Name: 細胞培養で誘導し、低酸素のテスト (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-08-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 1 s
Description: 学ぶ細胞培養における低酸素誘導法とHIF-1α発現評価法。コバルトクロリドと低酸素インキュベーターを用い、ウェスタンブロットとルミネッセンス検出で低酸素状態を解析する実験手法です。

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1。のCoCl 2ソリューションにより誘発される低酸素症塩化コバルト（II）六水和物（のCoCl 2•6H 2 O、MW = 237.9）は、低酸素誘導因子- 1.3 8の化学誘導物質です。この製品は、透明な、赤色溶液を得た、水（100 mg / ml）を可溶である。 <ol><li>滅菌DDの水に25mMのストック溶液を準備し、（使用直前に準備する） </li><li>低酸素症を誘発するために、通常の細胞培養培地中の100μMの最終濃度でのCoCl 2を使用してください。 </li><li>あなたの細胞へのCoCl 2を含む培地を加え、従来のインキュベーターで24時間のために文化をインキュベート（37℃、5％C0 2）。 </li></ol>上記の濃度は、我々がテストしたが、各細胞株の薬剤関連毒性を制限し、アッセイを最適化するために様々なインキュベーションの時間にだけでなく、種々の濃度（用量依存曲線を確立する）で試験されるべき細胞株に対して機能します。 2。モジュラーインキュベーターチャンバーに誘導される低酸素症<ol><li>少なくとも二つの同一の（ツイン文化）の培養細胞を準備します。細胞培養は、フラスコ、プレートまたは培養皿にすることができます。チャンバーを開くには、最初の部屋に取り付けられたチューブ（注入/低酸素ガスをパージするために使用されるチューブ）にある2つの白色プラスチック製のクランプを開き、ゆっくりとスチールリングクランプを開きます。 </li><li>クランプを離します。蓋とトレーが削除することができます。 </li><li>低酸素室での細胞培養を置きます。また、文化の十分な加湿を提供するために、チャンバー内に滅菌水を含むペトリ皿を置きます。 </li><li>コントロールとして正常酸素状態で"双子"細胞培養を置きます。 </li><li>あなたのトレイを固定し、動かないし、その蓋とチャンバーを閉じていることを確認してください。正しくチャンバーの気密閉鎖性を確保し、それを閉じるために鋼製リングクランプを配置します。 </li><li>低酸素症を作成するには、1％O 2ガスの混合物を含む"低酸素タンク"にチューブを取り付けます。あなたのタンクに接続されている流量計を持っていて、チャンバーは、直接（ガスタンク - 流量計 - 室）に接続されます。私たちは、レギュレータに内蔵された流量計を使用してください。 </li><li>それは大部分を削除しない場合はチャンバー内で、メディア内のすべての酸素の存在、7-10分間分あたり20リットルの流量でガスのタンクを開いて、チャンバーをフラッシュそうすることが重要です。その後すぐにオフにするガスの流れと完全に白のクランプの両方を閉じることにより、チャンバーを閉じてください。 </li><li>所望の期間については、従来のインキュベーターにチャンバーを戻す。 2時間とは、flush繰り返す - あなたが大規模な文化を使用する場合は、1の脱ガスへの文化の媒体ができます。 上記の手順は、コンストラクタの勧告"（ビラップス - ローゼンバーグ、株式会社）に基づいています。このガスのタンクが正しく、すべての時点で固定されていることを確認してください。 </li></ol>注意事項： <ul><li>それは1 - 3時間後にチャンバー一度の再ガスにアドバイスされているメディアに含まれるO 2を除去するために。 </li><li> 48時間より長いインキュベーション時間のためにそれはまた、再ガス室することをお勧めします。 </li><li> O 2の測定値は、セル/チャンバー内に含まれる許容酸素センサ（電極/マノメーター）室/細胞内O 2が含まれる）のより正確な測定を提供します。 </li><li>時間曲線を作るための様々な時間の長さでの培養細胞は、特定の細胞におけるHIF -1αの最適な時間の表現を決定するに役立つだろう。 </li></ul> 3。低酸素の評価<ol><li> ウェスタンブロットによるHIF - 1αの検出。 <ol><li>セクション2.2で説明されているようにチャンバー再度開いて、すぐに氷上に自分の文化を置きます。 </li><li>プレートの5％SDS溶液を用いて低酸素処理と非処理細胞を溶解するし、管に超音波処理、スピンダウン細胞の破片をセルlyzateを転送し、上清を収集する。 </li><li> BCAキットを用いて測定するのタンパク質濃度は、5分間95℃ローディング緩衝液と加熱° Cを追加することで、サンプルを準備する。 </li><li> 8％SDS -ポリアクリルアミドゲルとニトロセルロース膜への転送に関する電気泳動タンパク質。 </li><li> 1時間またはシェーカー上で4℃で一晩、室温で5％脱脂粉乳を含むPBSで細胞膜と0.1％Tween20をブロックする。 </li><li> 4で同緩衝液中の抗HIF -1α一次モノクローナル抗体（1 / 600）で一晩イムノ℃に</li><li> 45分間、PBS + 0.1％ツイーン20でHRP -二次抗体（1 / 2000）で5分、室温でTween 20を各時間インキュベートを0.1％含有するPBSで3回洗浄する。 </li><li> PBSで室温、5分/一度にTween20を0.1％で3回洗浄する。 </li><li>タンパク質バンドを表示するにはピアースECLキットとX線フィルムを使用</li></ol></li><li> 低酸素応答配列（HRE）。 HIF -1αは低酸素規制エレメント（HRE）と呼ばれる配列に結合することにより、多数の遺伝子（すなわちVEGF、EPO）を調節する。私は、マーカー遺伝子に関連するHREを使用してtは9 HIFの活性を検出することが可能である。この方法を使用するには、まず、あなたの細胞に適したトランスフェクション法を用いてHRE -ルシフェラーゼプラスミドを使用して細胞をトランスフェクトする必要があります。例えば、我々は、リポフェクトアミン2000を使用。細胞が低酸素症および正常酸素状態でインキュベートする前に、少なくとも4時間をトランスフェクションする必要があります。この時間は、この最初のステップは、低酸素の影響を受けないように、DNAが細胞に侵入することができます。ルシフェラーゼシグナルは、ルシフェラーゼアッセイキットを用いて検出される。 <ol><li>モジュラーチャンバーで低酸素状態でHRE -トランスフェクトした細胞をインキュベートするかのCoCl 2でインキュベートHRE -トランスフェクトされた細胞を使用して、正常酸素コントロールが含まれています。 </li><li>希望の潜伏期間の後、細胞から増殖培地を取り除く。 </li><li> PBSで細胞をリンス、PBSを除去。 </li><li>培養皿に400μl1X溶解試薬を分配し、付着細胞をこすり、その後、マイクロチューブに移す。 </li><li>短時間の遠心分離によってペレットの破片。 </li><li>細胞のミックス20μlのは、ルシフェラーゼアッセイ試薬100μlの上清ライセートとルミノメーターを使用して発光を測定する。 </li></ol></li></ol> 4。代表的な結果： K562細胞（ヒト白血病細胞株）で正常酸素と比較して低酸素下で培養した2日間、低酸素症は、ウェスタンブロット（図1）によって検出されたHIF -1αタンパク質の増加を誘発する。 低酸素状態で培養されたHRE - ルシフェラーゼ改変293細胞（胚性腎臓細胞株）、HIF -1αの活性の増加著しいの使用は、低酸素細胞（図2）で検出された。 <img src="/files/ftp_upload/2899/2899fig1.jpg" alt="図1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図1"> 図1：低酸素細胞でのHIF -1α増加 。 K562細胞は、48時間、正常酸素と低酸素（低酸素室）における文化だったとHIF -1αに特異的な抗体を用いたウエスタンブロットにより分析した。アクチンに特異的な抗体は、ローディングコントロールのために使用されていました。 <img src="/files/ftp_upload/2899/2899fig2.jpg" alt="図2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図2"> 図2：HIF -1αの活性 。 HRE -ルシフェラーゼ改変293細胞を48時間低酸素状態と酸素正常状態で培養し、ルシフェラーゼアッセイキットおよびルミノメーターを用いてルシフェラーゼシグナルを検出するために溶解させた。結果は相対発光ユニット（RLU）として表現さ​​れています。

<ol><li>Swinson, D. E., O'Byrne, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactions+between+hypoxia+and+epidermal+growth+factor+receptor+in+non-small-cell+lung+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Lung+Cancer%22%5BJournal%5D)">Interactions between hypoxia and epidermal growth factor receptor in non-small-cell lung cancer.</a> Clin Lung Cancer. 7, 250-256 (2006).</li>
<li>van Laarhoven, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia+in+relation+to+vasculature+and+proliferation+in+liver+metastases+in+patients+with+colorectal+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Radiat+Oncol+Biol+Phys%22%5BJournal%5D)">Hypoxia in relation to vasculature and proliferation in liver metastases in patients with colorectal cancer.</a> Int J Radiat Oncol Biol Phys. 64, 473-482 (2006).</li>
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<li>Semenza, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia-inducible+factor+1%3A+master+regulator+of+O2+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Genet+Dev%22%5BJournal%5D)">Hypoxia-inducible factor 1: master regulator of O2 homeostasis.</a> Curr Opin Genet Dev. 8, 588-594 (1998).</li>
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<li>Piret, J. P., Mottet, D., Raes, M., Michiels, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CoCl2%2C+a+chemical+inducer+of+hypoxia-inducible+factor-1%2C+and+hypoxia+reduce+apoptotic+cell+death+in+hepatoma+cell+line+HepG2%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+N+Y+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">CoCl2, a chemical inducer of hypoxia-inducible factor-1, and hypoxia reduce apoptotic cell death in hepatoma cell line HepG2.</a> Ann N Y Acad Sci. 973, 443-447 (2002).</li>
<li>Emerling, B. M., Weinberg, F., Liu, J. L., Mak, T. W., Chandel, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PTEN+regulates+p300-dependent+hypoxia-inducible+factor+1+transcriptional+activity+through+Forkhead+transcription+factor+3a+%28FOXO3a%29%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">PTEN regulates p300-dependent hypoxia-inducible factor 1 transcriptional activity through Forkhead transcription factor 3a (FOXO3a).</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 2622-2627 (2008).</li>
</ol>

利害の衝突は宣言されません。

低酸素条件下における細胞増殖と生存率は細胞の種類によって大きく異なります。したがって、細胞数またはあなたがあなたの実験のために十分な細胞/タンパク質を持っていることを確認するで始まる文化プレートの数を調整する必要があります。 塩化コバルトの方法は、安価で高速であるという利点を持っています。この製品はHIF-1/3α誘導することによって低酸素症模倣するだけでなく、他の遺伝子を調節することができる、この製品は他の効果はそれが独立して&quot;の特定の細胞の機能と表現型に与えることができるものをチェックして、プロジェクトに適応されていることを確認模倣 - 低酸素&quot;の効果。また、低酸素症を模倣するために使用される別の薬剤には、デフェロキサミンメシル酸（DFO、100μMの最終濃度で使用）です。これらの薬物の使用はexperimentatorは&quot;低酸素状態を&quot;影響を与えることなく、培養プレート/ディッシュ/フラスコを何回も開くことができます。 低酸素状態の値は組織や細胞の種類によって異なるとガスの混合物に含まれる酸素のレベルは、実験や細胞の種類によって異なる場合があります。実際、いくつかのセルは、O 2、他の必要性は1％未満O 2低酸素であることが5％に低酸素です。 5％CO 2培養のpHを安定させるためにガス混合物に添加され、ガスの残りの部分は通常、窒素です。 低酸素室は独立して酸素張力のセルの動作を交互にできる薬を使用しないという利点があります。酸素は、それぞれの開口部のチャンバーを再入力するため、低酸素症を軽減しかし、実験のすべての種類が行うことができます。あなたの実験ではこの要因を考慮する必要があります。低酸素/再酸素化は、いくつかの細胞型に影響を与えることができる特定の条件です。代わりに、低酸素ワークステーション（プレミックスガスのタンクにまたはガス混合システムに接続されている）や実験、メディアを変更し、連続的な低酸素環境下で細胞を操作するより規模が大きい低酸素インキュベーター（グローブボックスと低酸素処理チャンバ）を使用することです。様々な低酸素室は、過去10年間に実用化され、あなたの研究室では使用され、プロジェクト、スペース、大きさ、そして予算に応じて選択する必要があります。常に正確な培養条件を保証するために、チャンバーの有効利用と条件を確認してください。チャンバーを用いて、一般的に、低酸素のレベルは様々なガスのミックス（すなわち1％、5％10％酸素）を選択することで変調することができます。 HIF -1αの検出に関しては、それは正常酸素状態で、一部の癌細胞ラインエクスプレスはHIF -1αを知ることが重要です。したがって、これらの細胞株におけるHIFの基礎レベルを決定するために正常酸素コントロールを使用することが重要です。 HIF -1αは、細胞の刺激やストレスは、次の非悪性細胞では正常酸素状態で存在することができる。これらの細胞が飢餓状態にされている場合にも発生する可能性がある、あなたの細胞培養が適切に供給し、維持されていることを確認してください。

<table border="1"><tbody><tr><th>試薬の名前</th><th>会社</th><th>カタログ番号</th></tr><tr><td>抗HIF -1α </td><td>インビトロジェン</td><td> 458400 </td></tr><tr><td>塩化コバルト（II） </td><td>シグマ</td><td> C8661 - 25G </td></tr><tr><td>インキュベーター商工会議所</td><td>ビラップス - ローゼンバーグ</td><td> MIC - 101 </td></tr><tr><td> HRE -ルシフェラーゼプラスミド</td><td> Adgene </td><td>プラスミド26731 </td></tr></tbody></table>

細胞培養で誘導し、低酸素のテスト

Induction and Testing of Hypoxia in Cell Culture

低酸素症は臓器、組織、または細胞内の酸素の減少または欠如として定義されています。酸素張力のこの減少は、酸素の供給削減（原因は不十分な血管のネットワーク、欠陥のある血管、および貧血を含む）または電源（突然のより高い細胞増殖率に起因する）に対する相対的な酸素の消費の増加が原因である場合もあります。低酸素症は、そのような固形癌1-3、関節リウマチ、アテローム性動脈硬化症などのような生理学的または病理学することができます...それぞれの組織や細胞は、この新しい条件に適応するためのさまざまな能力を持っている。低酸素時には、低酸素誘導因子α（HIF）は安定化とそのような酸素4の血管新生や輸送に関与しているような種々の遺伝子を調節しています。この蛋白質の安定化は、したがって、HIFが日常的に低酸素症5月7日のスクリーニングに使用されている検出、低酸素症の特徴です。 この記事では、我々は哺乳動物細胞培養とこれらの細胞の低酸素状態を評価するための簡単​​なテストでは低酸素を誘導するために2つの単純なメソッドを提案する。

ここでは、細胞培養や文化の低酸素状態を評価するための簡単​​なテストでは低酸素を誘導するための簡単​​な方法を提案する。

低酸素症とは、臓器、組織、または細胞における酸素の減少または欠乏と定義されます。この酸素分圧の低下は、...への供給不足に起因する可能性があります。

この手順の全体的な目的は、細胞培養において低酸素状態を誘導することです。これは、まず細胞を低酸素インキュベーターまたは特殊な混合ガスを満たしたチャンバー内で培養し、誘導性低酸素因子1の化学的誘導剤を添加することで達成されます。次に、タンパク質細胞抽出液中のHIF-1αの発現レベルを確認するか、またはHIF-1α結合配列をコードするベクターENCを用いてその活性を測定することにより、低酸素状態を検出します。最終的に、ウェスタンブロッティングおよびルミネッセンス検出により、HIF one alphaの発現レベルと活性の上昇を示す結果を得ることができます。私はDanny Uで、Patrizia Indaの研究室のポスドクです。本日は、塩化コバルトを用いて低酸素状態を誘導する手順について実演します。まず、滅菌した二回蒸留水を用いて、25 millimolarの塩化コバルトストック溶液を調製します。この溶液を細胞に加え、最終濃度が100 µMになるように培養します。低酸素状態を誘導するため、細胞を37 °C、5% CO2条件下で24時間インキュベートします。モジュラーインキュベーターチャンバーを使用して、少なくとも2つの同一の細胞培養を準備します。ただし、各条件について3連（トリプリケート）で準備することが推奨されます。まず、チャンバーに取り付けられたチューブにある2つの白いプラスチッククランプを開いてモジュラーインキュベーターチャンバーを開き、蓋とトレイを取り出します。細胞培養物を低酸素チャンバー内に配置します。この際、培養物に十分な加湿を行うため、滅菌水を入れたペトリ皿をチャンバー内に一緒に配置してください。対照群として、もう一方の細胞培養物を常酸素状態に置きます。チューブを1%酸素ガス混合物が入った低酸素タンクに接続します。タンクに流量計が接続されている場合は、チャンバーをそれに直接接続します。本手法では、レギュレーターに組み込まれた流量計を使用して、チャンバー内および培地内のすべての酸素を除去します。ガスボンベを開き、20 liters per minuteの流量で4〜7分間チャンバー内をフラッシュしてください。その後、速やかにガスフローを停止し、2つの白いクランプを締めてチャンバーを完全に密閉します。チャンバーを通常のインキュベーターに戻し、所定の時間放置します。大容量の培養液を使用する場合は、培地と培養細胞を1〜2時間 DGA し、その後、フラッシュを繰り返して低酸素状態を評価します。ウェスタンブロットによる HIF-1α 検出を用い、先に示した方法でチャンバーを開封し、直ちに培養細胞を氷上に置きます。低酸素処理した細胞および未処理の細胞を 5% SDS溶液で溶解します。次に、溶解物をチューブに移して超音波処理によりタンパク質を抽出し、遠心分離で細胞残渣を除去して上清を回収します。続いて、BCAキットを用いてタンパク質濃度を測定します。その後、ローディングバッファーを添加し、95 °Cで5分間加熱してゲル試料を調製します。8% SDSポリアクリルアミドゲルでタンパク質を分離し、ニトロセルロース膜に転写します。5%脱脂粉乳および0.1% Tween 20を含むPBSで、室温で1時間、またはシェーカーを用いて4°Cで一晩、膜をブロッキングします。同一のバッファー中、anti HIF-1α一次モノクローナル抗体を用いて、ブロットを4°Cで一晩インキュベートします。翌日。室温で0.1%tween 20を含むPBSで5分間ずつ3回ブロットを洗浄し、次にPBSに0.1%tween 20を加えた溶液中でHRP二次抗体とともに45分間インキュベートします。室温で0.1%tween 20を含むPBSで5分間ずつ3回洗浄します。次に、膜を化学発光検出溶液中でインキュベートし、X線フィルムで露光してルシフェラーゼ活性を測定します。培養細胞から増殖培地を除去します。細胞をPBSで洗浄します。次に、1x ライシス試薬を 400 µL 培養皿に加えます。付着した細胞をスクレイパーで回収し、マイクロチューブに移します。短時間の遠心分離により、残渣をペレット化します。20 µLの細胞溶解液上清を100 µLのルシフェラーゼアッセイ試薬と混合し、ルミノメーターを用いて発光を測定します。K 5 62細胞を常酸素または低酸素条件下で48時間培養し、H one alpha特異的抗体を用いてウェスタンブロットで解析しました。ローディングコントロールにはbeta actin特異的抗体を使用しました。結果は、低酸素細胞においてHIF-1αが増加することを示しています。HREルシフェラーゼ改変293細胞を低酸素または正常酸素条件下で48時間培養し、その後、ルシフェラーゼアッセイキットとルミノメーターを用いてルシフェラーゼ信号を検出しました。低酸素細胞では、HIF-1αの活性の上昇も検出されました。結果は相対発光量として表されます。高圧ガスを取り扱う際は極めて危険であるため、本手順の実施時には、酸素ボンベを壁やベンチに適切に固定すること、酸素ボンベの開閉を正しく行うこと、および圧力を制御することなどの予防措置を必ず講じてください。

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