Name: バイオマットから高分子量DNAの抽出 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-07-07T12:03:00.000+00:00
Duration: 9 min 30 s
Description: 学ぶ 高塩分バイオマットから高分子量DNAを抽出する改良プロトコル。細胞分離、凍融溶解、有機抽出を用いてDNA品質と濃度を向上させ、機能的メタゲノミクス研究に応用可能です。

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この作品は、全米科学財団環境ゲノミク​​スプログラム（グラント番号EF - 0723707）により賄われていた。

1。微生物細胞の抽出： <ol><li>徹底的に混合することにより滅菌粉砕乳棒でバイオマットをホモジナイズする。場所は約全30ワーリングブレンダーの滅菌​​容器に均質化したマットの材料のg（湿重量）、1MのNaCl（または使用中のサンプルに特定の濃度）の約100mLを追加し、1分間、中程度の速度で三回をブレンド1分間-20℃の冷凍庫で断続的に冷却。 250mLの遠心ボトルにスラリーを移し、1 M NaClで、残りの空のボリュームを埋める。オートクレーブのDI水にNaCl溶液を準備し、それを殺菌するフィルタ。 </li><li>さらに30分間室温でボルテックス（渦魔神R 2）を用いて（150 rpm）し振とうすることにより、マトリックスからの微生物細胞を取り除く。 </li><li> 4℃で15分間のための低速で遠心（500分の1グラム）ゆっくりと堆積物への最小限の障害でフラスコに上清を移す。 </li><li>ペレット堆積物を使用して、ステップ1.3の末尾に、各堆積物ペレットに新鮮なNaClの添加でブレンドし、手順1.2と1.3はさらに4回繰り返します。各NaClの抽出からの上清を新しいフラスコに転送されます。 </li><li> 4℃で15分間高速（25,000 × g）で200mLのアリコートに5セルの抽出と遠心の上清を組み合わせる℃に上清を廃棄し、2％ヘキサメタリン酸ナトリウム10mlに各細胞ペレットを再懸濁し、ペレットを組み合わせ、2％ヘキサメタリン酸ナトリウムを加えて200mlにボリュームを構成しています。 30分間室温（150 rpm）で振とうして細胞を洗浄。このステップの最後には、次のステップに進むために、細胞の唯一のチューブが必要です。 </li><li> 4℃で15分間のための高速で遠心分離（25,000 × g）でTE（50mMのEDTA）200mLに上清を、再懸細胞ペレットを捨て、そして室温で10分間（150回転）振とうして細胞を洗浄。 </li><li> 4℃で15分間、高速（25,000 × g）で遠心℃で、15 mLのTE（10mMのEDTA）に再懸濁し、上清を、破棄、および-80℃ストア200μL分注し° CまでのDNA抽出のために必要。 </li></ol> 2。 DNAの抽出と精製： <ol><li> 200μLの微生物細胞のアリコートに200μLの5 M NaCl、200μL10％SDS、および100μL14.3 Mβ-メルカプトエタノールを追加。反転4-6回で静かに混和。 </li><li> 5分間65℃の水浴で融解することによって続いて2分間液体窒素に浸して凍結融解の3ラウンドに従う混合物。 10分に解凍最後の拡張。 </li><li> 200μLの5 M酢酸カリウム（pH5.5）に、10分間氷上に場所を追加します。 4℃で10分間、10,000 xgで遠心℃、ワイドボアピペットチップを用いて上清を新しいチューブに移す。 1時間のためにRNaseを37℃でインキュベート℃の3μLを加える。 </li><li>等量のクロロホルムを追加し、反転が簡単に振る、そして室温で10分間、15,000 xgで遠心。 </li><li>慎重にワイドボアピペットチップを使用して、新しいチューブに上清の最上層を移す。上部と下部層の間にある白い界面層をピペッティングは避けてください。クロロホルム抽出の手順を繰り返します。 </li><li> DNAを沈殿に30分間氷上で上清とインキュベートするとチルドの等量が（-20℃）、イソプロパノール追加。 </li><li> 4℃で10分間ペレットDNAにCの最大速度（20800 × g）で遠心。 </li><li>上清を破棄し、チルド1mLでDNAペレットを洗浄は、70％エタノール（-20℃時）。 </li><li>で10分間4℃で最大スピード（20800 × g）で遠心機は、70％エタノールで洗浄し、10分間空気乾燥DNAペレットを繰り返し、上清を捨てる。 70％エタノールで洗浄を繰り返します。 </li><li> 25μLのTE（10mMのEDTA）に再懸濁し、DNA、65℃暖かい℃で5分間は、複数のチューブが使用されている場合は、1つのチューブに結合し、そしてTEで500μLにボリュームをメイク。 </li><li>追加500μLの氷冷（または4℃）20％ポリエチレングリコール（PEG）（1.2 M NaClに調製）。氷上で10分間インキュベート反転、、、4℃で10分間ペレットDNAにCの最大速度で遠心分離により穏やかに混合する。取り外して廃棄上清を、10分間空気乾燥、冷却した70％エタノール1mLでペレットDNAを洗浄、30〜50μlのTEまたは分子等級水に再懸濁します。 65温暖化によるDNAの再懸濁を促進〜80時5分とストアのDNAのためのC℃に</li></ol> 3。 DNAの純度、濃度とサイズの決定： <ol><li> 280分の260と光度計1000分光光度またはその他の適切な計測機器を使用して230分の260の比率を測定することにより、DNAの品質を決定します。 </li><li>メーカーの指示に従ってクワント- ITのdsDNAのアッセイキットを用いてDNA濃度を決定する。 </li><li>パルスフィールドゲル電気泳動を用いたDNAのサイズを決定します。 0.5 × TBEで1％アガロースゲルを準備し、以下のCHEF MapperのXAシステム上でパラメータ使用、0.35 sの最初のスイッチ時間、7.67秒の最後のスイッチ時間、および120℃の時6.0 V / cmのグラデーションの角度を含め線形R係数をリアンプ。 30分間1 × SYBRグリーンIを使用してゲルを染色する。ゲル上700-1000 ngのDNAの間にロードします。図を参照してください。完全なプロトコルの圧縮された形式3。 </li></ol>代表的な結果： 細胞の抽出： シーケンシャル微生物の細胞抽出物は、（上清）抽出物の濁度は、抽出数が増えるにつれて減少することが示されている。これは、連続したセルの抽出後の細胞数の減少を示唆している。ここで注意すべき重要な追加の各セルの抽出工程は、汚染物質の導入のための機会を提供するので、細胞の抽出数は、最終細胞ペレットは、全体的な微生物群集の代表となるように最小化されるべきであるということです。汚染の他の情報源は、適切な実験室無菌技術を採用することによって制御されていました。例えば、ソリューションは、オートクレーブ純水で調製し、滅菌フィルター。容器は、アルコールで滅菌オートクレーブ、紫外線や紫外線架橋剤で処理した。 DNAの濃度と品質決定： プロトコルは、マットの1.6の280分の260比を持つ試料、および0.7の230分の260の比（表1）のグラムあたりHMW DNAの約2μgの（35〜50キロバイト）（図4）を得た。 230分の260の比率が低いように見えるが、そのような16S rRNA遺伝子のPCR -増幅のような下流分子ベースのアプリケーションの阻害は別の研究7で観察されなかった。 EPSと塩;塩性マットからそのDNAコンタミネーションの2つの主な情報源を持っていることに注意することが重要です。それは、これらの汚染物質の痕跡がダウンストリームのアプリケーションに与える影響を低減するために多大な努力にもかかわらず、230分の260の比率に影響を与えることができることが可能となる。 DNAサイズの決定： 図3に示すように、パルスフィールドゲル電気泳動は、DNAの塗抹標本で、その結果、断続的な方向のスイッチと脈動​​電流の流れを採用しています。我々のプロトコルは、約35〜50キロバイトのHMW DNAが得られた。いくつかのDNAサイズが30 KBより小さいかもしれないが、それは、フォスミドクローン作成は、約40 kbのDNAを挿入し、より大きなDNA断片は、無傷の生合成経路へのより大きなアクセスを提供する必要があることを考えると35キロバイト上記の塗抹標本の一部を持つことが重要です。我々の研究では、35キロバイト上記のDNAスミアは大インサートベクトルのクローニングと他の分子のアプリケーション用に切り出し、精製した。 <img src="/files/ftp_upload/2887/2887fig1.jpg" alt="図1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図1"> エリューセラ、バハマにある図1。塩性の微生物マットのサンプリングサイト（ビッグ池）。 <img src="/files/ftp_upload/2887/2887fig2.jpg" alt="図2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図2"> 図2本研究で使用した塩性微生物マットの断面。微生物マットはエリューセラ、バハマにある塩性池から入手した。 <img src="/files/ftp_upload/2887/2887fig3.jpg" alt="図3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図3"> 図3。微生物細胞の抽出、細胞溶解、抽出、およびメタゲノムDNAの精製に関連する手順の模式図は。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/2887/2887fig3large.jpg">拡大画像を表示するにはここをクリックしてください。</a> <img src="/files/ftp_upload/2887/2887fig4.jpg" alt="図4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図4"> 図4パルスフィールドゲル電気泳動を用いて抽出したDNAの分子量特性評価。レーンMは、HMWマーカーであり、レーン1と2は、上記のプロトコルを使用してエリューセラ塩性のマットから抽出したメタゲノムDNAの複製です。 <table border="1"><tbody><tr><td> 抽出方法 </td><td></td><td> 濃度ng / gの </td><td> 280分の260 </td><td> 230分の260 </td></tr><tr><td> PEG </td><td>担当者1 </td><td> 1806.1 </td><td> 1.64 </td><td> 0.76 </td></tr><tr><td></td><td>担当者2 </td><td> 2010.8 </td><td> 1.61 </td><td> 0.75 </td></tr></tbody></table> 表1。微生物塩性マットから抽出したDNAの濃度と品質の測定。

<ol><li>Decho, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbial+biofilms+in+intertidal+systems%3A+an+overview%5BTitle%5D)+AND+%22Cont.+Shelf+Res%22%5BJournal%5D)">Microbial biofilms in intertidal systems: an overview.</a> Cont. Shelf Res. 20, 1257-1273 (2000).</li>
<li>Dupraz, C., Visscher, P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbial+lithification+in+marine+stromatolites+and+hypersaline+mats%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Microbial lithification in marine stromatolites and hypersaline mats.</a> Trends Microbiol. 13, 429-438 (2005).</li>
<li>Steffan, R. J., Goksoyr, J., Boj, A. K., Atlas, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recovery+of+DNA+from+soils+and+sediments%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Recovery of DNA from soils and sediments.</a> Appl. Environ. Microbiol. 54, 2908-2915 (1988).</li>
<li>Lee, Y. K., Kim, H. W., Liu, C. L., Lee, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+for+DNA+extraction+from+marine+bacteria+that+produce+extracellular+materials%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microbiol.+Methods%22%5BJournal%5D)">A simple method for DNA extraction from marine bacteria that produce extracellular materials.</a> J. Microbiol. Methods. 52, 245-250 (2003).</li>
<li>Roose-Amsaleg, C. L., Garnier-Sillam, E., Harry, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extraction+and+Purification+of+Microbial+DNA+from+Soil+and+Sediment+Samples%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Soil+Ecol%22%5BJournal%5D)">Extraction and Purification of Microbial DNA from Soil and Sediment Samples.</a> Appl. Soil Ecol. 18, 47-60 (2001).</li>
<li>de Lipthay, J. R., Enzinger, C., Johnsen, K., Aamand, J., Sørensen, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+DNA+extraction+method+on+bacterial+community+composition+measured+by+denaturing+gradient+gel+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Soil+Biol.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Impact of DNA extraction method on bacterial community composition measured by denaturing gradient gel electrophoresis.</a> Soil Biol. Biochem. 36, 1607-1614 (2004).</li>
<li>Bey, B. S., Fichot, E. B., Dayama, G., Decho, A. W., Norman, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extraction+of+High+Molecular+Weight+DNA+from+Microbial+Mats%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Extraction of High Molecular Weight DNA from Microbial Mats.</a> Biotechniques. 49, 631-640 (2010).</li>
<li>Kakirde, S. K., Parsley, L. C., Liles, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Size+does+matter%3A+Application-driven+approaches+for+soil+metagenomics%5BTitle%5D)+AND+%22Soil+Biology+%26+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Size does matter: Application-driven approaches for soil metagenomics.</a> Soil Biology & Biochemistry. 42, 1911-1923 (2010).</li>
<li>Rodon, M. R., August, P. R., Bettermann, A. D., Brady, S. F., Grossman, T. H., Liles, M. R., Loiacono, K. A., Lynch, B. A., MacNeil, I. A., Minor, C., Tiong, C. L., Gilman, M., Osburne, M. S., Clardy, J., Handelsman, J., Goodman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+the+Soil+Metagenomic%3A+A+Strategy+for+Accessing+the+Genetic+and+Functional+Diversity+of+Uncultured+Microorganisms%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Cloning the Soil Metagenomic: A Strategy for Accessing the Genetic and Functional Diversity of Uncultured Microorganisms.</a> Appl. Environ. Microbiol. 66, 2541-2547 (2000).</li>
<li>Beja, O., Aravind, L., Koonin, E. V., Suzuki, M. T., Hadd, A., Nguyen, L. P., Jovanovich, S. B., Gates, C. M., Feldman, R. A., Spudich, J. L., Spudich, E. N., DeLong, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+Rhodopsin%3A+Evidence+for+a+New+Type+of+Phototrophy+in+the+Sea%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Bacterial Rhodopsin: Evidence for a New Type of Phototrophy in the Sea.</a> Science. 289, 1902-1906 (2000).</li>
</ol>

利害の衝突は宣言されません。

複雑かつ高度に多様な微生物マット試料からの全細胞の除去が実用的ではないことを考えると、主な関心事は、抽出された細胞は、全体的な微生物マットのコミュニティを表す方法もあります。以前の研究で、微生物の16S rRNA遺伝子のPCR - DGGE解析では、このプロトコルで使用する5つの細胞の除去の手順は、全体的な微生物マットのコミュニティ7の代表的な細胞を抽出することを示した。全体的な微生物群集の代表である細胞ペレット可能性が高いサンプルの種類に依存して変化する提供するために必要な細胞の抽出手順の実際の数。異なるサンプルに最適なプロトコル開発のために、小規模なパイロットスタディは、各セルの抽出工程は、元のコミュニティの豊かさに比較して後に回収した微生物の豊かさの経験的なテストを特徴とすることをお勧めします。 フォスミドクローン作成は、クローンライブラリーの構築8の35〜40キロバイトのHWM DNAを必要とします。我々のプロトコルは、35〜50キロバイト（図4）に至るまでのサイズでDNAが得られたと、正常フォスミドベースのメ​​タゲノムライブラ...

<table border="1"><tbody><tr><th>試薬の名前</th><th>会社</th><th>カタログ番号</th><th>コメント</th></tr><tr><td> β-メルカプトエタノール</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> M3148 </td><td></td></tr><tr><td>ポリエチレングリコール8000 </td><td>プロメガ</td><td> V3011 </td><td> 1.2 M NaClを約20％ </td></tr><tr><td>カリウム酢酸</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td></td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td></tr><tr><td>クワント- IT dsDNAをアッセイキット</td><td>インビトロジェン</td><td> Q33130 </td><td></td></tr><tr><td> RNaseの</td><td> EPICENTRE </td><td> MRNA092 </td><td></td></tr><tr><td>塩化ナトリウム</td><td> BDHケミカルズ</td><td> BDH8014 </td><td>適切なコンク。 </td></tr><tr><td>硫酸ドデシルナトリウム</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td> 03-500-509 </td><td>水の10％ </td></tr><tr><td>ヘキサメタリン酸ソーダ</td><td> EMDケミカルズ</td><td> SX0583 - 3 </td><td>水の2％ </td></tr><tr><td> TBE </td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td> BP1333 - 1 </td><td></td></tr><tr><td> CHEF MapperのXAシステム</td><td>バイオラッドラボラトリーズ</td><td> 170-3670 </td><td></td></tr><tr><td>光度計1000分光</td><td>サーモサイエンティフィック</td><td> ND - 1000 </td><td></td></tr><tr><td>ボルテックス</td><td>サイエンティフィックインダストリーズ株式会社</td><td></td><td></td></tr><tr><td>紫外線架橋剤</td><td> UVP </td><td></td><td></td></tr><tr><td>ワーリングブレンダー</td><td>ワーリング実験室</td><td> LB10S </td><td></td></tr></tbody></table>

バイオマットから高分子量dnaの抽出

Extraction of High Molecular Weight DNA from Microbial Mats

メタゲノムデータの成功したと正確な分析と解釈は、質の高い、高分子量（HMW）のコミュニティDNAの効率的な抽出に依存しています。しかし、環境マットのサンプルは、しばしば高品質の、HMWのDNAの大規模な濃度を得るために困難をもたらす。塩性の微生物マットは高い細胞外高分子物質の量（EPS）1、抽出されたDNAの下流のアプリケーションを阻害する塩が含まれています。ダイレクトと厳しい方法は、しばしば難治性の試料からのDNA抽出に使用されています。マット、接着剤マトリックス、のEPSは直接溶解中にDNA 2,3を結合するので、これらのメソッドは一般的に使用されています。厳しい抽出方法の結果として、DNAは、小さいサイズ4,5,6に分割になります。 DNAは、このように大規模挿入ベクトルのクローニングには不適切となります。これらの制限を回避するために、我々は塩性微生物マットから良い質と量のHMW DNAを抽出するために改良された方法論を報告する。我々はブレンドと分画遠心法を通じて、背景のマットマトリックスからの微生物細胞の分離を伴う間接的な方法を採用。機械的および化学的手順の組み合わせは、抽出された微生物細胞からDNAを抽出精製するために使用された。我々のプロトコルは1.6の280分の260比で、マットのサンプルのグラム当たりHMW DNA（35〜50キロバイト）の約2μgを得られます。また、16S rRNA遺伝子7の増幅は、プロトコルが汚染物質のいずれかの阻害効果を最小化または排除することができることを示唆している。我々の結果は、機能的なメタゲノム研究のためのバイオマットからHMWのDNAの抽出のための適切な方法論を提供し、DNA抽出が難しいされているから、他の環境試料にも適用可能である。

我々は、塩性微生物マットから高分子量のDNAを抽出するための改良されたプロトコルを提供しています。微生物細胞は、DNAの抽出と精製の前にマットのマトリックスから分離されています。これは、濃度、品質、およびDNAの大きさを高めます。プロトコルは、他の難治性のサンプルに使用することができる。

バイオマットから高分子量DNAの抽出

メタゲノムデータの正確かつ成功裏な解析および解釈は、高品質で高分子量のDNAを効率的に抽出できるかどうかに依存しています。

本手順の全体的な目的は、高塩分微生物マットから高分子量DNAを抽出することです。まず、微生物マットから微生物細胞を均質化して抽出します。その後、凍結融解および化学的手法を用いて微生物細胞を溶解させます。次に、有機溶媒抽出を用いて細胞残渣とRNAを除去し、続いてDNA抽出を行います。本手順の最終ステップは、DNAの沈殿および精製です。最終的に、高分子量で高濃度の高品質なDNAを得ることができます。直接的で過酷なDNA抽出法などの既存の手法に対する本手法の主な利点は、複雑な環境試料から高分子量DNAを利用して機能的メタゲノム研究が行える点にあります。本研究で使用した微生物マットは、バハマのエレウセラにある高塩分池から採取しました。背景となるマットマトリックスから微生物細胞を抽出するために、まず、滅菌済みの研磨用ペッスルを用いて、約30 gのマットを砕かずに十分に混ぜ合わせます。混合物の中に塊が見られなくなれば、マットは完全に均質化されたことになります。次に、均質化したマット材料をブレンダーに入れ、約100 millilitersの塩化ナトリウムを加えます。中速で1分間攪拌し、続いて-20 °Cで1分間冷却します。この攪拌と冷却の手順をさらに2回繰り返します。攪拌が完了したら、スラリーを250 milliliterの遠心分離ボトルに移し、残りの空き容量を1 molarの塩化ナトリウムで満たします。室温で30分間振盪した後、スラリーを4 °Cで15分間、低速で遠心分離します。次に、沈殿物をできるだけ乱さないように注意しながら、上清をフラスコに静かに移します。ペレット化した沈殿物に、新鮮な塩化ナトリウムを加えます。再度混合し、30分間振盪します。その後、前述と同様に遠心分離を行い、上清を新しいフラスコに移します。新鮮な塩化ナトリウムの添加、混合、遠心分離、および上清の除去を、さらに3回繰り返します。5回分の細胞抽出液の上清を合わせ、4°Cで15分間高速遠心分離を行います。上清を捨て、各細胞ペレットを10 mLのヘキサメタリン酸ナトリウムで再懸濁します。4本のチューブすべての細胞懸濁液を合わせ、ヘキサメタリン酸ナトリウムを加えて全量を200 mLにします。室温で30分間振盪して細胞を洗浄します。振盪後、4°Cで15分間高速遠心分離し、上清を捨てて細胞ペレットを200 millilitersの洗浄液に再懸濁し、再度室温で10分間振盪して細胞を洗浄します。最後に、再び4°Cで15分間高速遠心分離します。snat Resusを廃棄した後、細胞ペレットを15 millilitersのteに懸濁させ、微生物細胞の200 microliter分注液を調製します。微生物細胞は、DNA抽出に使用するまでminus 80 degrees Celsiusで保存可能です。微生物細胞からDNAを抽出および精製する手順を開始するには、200 microliterの微生物細胞それぞれに、sodium chloride SDSおよびbeamr capto ethanolを添加します。計8本のチューブに分注します。4〜6回緩やかに転倒混和し、混合液を液体窒素に2分間浸漬させた後、65 °Cで5分間解凍します。液体窒素への浸漬と65 °Cでの解凍をさらに2回繰り返します。最後の融解時間を10分に延長します。3回目の凍結融解サイクルの後、各チューブに200 µLの酢酸カリウムを加え、氷上で10分間静置します。その後、4 °Cで10,000 ×g、10分間遠心分離を行います。次に、ワイドボアピペットチップを用いて、上清を新しいチューブに移します。3 µLのRNase Aを加え、37 °Cで1時間インキュベートします。1時間のインキュベーション後、等量のクロロホルムを加えます。転倒混和して軽く振り混ぜた後、15,000 Gsで10分間遠心分離します。室温で、上清の最上層を新しいチューブに移します。クロロホルム抽出の手順を繰り返します。再度、上清の最上層を新しいチューブに移します。上清に等量の冷却したイソプロパノールを加え、氷上で30分間インキュベートします。DNAを沈殿させるため、最大速度で遠心分離を行い、DNAをペレット化させます。上清を捨て、各DNAペレットを1 mLの冷却した70% ethanolで洗浄します。70% ethanolによる洗浄を繰り返し、4°Cで最大速度にて10分間遠心分離します。上清を捨てます。再度70% ethanolで洗浄し、DNAペレットを10分間風乾させます。各DNAペレットを約25 µLのTEバッファーに再懸濁します。65 °Cで5分間加熱した後、1本のチューブにまとめ、TEバッファーで全量を500 µLに調整します。ポリエチレングリコールを加え、転倒混和で穏やかに混ぜた後、氷上で10分間インキュベートします。遠心分離してDNAをペレット化します。次に、冷却した70% ethanolでDNAを洗浄し、上清を除去して廃棄します。10分間風乾させた後、30～50 µLのTEまたは分子生物学グレードの水で再懸濁し、65 °Cで5分間温めます。DNAは-80°Cで保存してください。この表は、微生物高塩分マットから抽出したDNAの濃度および品質の測定結果を示しています。本プロトコルでは、マットサンプル1gあたり約2µgのDNAが得られ、A260/280比は1.6、A260/230比は0.7でした。A260/A280比は低いようでしたが、別の研究において、パルスフィールドゲル電気泳動を用いてDNAサイズを決定したところ、結果は35〜50 kb程度の高分子量DNA（HMW-DNA）を示し、16SリボソームRNA遺伝子のPCR増幅などの下流の分子生物学的アプリケーションに対する阻害は見られませんでした。ここで、レーンMはHMWマーカーであり、レーン1および2はEleuthra超塩類マットから抽出したメタゲノムDNAの繰り返し試料です。35 kb以上のDNAスミアを切り出し、精製することで、大型インサートベクターへのクローニングやその他の適切な分子生物学的アプリケーションに利用できます。この手順に従った後、解析対象となっている微生物コミュニティの機能的多様性はどのようなものであるかといった追加の疑問を解決するために、P-C-R-D-G-G-EクローニングやDNAシーケンシングなどの他の手法を実施することができます。

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Research

JoVE Journal

Biology

生物学

我々は、精製のための塩化セシウム密度勾配遠心分離に続いて0.22μmのSterivexフィルタ、集中プランクトンのバイオマスからの高分子量のゲノムDNAの抽出のための方法を説明します。...

0.22μmのSterivexフィルタおよび塩化セシウム密度勾配遠心分離からのDNA抽出

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このビデオでは、ホルマリン固定パラフィン包埋材料からのDNA抽出のためのプロトコルを示しています。これは、組織切片をキシレンで脱パラフィンされている複数の日手続き、エタノールで再水和とその後の遺伝子特異的またはゲノムワイドな解析のためにDNAを精製し、分離するプロテイナーゼKで処理です。...

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例として、嚢胞性線維症の気道を使用すると、原稿は、動物関連のサンプル中の微生物およびウイルスのコミュニティを特徴づけるためにメタゲノムとmetatranscriptomicアプローチの組み合わせを含む総合的なワークフローを提供します。...

複雑な動物に関連したサンプルからのシーケンシングメタゲノムとMetatranscriptomes：不純を精製する

ここで説明されているのは、長期のゲノムシーケンシングに使用するための、偏在する生物栄養性真菌病原体であるうどんこ病からのゲノムDNAの抽出、精製、および品質管理の方法です。...

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水生生物生息地からの炭化水素代謝特性を有する細菌種の単離・増殖・同定

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ここでは、低分子量の細胞外DNAの割合を高めることにより、環境中の抗菌薬耐性(AMR)を評価する簡単な手法を紹介します。20%-30%のPEGと1.2 M...

抗菌薬耐性の包括的評価のための廃水からの低分子量DNAの抽出の強化 

このプロトコルは、マイコバクテリアから高品質なDNAを抽出するためのCTAB法を説明し、硬く菌酸豊富な細胞壁による課題を克服します。このプロセスには、酵素による消化、CTABによる細胞溶解、有機抽出およびエタノール沈殿によるDNA精製が含まれます。この方法は分子研究に適したDNAを生成し、マイコバクテリア研究にも信頼性があります。...

セチルトリメチルアンモニウム・ブロマイド技術によるマイコバクテリウム種からの全ゲノムデオキシリボ核酸抽出

微生物群集の生物学 - インタビュー

学ぶ 高塩分バイオマットから高分子量DNAを抽出する改良プロトコル。細胞分離、凍融溶解、有機抽出を用いてDNA品質と濃度を向上させ、機能的メタゲノミクス研究に応用可能です。

バイオマットから高分子量DNAの抽出

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