で観察しました。この手法は、組織、血流、酸素供給、および炎症の調節に関するメカニズムを研究する微小循環研究者に道を開きました。この手順を行う際は、微小血管の反応性が維持されるよう、組織を慎重に扱うことが重要です。

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Research

JoVE Journal

Biology

生物学

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微小循環の生体内イメージングのためのマウス精巣挙筋の準備

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